人mdr1全长cDNA的克隆和pc-MDR1质粒的构建

目的　从耐药肿瘤组织中进行mdr1cDNA的全长克隆和pc MDR1重组质粒的构建。并转染HepG2细胞 ,快速诱导其耐药 ,并筛选其抗性克隆。 方法　设计单酶切位点引物 ,利用长距离逆转录 聚合酶链反应 (LongRT PCR )技术 ,从HepG2耐药细胞扩增mdr1cDNA ,约 3 .8kb大小。将其插入至真核表达载体 pcDNA3 .0质粒中构建 pc MDR1诱导质粒 ,使其能够在真核细胞中表达P 糖蛋白 (P gp)。转染HepG2细胞 ,并用G418筛选出转染的细胞。结果　成功地扩增出3 .8kb左右的mdr1cDNA片段 ,经酶切鉴定、RT PCR扩增特异片段和序列测序结果显示质粒构建初步成功 ,用G418筛选细胞耐药抗性克隆的时间约为 14d。结论　从耐药肿瘤组织中进行mdr1cDNA全克隆和pc MDR1诱导质粒构建的成功为快速诱导细胞耐药和进一步研究肿瘤细胞的耐药机制奠定了基础。     

人FasL全长cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆人FasL全长cDNA并构建其真核表达载体。方法：采用RT-PCR法从健康人外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的FasI。全长cDNA，将之与pGEM-T：Easy质粒连接、测序。构建pcDNA3．1-FasL真核表达载体，用脂质体介导方法转染人直肠癌8348细胞，检测FasL表达情况。结果：RT-PCR扩增的FasL产物经限制性内切酶酶切后生成的片段符合预期大小。克隆测序证实所得的FasL cDNA序列与Gene Bank序列完全一致。pcDNA3．1-FasL重组质粒经：EcoRI XhoI双酶切后，电泳显示898bp目的片段和pcDNA3．1载体片段，证明重组质粒正确。转染直肠癌8348细胞后。用RT-PCR方法检测FasL表达阳性。结论：采用RT-PCR方法成功克隆了人FasL全长cDNA并构建了其真核表达载体．为进一步研究FasL功能奠定了基础。     

多药耐药真核表达载体的构建及其在人肝癌细胞HepG2中表达

目的构建携带多药耐药mdr1全长基因的真核表达载体并研究其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法双酶切质粒pHaMDR1，获取含mdr1全长cDNA片断，将此片段定向克隆到真核表达载体PCI-neo多克隆位点。经脂质体法转染HepG2细胞。G418筛选稳定的细胞系HepG2／mdr1，PCR检测mdr1特异片段，RT-PCR检测HepG2／mdr1细胞mdr1mRNA表达。流式细胞仪检测HepG2／mdr1细胞P-gp的含量。结果成功构建携带mdr1全长基因的真核表达载体，并在HepG2细胞中表达，形成稳定的细胞系HepG2／mdr1。其mdr1mRNA及P-gp的含量较未转染该载体的HepG2细胞显著增加。结论用真核表达载体将mdr1全长基因导人人肝癌细胞HepG2能够建立高效、稳定的多药耐药细胞系，为进一步研究多药耐药机理提供理想的细胞模型。     

多药耐药真核表达载体的构建及其生物学特性

目的 构建携带多药耐药相关蛋白（MRP）全长基因的真核表达载体，并研究其在人肝癌细胞株HepG2中的表达特性。方法 双酶切克隆质粒pGEM-mrp1，获得含mrp1全长的cDNA片段，再将此片段定向克隆到哺乳动物真核表达载体pCI-neo的多克隆位点，经脂质体法转染HepG2细胞，G418筛选获得稳定表达的转基因细胞系HepG2／mrp1。RT—PCR检测HepG2／mrp1细胞mrp1 mRNA表达，流式细胞仪检测HepG2／mrp1细胞MRP的含量。结果 本实验所构建的携带mrp1全长基因的表达载体pCI-mrp1能在HepG2细胞中表达，形成稳定的多药耐药细胞系HepG2／mrp1，其多药耐药性、MRP含量及mrp1mRNA表达均较未转染该载体的HepG2细胞显著增加。结论 将携带全长人多药耐药相关蛋白基因mrp1的载体导人人肝癌细胞株能够建立高效、稳定的多药耐药细胞株，为进一步研究多药耐药的机理及逆转多药耐药提供理想的细胞模型。     

利用Tet-on调控系统建立人肝癌HepG2Tet-on细胞系

目的 构建可以用强力霉素调控表达的人肝癌HepG2Tet-on细胞系,为进一步研究肝癌相关基因功能奠定基础.方法 用脂质体转染法将pWHE146质粒转染到人肝癌HepG2细胞中,用G418筛选出稳定表达细胞克隆;单克隆分别扩增后,瞬时转染pTRE-hyg-luc质粒;强力霉素诱导表达后,检测荧光素酶表达活性,挑选出受强力霉素调控的低背景、高表达的HepG2Tet-on细胞株.结果 成功构建了一株受强力霉素调控的高表达低背景的HepG2Tet-on细胞株(诱导倍数达154.106倍).结论 HepG2Tet-on细胞株可用于外源基因的真核调控高表达,为研究真核基因功能提供一种可靠的细胞株.     

人骨形态发生蛋白—2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2）真核表达载体,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切含有hBMP－2全长cDNA的pUC19,回收1.24kb片段,将其连入真核表达载体pcDNA3,构建重组子pcDNA3-hBMP-2。将重组子转化细菌,扩增后提取质粒,分别用Ecor Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切和Xho Ⅰ单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞,G418筛选形成阳性克隆后继续培养4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示：用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后可形成两条带,大小分别为1.3kb和5.38kb,而Xbo Ⅰ酶切位点消失,符合物理图谱,表明载体构建成功,转染后G418筛选所获阳性克隆,继续培养4周,的位杂交和免疫组织化学染色,结果表明hBMP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。结论 成功构建hBMP-2真核表达载体,该载体可在真核细胞内表达,为将来骨损伤的基因治疗奠定了一定的实验基础。     

受强力霉素调控表达的人肝癌HepG2细胞系的建立

目的建立受强力霉素 (doxycycline)调控表达的人肝癌HepG2细胞系。 方法用阳离子脂质体lipofectamine 2 0 0 0 0将pTet on质粒转染人肝癌HepG2细胞 ,通过G4 18筛选得到稳定转染的抗性克隆 ;将抗性克隆细胞分别培养扩增 ,通过 pTRE luc质粒瞬时转染 ,加入终浓度为 1μg/ml的doxycycline诱导剂培养 4 8h后 ,逐一检测每个细胞株的荧光素酶表达活性。 结果第 6号克隆的细胞诱导后荧光素酶的表达活性为 16 76 4 ,而非诱导状态下该细胞株的背景活性为 87,诱导后的活性增加 192倍。结论HepG2 /Tet on细胞株是可调控基因表达的人肝癌细胞株 ,为研究肝癌的发病和基因治疗提供了较为理想的研究工具。     

稳定表达线粒体融合素基因2肝癌细胞株的建立及其意义

目的探讨将线粒体融合素基因2（mfn2）转染培养人肝癌细胞株HepG2，建立长期表达mfn2的肝癌细胞模型的可行性。方法基因重组构建mfn2真核表达质粒pEGFPnffn2，用脂质体将质粒转染培养人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应检测转染后30d细胞mfn2 mRNA的表达水平；Western—blot检测线粒体融合蛋白的表达。结果（1）成功构建表达真核质粒pEGFPmfn2；（2）成功将质粒pEGFPmfn2转染肝癌细胞株HepG2，并获得阳性细胞克隆；（3）经脂质体转染的人肝癌细胞株HepG2可较稳定表达mfn2。结论成功地建立稳定表达mfn2的肝癌细胞株，为进一步研究mfn2在肝癌发生发展中的作用奠定了基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达

目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE）基因的真核表达载体，为修复阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）损伤神经元奠定基础。方法采用RT-PCR方法，从人的成神经细胞瘤的总cDNA中，扩增出1．5kb的BACE cDNA片段，再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；以免疫细胞化学法检测BACE基因的表达情况。结果人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中；经脂质体转染COS-7细胞后，并由潮霉素进行筛选，可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达。结论成功构建了pcDNA3．1-BACE的真核表达载体，为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE，为治疗AD奠定一定的实验基础。     

Tet-on基因表达系统反应质粒P~(TRE-HIF-1α)的构建和表达鉴定

目的克隆和构建携带人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的Tet-on基因表达系统反应质粒P^TRE-HIF-1α。方法以缺氧的肝癌细胞株HepG2总RNA为模板，进行RT-巢式PCR，获得HIF-1α的cDNA，克隆人Tet-on基因表达系统反应质粒P^TRE2hyg，酶切重组子鉴定。将构建好的P^TRE-HIF-1α用脂质体法转入HepG2^Tet-on细胞，在强力霉素的作用下，用RT-PCR及Western blot法鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1α的eDNA测序结果与Genbank记载完全一致，并成功克隆人P^TRE2hyg，将反应质粒P^TRE-HIF-1α转入HepG2^Tet-on细胞，可以完整有效表达HIF-1α且受强力霉素的调控。结论成功克隆和构建携带HIF-1α基因的Tet-on基因表达系统反应质粒P^TRE-HIF-1α，并证明其表达能在HepG2^Tet-on细胞中受强力霉素调控。     

人血管生成抑制分子的分子克隆与真核表达

目的　克隆人血管生成抑制分子 (METH1)全长cDNA ,建立稳定表达人METH1分子的哺乳动物细胞系。方法　RT PCR获取人METH1cDNA ,序列测定后克隆人真核表达载体pCDNA3 0中 ,用脂质体转染入HepG2细胞 ,G4 18筛选出稳定表达细胞系 ,用RT PCR与Westernblot分别检测RNA和蛋白表达水平。结果　RT PCR扩增得到预期大小的目的条带 ,序列分析表明成熟肽编码区与发表序列 [GI∶5 72 5 5 0 5 ]完全一致 ;克隆人pCDNA3 0中得到METH1真核表达载体 ,G4 18筛选 3周后得到稳定表达细胞系 ,RT PCR与Westernblot显示METH1在HepG2细胞中有高水平表达。结论　人METH1全长cDNA成功克隆 ,并在哺乳动物细胞系HepG2中获得稳定表达 ,为进一步研究METH1分子对增生性瘢痕血管形成的作用奠定了理论基础。     

人肿瘤MUC1/Y基因真核表达载体的构建及在BIU-87细胞中的表达

目的：克隆人肿瘤MUC1／Y全长基因及构建真核表达载体EGFP—MUC1／Y，并观察EGFP—MUC1／Y在BIU-87细胞中的表达，以进一步用于生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究。方法：取新鲜膀胱肿瘤组织，提取总RNA，采用随机引物进行逆转录，将特异引物扩增的MUC1／Y全长PCR产物克隆至真核表达载体pEGFP-C1，测序鉴定后命名为EGFP-MUC1／Y，用脂质体转染膀胱肿瘤细胞BIU87，以Western Blot检测其表达情况。结果：酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含人MUC1／Y全长cDNA编码序列，Western Blot检测和转染实验表明，构建的pEGFP-MUC1/Y基因在BIU-87真核细胞中表达，其绿色荧光蛋白瞬时表达率为20％。结论：人肿瘤MUC1／Y全长cDNA基因克隆及其真核表达载体pEGFP—MUC1／Y构建成功，可用于肿瘤生物学治疗的研究。     

linamarase稳定转染肝癌细胞系的建立及研究

目的构建含木薯linamarase(lis)基因的稳定转染肝癌细胞系,并对其生物学特性进行研究。方法应用PCR法从木薯的DNA中扩增出lis基因,将其克隆至pcDNA3.1(+)质粒中,构建重组质粒pcDNA3.1/lis。通过脂质体法将其转染人肝癌细胞系HepG2,进行G418筛选,获得稳定转染的肝癌细胞系HepG2/lis,通过免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot法鉴定lis在细胞中的表达;采用Lambert法对细胞内lis酶的活性进行分析;采用MTT法观察稳定转染细胞系生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠成瘤实验分析其体内成瘤特性。结果 lis基因能稳定整合于真核细胞中,并包装出具备β-葡萄糖苷酶活性的蛋白。lis在细胞中的稳定表达对细胞形态、生长特性、细胞周期、体内成瘤性等生物学特征并无明显影响。结论成功构建含lis基因的稳定转染肝癌细胞系,为将lis自杀基因系统应用于肝癌的治疗提供了实验基础。     

单基因人肝癌耐药细胞株(HepG2/MRP1)的构建及其生物学意义

目的 对抗肿瘤药的天然耐药和化疗过程中产生的继发性耐药是肝癌化疗敏感性差的重要原因之一,为探讨体外逆转肝癌多药耐药(muhidrug resistance,MDR)的新方法,笔者建立了单因素人肝癌细胞多药耐药模型HepG2/mrp1,并研究其牛物学特性.方法 双酶切克隆质粒pGEMmrp1获得人全长多药耐药相关蛋白基因(mrp1),并将其插入哺乳动物表达载体pCI-neo的多克隆位点,构建重组载体,利用质脂体法将重组载体转入人肝癌细胞HepG2,建立单基因耐药细胞株HepG2/mrp1.观察细胞的生长规律;MTT法检测其多药耐药性;流式细胞仪检测细胞表面多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)的表达;RT-PCR检测MRP1 mRNA表达量.结果 与HepG2细胞相比较,HepG2/mrp1细胞的倍增时间延长30.86 h.该细胞对多种抗肿瘤药耐药,HepG2/mrp1对阿霉素和柔红霉素的耐药指数比亲本细胞增加了11.4倍和8倍,细胞表面MRPl的表达明显增加,mrp1 mRNA明显增加.结论 HepG2/mrp1细胞稳定高表达MRP1,具有多药耐药性,为进一步研究肝癌的多药耐药构建了一个技术平台.     

MDR1 siRNA对胰腺癌细胞株BxPC-3耐药性影响的实验研究

目的：观察阻断多药耐药基因1（MDR1）表达后胰腺癌细胞对化疗药物敏感性的变化,探索提高胰腺癌化疗疗效的新方法。方法：采用RNA干扰技术．构建MDR1 siRNA重组质粒．脂质体介导转染人胰腺癌细胞株BxPC-3,并筛选稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western印迹法检测MDR1 mRNA和蛋白的表达变化。将细胞接种于裸鼠,观察移植瘤对化疗药物吉西他滨敏感性的变化。结果：转染MDR1 siRNA质粒后胰腺癌细胞株BxPC-3 MDR1 mRNA与蛋白表达水平明显降低。体内实验结果显示,将转染前后的细胞接种于裸鼠,转染组移植瘤对化疗药物吉西他滨更为敏感（P〈0．05）。结论：通过RNA干扰技术,可在转录和翻译水平降低MDR1在胰腺癌细胞株BxPC-3中的表达,并能提高细胞对化疗药物的敏感性。     

血管内皮生长因子D促进胃癌淋巴管生长

目的研究血管内皮生长因子D（VEGF-D）与胃癌淋巴管转移之间的关系。方法采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）从人胃癌旁正常组织中扩增人VEGF-D全长cDNA，经T-A克隆酶切鉴定及测序得到完整的序列后，亚克隆并构建pEGFP／VEGF-D真核表达载体，转染低表达VEGF-D的胃癌细胞株SGC7901，通过体外G418抗生素筛选得到高表达VEGF-D的肿瘤细胞克隆，用这种高表达VEGF-D的胃癌细胞接种于裸鼠皮下，用淋巴管内皮细胞透明质酸盐受体（LYVE-1）行免疫组织化学染色观察肿瘤淋巴管密度和形态。结果对照组和转染pEGFP／VEGF-D组肿瘤的重量分别为（1．13±0．40）g和（2．24±0．82）g，两组差异有统计学意义（P〈0．05）。肿瘤组织内的淋巴管密度分别为2．89±1．32和5．74±1．30，两组差异有统计学意义（P〈0．01）。周边肿瘤组织存在扩张的功能性淋巴管。结论VEGF-D在胃癌中可能通过主动促进淋巴管生长来促进肿瘤生长和远处转移。