丙型肝炎病毒非结构蛋白质5A激活Survivin基因的表达

目的探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白质5A(HCV NS5A)对Survivin基因表达的影响。方法用含HCV NS5A基因的表达质粒(pCNS5A)转染HepG2细胞,采用免疫细胞化学技术检测HCV NS5A蛋白质的表达,采用逆转录聚合酶链反应和Western blot方法观察HCV NS5A对Survivin mRNA和蛋白质表达水平的影响。结果转染pCNS5A 的HepG2细胞胞浆可见HCV NS5A蛋白质的表达。转染pCNS5A的HepG2细胞内Survivin mRNA和蛋白质表达均比转染空白载体(pRc/CMV)的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2细胞明显增强,而后两者Survivin mRNA和蛋白质表达相似。结论HCV NS5A可激活Survivin蛋白质表达,其途径可能通过调节Survivin基因的转录水平(mRNA转录增强)来实现。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的研究进展

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的非甲-非乙型肝炎,是慢性肝病的主要原因之一.HCV编码至少10种成熟蛋白,而非结构蛋白5A(NS5A)是其重要蛋白之一.磷酸化的NS5A与病毒的复制密切相关,参与病毒的产生和释放,并且能够通过病毒和宿主细胞的相互作用,干扰细胞内重要信号通路,影响细胞周期和免疫系统,最终促使HCV相关慢性肝病的发生与发展.本文就NS5A的生物学功能及其作用机制的研究进展作一综述.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因4的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4的基因序列的确立及基因克隆化研究。方法 依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，利用生物信息学技术获得新基因NS5ATP4的编码序列，对其可能的氨基酸序列进行分析比较，并对其基因利用多聚酶链反应技术(PCR)进行克隆化研究。结果 发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4。结论 这一发现，为阐明HCVV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因，研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术，以HCV NS5A表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列数据库的搜索和比对，进行电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，命名为NS5ATP9，在GenBank中注册，注册号为AF529370。结果 Ns5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt)，编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成，并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆，为进一步研究HcvNs5A反式激活作用的分子生物学机制开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）相互作用蛋白的基因，明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3，将聚合酶链反应法扩增的HCV NS4A基因连接入酵母表达载体PGBKT7中构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人肝cDNA文库质粒PACT2的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基和X—α-半乳糖上进行双重筛选阳性菌落，提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB平板上，选择生长菌落，提取质粒酶切鉴定，测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCV NS4A基因，构建表达载体并在酵母细胞中表达，与肝文库配合后选出既能在四缺培养基又能在铺有X—α-半乳糖的四缺培养基上生长，并变成蓝色的真阳性菌落22个，序列分析显示，筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞能量代谢、蛋白翻译合成等多种生物学过程。结论成功克隆出HCV NS4A蛋白在肝细胞内的结合蛋白，为进一步研究NS4A蛋白的功能、阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A基因酵母表达载体的构建及表达

丙型肝炎病毒（HCV）是一种单股正链RNA病毒，在HCV丝氨酸蛋白酶和宿主细胞信号肽酶的联合作用下，裂解成为10余种结构和非结构蛋白。其中，HCV NS4A蛋白作为一种非结构蛋白形式，是NS3丝氨酸蛋白酶裂解活性的辅因子，并参与NSSA蛋白磷酸化修饰和免疫应答的调节。为了进一步研究NS4A蛋白在肝细胞内的功能，我们在酵母细胞中表达了NS4A蛋白。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.     

丙型肝炎病毒非结构基因5A反式激活基因4A结合蛋白基因的筛选

目的 筛选并克隆HCV非结构基因NS5A反式激活基因4剪切体NS5ATP4A的结合蛋白基因,为研究NS5ATP4A的生物学功能提供线索. 方法 构建HCV NS5ATP4A蛋白诱饵酵母质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选.选择既能在4重营养缺陷培养基(SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His)上生长,又能在涂有X-α-半乳糖的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌后进行测序,并进行生物信息学分析.结果 筛选出7个基因,其中已知功能基因6个,未知功能基因1个,这些基因与RNA合成、蛋白质翻译、细胞周期及肿瘤免疫有关. 结论 HCV NS5ATP4A结合蛋白基因的成功筛选,提示了HCV NS5ATP4A新的信号转导途径,为HCV致病机制的进一步研究提供了依据.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活研究进展

丙型肝炎病毒非结构区3（HCVNS3）基因位于HCV基因组非结构区3420—5312核苷酸区段。HCVNS3具有多种潜在生物学功能,如蛋白酶、解旋酶活性,介导细胞免疫反应、反式激活端粒酶、调节p53活性及参与蛋白激酶A和STAT信号转导等,从而影响宿主细胞功能,导致细胞增生、凋亡,甚至癌变。对于NS3蛋白反式激活作用研究,可为进一步研究HCV致病（癌）的分子生物学机制和探索新的丙型肝炎治疗技术提供帮助。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因NS5ATP13的克隆化研究

目的 应用微矩阵(microauray)技术，结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因，阐明授性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌(HCC)的等相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVKDA反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苔酸序列分析证实正确无误。以PcDMA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总MA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5ATP13，在GenBank中登录，登录号为D21262。Ns5ATP13基因的编码序列全长为2103个核苷酸(nt)，编码产物由700个氨基酸残基(aa)组成。结论 丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反式激活作用。微短阵技术是分析基因表达谱变化的自动化和高通量技术。应用这些技术，发现了HCVKDA反式激活作用的新的靶基因，将为进一步研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制及HCV相关疾病发病机制奠定基础。     

丙型肝炎病毒NS5A在肝癌细胞对TLR4表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白质5A（HCV NS5A）对Toll样受体4（TLR4）表达的影响。方法用含HCV NS5A基因的表达质粒pcNS5A瞬时转染QSG7701细胞,采用免疫细胞化学技术检测HCV NS5A及TLR4蛋白质的表达;采用逆转录聚合酶链反应观察HCV NS5A和TLR4的mRNA表达。结果转染pcNS5A质粒细胞内有HCV NS5A蛋白的表达。转染pcNS5A组TLR4 mRNA及蛋白质表达均较转染pRc/CMV和未转染质粒组明显增强,而后两组细胞TLR4 mRNA和蛋白质表达相似。结论 HCV NS5A可上调TLR4 mRNA和蛋白的表达。     

丙型肝炎病毒NS3基因酵母表达载体构建及表达

目的　为探讨丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3的功能 ,在真核生物酵母细胞中表达HCVNS3基因。方法　用聚合酶链反应 (PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV 1为模板扩增HCVNS3基因 ,克隆到 pGEM T载体中 ,双酶切后回收连接到酵母表达质粒 pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析。结果　成功构建HCVNS3基因酵母表达载体 ,Western免疫印迹显示了HCVNS3在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在 ,相对分子质量为 70 0 0 0。结论　HCVNS3蛋白在酵母中表达成功。     

Cloning of the non-structural gene 3 of hepatitis C virus and its inducible expression in cultured cells

ＭＥＴＨＯＤＳＴｈｅｎｓ３ｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｐｌａｓｍｉｄｐＢｎｓ３ｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｐＧＥＭＴ．Ｔｈｅｎ,ｔｈｅｎｓ３ｗａｓｓｕｂｃ...     

HBeAg gene expression with baculovirus vector in silk worm cells

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＭｉｙａｎｏｈａｒａｅｔａｌ［１］ｆｉｒｓｔｏｂｔａｉｎｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｒｅｓｉｏｎｏｆＨＢｅＡｇａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇａｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ;ｌａｔｅｒｒｅｓ...     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A影响p53抑制肝癌细胞甲胎蛋白表达的分子机制

目的了解丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对p53抑制甲胎蛋白(AFP)基因表达的影响及分子机制。方法采用质粒转染技术及微粒体酶免疫法观察p53蛋白对Huh7肝癌细胞AFP表达的抑制作用及HCV NS5A对其抑制作用的影响;蛋白印迹实验观察HCV NS5A对p53蛋白表达的影响;谷胱甘肽转移酶沉淀实验鉴定HCV NS5A与p53蛋白能否相互作用形成复合物。结果转染pRc/CMV空质粒的Huh7细胞上清液AFP浓度为(14 322±2412)ng/ml,转染pCNS5A质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(13 843±3218)ng/ml,两组问t=1.42,P>0.05;转染pC53-NS3质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(10 241±1326)ng/ml,与上述两组比较,t值分别为2.41及2.38,P值均<0.05;pCNS5A和pC53- NS3共转染者AFP浓度为(14 582±1238)ng/ml,与pC53-NS3单独转染组比较,t=3.12,P<0.01; pCNS5A和pC53-NS3共转染者和pC53-NS3单独转染者Huh7细胞p53蛋白表达无变化。在谷胱甘肽转移酶沉淀实验中,加入谷胱甘肽-p53融合蛋白后出现HCV NS5A蛋白条带,而仅加入谷光甘肽者则未出现此条带。结论p53蛋白能抑制Huh7细胞AFP的表达,HCV NS5A能减轻p53蛋白对AFP表达的抑制作用。HCV NS5A不影响p53蛋白的表达但能与p53蛋白结合形成复合物是使p53功能失活的分子机制。     

丙型肝炎病毒核心基因免疫研究

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫用于预防和治疗ＨＣＶ感染的可行性和有效性．方法将ＨＣＶＣ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游，在证实其可以在小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０（Ｈ２ｄ）中表达之后，将重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）小鼠股四头肌，ＥＬＩＳＡ检测血清中抗体产生水平；３ＨＴｄＲ掺入法测定免疫小鼠淋巴细胞ＨＣＶＣ抗原特异性增殖能力，４ｈ５１Ｃｒ释放法检测免疫小鼠细胞毒Ｔ细胞（ＣＴＬｓ）体外杀伤功能．结果免疫小鼠２０只，初次免疫２ｗｋ后，血清中均出现了ＨＣＶＣ抗体，且增加免疫剂量可提高抗体滴度；淋巴细胞增殖指数为６１０，明显高于对照组（Ｐ＜００１），ＣＴＬｓ体外特异性杀伤率为６３１％，也高于对照组（Ｐ＜００１）．结论ＨＣＶＣ基因免疫不仅可以诱导机体产生特异性的体液免疫，而且产生特异性的细胞免疫，它可能是防治ＨＣＶ的有效方法．     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M．tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MTBrv3873基因,并克隆入pGEM～TEasy质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5a和BL21（DE3）菌后,经0．4mmol／L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,pET30a（＋）：rv3873表达出相对分子质量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％,Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873,并获得重组Rv3873蛋白,为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。