我国各生态型鼠疫菌外膜蛋白的比较研究

目的 研究我国l7个生态型鼠疫菌的外膜蛋白谱型，为鼠疫菌分子生物学分型提供科学依据。方法 用终浓度为10g/L的氯霉素28℃下杀死鼠疫菌后，采用Trion—200改进法进行外膜蛋白的提取。以4％积层胶、12％分离胶行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS—PAGE)电泳。根据低分子量标准蛋白和被试菌株的泳距作相关分析，得出各条蛋白带的相对分子量。结果 SDS—PAGE上各生态型鼠疫菌28℃培养物表达的外膜蛋白带在相对分子量大于40kD小于30kD的区域谱型基本一致，而在30-40kD之间稍有差异，岗底斯山型的部分菌株较141株多一条31．6kD带，锡林郭勒型菌株缺失32kD条带。结论 鼠疫菌的外膜蛋白，作为鼠疫菌种下的分类仅对田鼠型菌株意义较大。     

鼠疫菌外膜蛋白单克隆抗体制备及初步应用

应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，蛋白免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）、单克隆抗体（ＭｃＡｂ）等技术，对鼠疫菌外膜蛋白（ＯＭＰ）组成成分及免疫学特性进行了研究、在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱上，鼠疫菌锡林郭勒高原型较其他型强、弱毒菌少一条亚基分子量为３２ＫＤ的蛋白带。以ＥＶ７６ｐ、ＥＶ苗的ＯＭＰ为免疫原，所获抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，认为ＯＭＰ具有良好的免疫原性及免疫反应性。采用杂交瘤技术，得到七株抗鼠疫菌的ＭｃＡｂ。四株为ＩｇＧ，三株为ＩｇＭ。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定。四株ＭｃＡｂ抗ＯＭＰ的分子量，４Ｇ５株为２１０ＫＤ，３Ｂ９、ＩＤ１０株为４０ＫＤ，２Ｃ６株为１０ＫＤ。以七株ＭＣＡｂ对鼠疫菌强、弱毒株３２株作全菌体ＥＬＩＳＡ进行鼠疫菌分型的初步研究发现，３Ｂ９株ＭｃＡｂ与２４株强毒菌发生阳性反应，而不与弱毒菌反应；１Ｄ１０株与锡型及弱毒菌不发生反应，与其它强毒菌发生阳性反应。     

鼠疫菌外膜蛋白单克降抗体制备及初步应用

应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，蛋白免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ），单克隆抗体（ＭｃＡｂ）等技术，对鼠疫菌外膜蛋白（ＯＭＰ）组成成分及免疫学特性进行了研究。在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱上，鼠疫菌锡林郭勒高原型较其他型强，弱毒菌少一条亚基分子量为３２ＫＤ的蛋白带。以ＥＶ７６Ｐ，ＥＶ苗的ＯＭＰ为免疫原，所获抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，认为ＯＭＰ具有良好的免疫原性及免疫反应性。采用杂交瘤技术，得到七株抗鼠     

鼠疫菌6MD质粒对假结核菌外膜蛋白的影响

检查了来自鼠疫耶尔森氏菌 Y·pestis 的6MD 质粒转入假结核耶尔森氏菌 Y·(?)berculosis 后,对后者表达的耶氏菌属外膜蛋白(Yops)的影响。研究表明,6MD 质粒所编码的 pla 基因产物可以降解这些外膜蛋白,同时,也能降解假结核菌的 YadA 蛋白,使它转变为几种分子量略小的蛋 质亚单位或片断。本文还讨论了这种现象对鼠疫菌和假结核菌毒力的影响。     

中国鼠疫菌外膜蛋白种类的研究

目的：研究并分析中国各生态型鼠疫菌外膜蛋白种类及分子量。方法：鼠疫菌经破碎后采取超高速离心法提取外膜蛋白，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE、)电泳系统分离鼠疫菌外膜蛋白。结果：在10％的SDS-PAGE上我国各生态型鼠疫菌37℃条件下的培养物所表达的外膜蛋白最多为26条蛋白带，而28℃培养物表达的外膜蛋白最多的则有36条蛋白带。结论：中国各生态型鼠疫菌外膜蛋白种类存在一定的差异，青海田鼠型菌株所产生的外膜蛋白与布氏田鼠型菌株相同。     

我国鼠疫菌pYC质粒PCR检测分析

目的分析全国其他类型鼠疫菌是否存在pYC质粒。方法设计yd1和yd2两对引物通过PCR 进行检查。结果共检查全国11块疫源地18个生态型鼠疫菌802份DNA,其中云南6份、广西5份、贵州6 份扩增阳性,云南另外的163份和全国其他菌株扩增结果均为阴性。结论 yd1和yd2基因仅存在于贵州、广西的菌株和云南的部分菌株中,可作为具有pYC质粒鼠疫菌的PCR诊断和标识基因;全国其他类型鼠疫菌无 6×103(pYC)新质粒。     

中国鼠疫菌含有的最大—一类质粒的变异及地理分布

绝大多数鼠疫耶尔森菌都含有三种质粒,其分子量为6Mdal、45Mdal 和 65Mdal。鼠疫耶尔森菌含有的最大一类质粒的变异很大。多数学者报道鼠疫耶尔森菌所含大质粒的分子量为65Mdal;苏联学者(1983年)报道了苏联鼠疫自然疫源地的     

中国鼠疫耶尔森菌染色体结构特征的研究

目的 了解中国鼠疫耶尔森菌不同分离株之间的染色体结构差异,探索染色体重排在鼠疫菌中发生的原因及用于菌株遗传特征识别和亲缘关系分析的可能性.方法 以完成全基因组测序的首株鼠疫菌株CO92(美国)为参考株,以从中国分离出的已完成全基因组测序的4株鼠疫菌株(内蒙古91001、云南剑川D182038、云南玉龙D106004、西藏那曲Z176003)为对比株,根据美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)上公布的这5株鼠疫菌的染色体序列及染色体上所有编码基因序列间的相似性,将鼠疫菌染色体人为的划分成多个大的DNA节段(染色体板块),确定这些板块在不同鼠疫菌株间排列方式的差异以及板块之间的断裂区片段的基因组成;根据菌株两两比较所得的重排差异结果,分析菌株间的亲缘关系.结果 除Z176003菌株外,CO92、D182038、D106004、91001菌株可被分成44个相对独立的染色体板块,板块内部基因组成和排列高度稳定,板块之间可以相对移动.与参考株CO92菌株比较,D182038、D106004菌株染色体均存在13处重排,Z176003菌株染色体存在14处重排,91001菌株染色体存在37处板块排列顺序的改变.菌株间两两比较,D106004与Z176003菌株之间仅有8处染色体板块排列方式不同,表明二者的亲缘关系最为接近.CO92菌株染色体上的相邻板块之间存在43个断裂区,有39个断裂区的DNA片段含有插入序列,其中25个插入序列为IS100.结论 鼠疫菌基因组具有一定的流动性,不同菌株间的染色体结构存在较大差异,染色体重排事件发生的原因与其拥有的插入序列密切相关.菌株间染色体的重排差异,能用于菌株遗传特征的识别和亲缘远近关系的分析.     

鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株体外生物学特性和对小鼠致病性分析

目的 探索caf1基因缺失对鼠疫耶尔森菌体外生物学特性与对小鼠致病性的影响。方法 利用CRISPR/Cas12a介导的基因编辑技术构建鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株,并通过PCR技术对caf1基因缺失验证。比较鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株和野生株201在生长速率、液体培养状态、聚集情况等体外生物学特性和对小鼠致病性等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,caf1基因缺失株构建成功。体外生物学特征分析表明,与野生株相比,caf1基因缺失株的形态学和生长速率并未发生明显变化,自凝聚率升高。肺递送途径LD₅₀分析表明,caf1的缺失导致鼠疫耶尔森菌气溶胶感染小鼠半数致死剂量显著降低。结论 不同途径感染结果表明,caf1基因缺失株相较于野生株,在肺递送、滴鼻、皮下、尾静脉注射4种途径下对BALB/c小鼠的毒力均降低。caf1基因的缺失导致鼠疫耶尔森菌自凝聚率升高,对BALB/c小鼠致病性下降。     

广西鼠疫耶尔森菌质粒图谱及分子流行病学意义

目的分析广西鼠疫耶尔森菌株质粒DNA种类,从分子水平探讨其流行病学意义。方法采用Kado改良法提取质粒,经琼脂糖凝胶电泳。结果从广西鼠疫自然疫源地分离到31株鼠疫耶尔森菌含有pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT1和尚未明确其类型的111.36×106(相对分子质量,Mr)5种质粒。其中有29株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT14种质粒组成,1株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、111.36×106(Mr)4种质粒组成,另一株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD13种质粒组成。结论广西鼠疫耶尔森菌株含有pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT1和尚未定型的111.36×106(Mr)5种质粒,与云南省南部、东南部和贵州省鼠疫耶尔森菌株的质粒图谱相同。     

南方鼠疫菌对18种抗菌素的敏感性试验

目的 通过鼠疫菌对新型抗菌药物的敏感性实验,寻找比链霉素敏感性更高且毒性小的药物.方法 选用22株鼠疫菌对18种活性较高的抗菌素进行了纸片法药物敏感性试验.结果 头孢菌素类、青霉素类和喹诺酮类等多种药物对鼠疫菌的敏感性较链霉素好.结论 本试验结果可为鼠疫临床治疗选择新药提供参考资料.     

胶体金免疫层析法诊断鼠疫的特异性试验

目的研究胶体金免疫层析法用于鼠疫快速诊断的特异性。方法采用胶体金免疫层析测试条和鼠疫反向间接血凝试验(RIHA)平行检测。结果检测鼠疫菌F1抗原具有很强的特异性,不与包括小肠结肠炎和假结核耶尔森等其他细菌发生交叉免疫反应。结论该方法简便、快速、敏感,适合现场鼠疫监测。     

我国鼠疫菌抗链霉素基因的监测

目的了解全国鼠疫菌分离株是否存在抗链霉素基因。方法根据Guiyoule等人在EMBL公布的抗链霉素相关基因,设计2对引物,对271株代表性鼠疫菌进行PCR扩增。结果实验用271株代表性菌株中尚未发现有鼠疫菌抗链霉素基因。结论目前在所实验的271株菌株还未发现鼠疫菌耐链霉素菌株。     

我国鼠疫耶尔森菌毒力特征研究

目的 研究我国各疫源地分离的鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)毒力特征.方法 以1943-2012年我国11块鼠疫自然疫源地不同时间、地区、宿主、媒介体内分离的894株鼠疫菌作为研究对象.将每株菌的37℃24h培养物用灭菌生理盐水制成菌悬液,比浊后稀释为2×101、2×102、2×103、2× 104、2×l05、2× 106、2×107、2×108、2×109个/ml,分别取0.5 ml皮下注射于小白鼠鼠鼷部,每组5只动物,分笼饲养观察14 d,动物死亡后取淋巴、肝、脾、肺、心组织进行细菌培养,以分离出鼠疫菌为特异性死亡,并计算半数致死量(LD50).结果 894株代表性菌株中,87.36％(781/894)属于强毒菌,4.36％(39/894)为中等毒力株,8.28％(74/894)为弱毒菌;对不同生态型鼠疫菌株进行毒力比较,青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的青藏高原型、祁连山型鼠疫菌绝大多数属于鼠疫强毒株,分别占94.42％(457/484)、93.10％(27/29).结论 我国各鼠疫自然疫源地鼠疫菌的毒力特征以鼠疫强毒株为主.     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。