MyoD基因诱导大鼠成纤维细胞转化为成肌细胞的研究

目的探讨MyoD在体外诱导大鼠成纤维细胞分化为成肌细胞中的作用。方法将大鼠成纤维细胞分成2组：未转染组（N组）和MyoD基因转染组（M组）;利用慢病毒表达系统,将大鼠MyoD基因转入大鼠成纤维细胞中,Blasticidin筛选;用RT-PCR和Western blot检测MyoD的表达;免疫组织化学检测MyoD、desmin及-αactin的表达;电子显微镜观察转染前后细胞形态的变化。结果RT-PCR和Western blot可检测出MyoD基因转染后细胞表达MyoD mRNA及蛋白质;免疫细胞化学检测MyoD表达在基因转染的细胞中为阳性,desmin、α-actin阳性表达只出现在M组;电子显微镜观察转染后的细胞胞浆中有微丝以及微管等结构。结论MyoD基因可诱导大鼠成纤维细胞分化成的细胞具有成肌细胞特征,为进一步研究MyoD基因诱导的成肌细胞及在大鼠心梗损伤修复中的作用提供了实验基础。     

MyoD家族蛋白在大鼠臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩中的作用

目的：探讨MyoD家族蛋白在去神经肌萎缩发生机制中的作用。方法：应用臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩的大鼠模型,采用Western-印迹法检测MyoD,肌细胞生成素蛋白表达的变化,通过逆转录聚合酶链式反应技术（RT－PCR）和Northern－印迹法研究MyoD和肌细胞生成素基因表达改变。结果：骨骼肌萎缩时,肌细胞生成素蛋白质的表达在去神经支配后24h内先迅速上调,然后逐步下降;而MyoD蛋白表达则在去神经支配后即开始逐渐下调。 肌细胞生成素和MyoD基因在去神经支配后表达下明显下降。而氨哮素等药物可以分别上调肌细胞生成素和／或MyoD的蛋白表达。结论：臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞中MyoD家族蛋白质和肌细胞生成素表达的下调抑制了成肌细胞的分化融合修复作用,加剧了骨骼肌的萎缩。氨哮素等药物通过分别上调肌细胞生成素和／或MyoD的蛋质表达从而起到延缓骨骼肌萎缩的作用。     

生肌调节因子和连接蛋白43基因诱导大鼠成纤维细胞分化为肌细胞实验研究

目的探讨转染生肌调节因子（myoblast determination，MyoD）基因和连接蛋白43（Connexin，Cx43）基因的大鼠真皮成纤维细胞（dermal fibroblast，DFs）生物学功能的变化及MyoD和Cx43基因转染DFs细胞治疗心力衰竭的可行性。方法采用Gateway技术，构建真核质粒表达载体。利用慢病毒（LV）表达系统，将大鼠MyoD cDNA和Cx43 cDNA转入大鼠成纤维细胞中，经Blasticidin筛选培养，通过RT-PCR，Western印迹法等方法检测MyoD及Cx43蛋白及mRNA表达情况，并且通过显微镜观察转染后生长情况，膜片钳技术检测离子电流变化。结果RT-PCR，Western印迹法检测出MyoD及Cx43蛋白及相应mRNA表达，膜片钳检测到转染后钙离子电流，显微镜观察到基因转染筛选后培养1w细胞的融合现象，并有多核肌管形成。结论MyoD和Cx43基因转染使DFs分化为成肌细胞，为进一步研究基因治疗心力衰竭奠定基础。     

MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究

目的：探讨MyoD基因诱导骨髓间充质干细胞（MSCs)分化为成肌细胞的可能性。方法：利用脂质体转染方法，将真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD转入MSCs中，G418筛选，用RT－PCR检测MyoD的表达，扩增产物纯化测序鉴定；荧光显微镜和激光共聚焦观察报告基因产物；免疫组化检测MyoD,myogenin,myosin,myoglobin desmin的表达，电镜观察转染前后细胞超微结构的变化。结果：RT－PCR可检测出转染后细胞表达MyoD,扩增产物纯化测序与Gene Bank比较完全一致，荧光显微镜和激光共聚焦观察均可见绿色荧光，免疫组化检测MyoD,myogenin,myosin,myoglobin,desimin表达均为阳性，转染后的MSCs观察表现为较为成熟细胞的形态学特点，且胞浆中有丝状物结构，结论：MyoD基因可成功诱导体外培养的骨髓MSCs分化为成肌细胞，为进一步研究MSCs和成肌细胞促进创伤修复提供了实验基础。     

c-ski对大鼠皮肤成纤维细胞生物学行为的影响

目的研究原癌基因c-ski对大鼠皮肤成纤维细胞活力、肌成纤维细胞分化、Ⅰ型胶原分泌等生物学行为的影响。方法免疫组化检测皮肤成纤维细胞内c-Ski蛋白的表达，并在转染c-ski基因后，利用MTT法检测皮肤成纤维细胞增殖活力、免疫组化和RT-PCR检测Ⅰ型胶原分泌、α-SMA细胞免疫组化检测肌成纤维细胞分化的改变。结果大鼠皮肤成纤维细胞内有c-Ski蛋白的表达，且主要表达在细胞核内，c-ski可以以剂量依赖的方式增加皮肤成纤维细胞的增殖活力，并可降低Ⅰ型胶原蛋白和mRNA的水平，但不改变皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化过程。结论c-ski促进细胞增殖但降低胶原分泌的作用可能对促进创伤愈合、降低瘢痕形成有着重要的意义。     

c-ski 对大鼠皮肤成纤维细胞生物学行为的影响

目的研究原癌基因c-ski对大鼠皮肤成纤维细胞活力、肌成纤维细胞分化、型胶原分泌等生物学行为的影响。方法免疫组化检测皮肤成纤维细胞内c-Ski蛋白的表达,并在转染c-ski基因后,利用MTT法检测皮肤成纤维细胞增殖活力、免疫组化和RT-PCR检测型胶原分泌、α-SMA细胞免疫组化检测肌成纤维细胞分化的改变。结果大鼠皮肤成纤维细胞内有c-Ski蛋白的表达,且主要表达在细胞核内,c-ski可以以剂量依赖的方式增加皮肤成纤维细胞的增殖活力,并可降低型胶原蛋白和mRNA的水平,但不改变皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化过程。结论c-ski促进细胞增殖但降低胶原分泌的作用可能对促进创伤愈合、降低瘢痕形成有着重要的意义。     

大鼠皮肤成纤维细胞MyoD cDNA转染后的形态变化

目的 探讨运用肌肉转录调节因子（myoblast-de termining,MyoD）基因转染使大鼠皮肤成纤维细胞（dermal fibroblasts,DFs）转化为肌细胞的可能性.方法 采用差速贴壁法培养Sprague-Dawley（SD）大鼠的DFs,利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6/V5- DEST-MyoD转染培养的大鼠DFs,经Blasticidin 筛选2周后挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态学观察及细胞免疫化学鉴定.结果 大鼠DFs在导入MyoD cDNA后可见：（1） 部分细胞形态发生改变, 类似骨骼肌细胞,胞体伸展,胞浆颗粒增多,（2） 经抗Desmin抗体的细胞免疫化学检测证实转染后的细胞有下游蛋白Desmin的阳性表达. 结论 DFs能转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞,提示DFs可成为心血管疾病基因治疗的靶细胞.     

雷帕霉素对mTOR基因诱导的NIH3T3成纤维细胞增殖的影响

目的探讨雷帕霉素对mTOR基因诱导的NI H3T3成纤维细胞增殖的影响。方法以mTOR基因转染小鼠NI H3T3成纤维细胞,以雷帕霉素干预,用MTT法检测细胞增殖情况,用RT-PCR和Western blot方法测定细胞p70S6KmRNA与蛋白的表达。结果 MTT法检测转染mTOR基因后细胞增殖能力增强,雷帕霉素可抑制其增殖;RT-PCR与Western blot检测转染后细胞p70S6K的mRNA与蛋白表达水平明显增加,雷帕霉素可抑制p70S6KmRNA与蛋白表达水平。结论雷帕霉素可能通过抑制mTOR/p70S6K信号通路抑制成纤维细胞增殖。     

IGF-1基因转染对大鼠成肌细胞增殖和分化的影响

目的：探讨人类胰岛素样生长因子-1（hIGF-1）基因转染对骨骼肌成肌细胞增殖和分化的作用及机制。方法：分别用pLghIGF-1SN质粒和对照质粒pLgGFPSN转染成肌细胞作为IGF组和GFP组,未转染成肌细胞作为细胞对照（Control）组。转染后用免疫细胞化学、RT-PCR检测hIGF-1基因在成肌细胞中的表达。MTT方法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测成肌细胞的细胞周期变化。通过检测细胞融合率与磷酸肌酸激酶（CK）含量检测IGF-1基因转染对成肌细胞分化的影响。结果：基因转染后免疫细胞化学和RT-PCR检测发现IGF组细胞有hIGF-1表达,GFP组和Control组细胞未见hIGF-1表达;MTT检测显示IGF组成肌细胞光吸收值增大,与Control组和GFP组细胞相比,差异有显著性（P〈0.05）;流式细胞仪检测显示：与对照组和GFP组相比,IGF组G1期细胞百分比显著下降（P〈0.05）,S期细胞百分比则显著增加（P〈0.05）。与对照组和GFP组相比,IGF组成肌细胞融合率和CK合成显著增加（P〈0.05）。结论：IGF-1基因转染对成肌细胞的增殖与分化均具有促进作用,其作用是通过减少G1期成肌细胞数量,增加S期细胞数量实现的。     

大鼠Otos基因对碱性成纤维细胞生长因子表达的调控

目的: 探讨Otos基因的表达对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的调控作用,以揭示Otos基因和bFGF在耳聋病理生理过程中的联系和作用.方法: 用含有大鼠Otos基因的腺病毒载体Ad-Otos转染培养的大鼠耳蜗螺旋韧带成纤维细胞,应用RT-PCR技术从转染细胞中检测Otos 基因和bFGF 基因的表达,用Western blot方法检测转染细胞中的bFGF蛋白的表达.结果: 经过转染Ad-Otos后,成纤维细胞中的bFGF显著上调.结论: Otos基因的表达可能对bFGF表达有影响,并有可能对内耳有保护作用.     

Experimental study on MyoD gene induced differentiation of bone marrow mesen-chymal stem cells into myoblasts in vitro

Objective: To explore the possibility of the transfection of MyoD gene induced bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs) to differentiate into myoblasts in vitro. Methods: The eukaryotic expression plasmid vector pIRES2-EGFP-MyoD was transfected into MSCs with lipotransfection method, and the positive cells were selected by G418; The expression of MyoD was detected in the transfected MSCs with RT-PCR and the amplified, purified product was identified by sequencing; The reporter gene enhanced green fluorescence protein ( EFGP) was observed in the transfected cells under a fluorescent and a laser confocal microscopes; Immunohistochemical methods was used to examine the expressions of MyoD, myogenin, myosin, myoglobin and desmin in the differentiated cells. The ultrastructure changes of the cells before and after transfection were observed with electron microscopy. Results: The expression of MyoD was detected in the transfected MSCs with RT-PCR and the amplified, purified product was as same in sequence a     

早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞的表达

目的:研究早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞中的特异性表达.方法:利用RT-PCR研究不同时期C57鼠和不同代龄SD大鼠骨髓干细胞早期肌肉特异性mRNA(包括MyoD,Myf5,myogenin,MRF4和desmin)的表达.结果:Myf5及desmin在新鲜分离、培养了2 d和7 d的悬浮与贴壁的C57小鼠骨髓干细胞中均有表达,没有检测到MyoD,myogenin和MRF4在此时期小鼠骨髓干细胞的表达.MyoD与desmin在原代至第6代SD大鼠骨髓间质干细胞中均有表达,没有检测到myogenin和MRF4在各代细胞中的表达.结论:骨髓干细胞能表达一定水平的早期肌肉特异性mRNA.     

低氧预处理对大鼠心肌成纤维细胞NLRP3基因表达的影响

目的：研究NLRP3基因在缺氧大鼠心肌成纤维细胞中的表达。方法：将大鼠心肌成纤维细胞体外原代培养,以氯化钴和低氧模拟心肌缺氧刺激,利用Real-timePCR和Western blot检测NLRP3基因在大鼠心肌成纤维细胞中的表达。结果：成功地体外培养出鼠心肌成纤维细胞,NLRP3基因在大鼠心肌成纤维细胞缺氧状态下表达明显增高。结论：NLRP3基因在大鼠心肌成纤维细胞缺氧状态下表达上调可以作为心肌梗死发生评判的重要因子。     

Regulation of Hypoxic Response Elements on the Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transfected to Rat Skeletal Myoblasts under Hypoxic Environment

The regulation of hypoxic response elements on the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） gene transfected to primary cultured rat skeletal myoblasts under hypoxic environment was investigated. pEGFP-C3-9HRE-CMV-VEGF vector was constructed with molecular biology technique and transfected to primary cultured rat skeletal myoblasts by lipofectamine in vitro. Gene expression of transfected myoblasts was detected by RT-PCR, Western blot and fluorescence microscope under different oxygen concentrations and different hypoxia time. The results showed that in hypoxia group, the VEGF gene bands were seen and with the decrease of oxygen concentrations and prolongation of hypoxia time, the expression of VEGF mRNA was obviously increased. Under hypoxic environment, the expression of VEGF protein in the transfected myoblasts was significantly increased. EGFP was expressed only under hypoxic environment but not under normoxic environment. It was concluded that hypoxia promoter could be constructed with HRE and regulate the expression of VEGF gene under hypoxic and normoxic environment, which could enhance the re- liability of gene therapy.     

PYK_2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响。方法以pAVU6 27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定。用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Westernblot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况。结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组。结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用。     

PYK2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响.方法以pAVU6 27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定.用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况.结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组.结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用.     

低氧诱导因子-1α对毛囊细胞的作用

目的探讨外源性人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在成纤维细胞中表达的可行性及其对毛囊周围细胞活性的影响。方法通过脂质体将含有HIF-1αcDNA的真核表达载体pcDNA3.0稳定转染成纤维细胞,应用RT-PCR及Westernblot方法检测HIF-1α在成纤维细胞中的表达,ELISA法检测转染细胞上清液中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达,RT-PCR方法检测转染后细胞中成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达。将该上清加入成纤维细胞及真皮鞘细胞中,MTT法检测加入上清后成纤维细胞及真皮鞘细胞活性。结果RT-PCR及Westernblot可检测出转染后细胞中HIF-1α的表达,MTT检测加入转染上清后成纤维细胞及真皮鞘细胞活性增强（P〈0.05）,并且该上清液VEGF的表达显著高于未转染组（P〈0.01）。转染后成纤维细胞的bFGF的mRNA表达显著高于未转染组（P〈0.01）。结论应用脂质体能够成功地将外源性人HIF-1α基因转染成纤维细胞,并进行有效表达,其表达的HIF-1α可增强细胞活性且可诱导转染细胞上清液中VEGF的表达,并增加bFGF的mRNA表达,且转染细胞上清可增强成纤维细胞及真皮鞘细胞活性。推测HIF-1α通过其下游因子VEGF及bFGF促进毛囊相关细胞的活性,为HIF-1α对毛囊作用的进一步研究打下了基础。     

TIMP-3-pcDNA3.0转染平滑肌细胞及其在大鼠心肌梗死瘢痕中的存活与表达

目的 探讨基质金属蛋白酶抑制因子3(TIMP-3)基因转染平滑肌细胞的效果及移植的转染细胞能否在大鼠心梗瘢痕中存活并表达目的 蛋白.方法 植块法培养大鼠主动脉中层平滑肌细胞并鉴定;脂质体介导法以"TIMP-3基因质粒转染平滑肌细胞;RT-PCR和Western blot检测转染细胞的基因水平和蛋白表达;通过BrdU移植检测移植细胞的存活与增殖情况.实验大鼠随机分成单纯PBS注射、单纯平滑肌细胞移植和转染平滑肌细胞移植3组(每组7只实验大鼠),将移植物注射人(五点法)心梗大鼠的室壁内.1周后,提取其左心室组织mRNA和蛋白,分别进行RT-PCR和Western blot检测,鉴定其.TIMP-3基闪含量和表达情况.结论 植块法培养可以获得高纯度的平滑肌细胞;脂质体介导法可以使TIMP-3基因转染平滑肌细胞并获得TIMP-3蛋白的表达;移植的转染细胞能够在心梗缀痕中存活并增殖;转染细胞组大鼠左心室组织中TIMP-3 mRNA含量明显多于单纯平滑肌细胞移植组(P<0.01)及单纯PBS注射组(P<0.01);转染细胞移植组大鼠左心室组织中TIMP-3蛋白含量明显多于平滑肌细胞移植组(P<0.01)及单纯PBS注射组(P<0.01).结论TIMP-3基因可以通过脂质体介导法转染平滑肌细胞,且转染细胞可以在大鼠梗死心肌中存活、增殖并表达TIMP-3蛋白.