CpG-寡核苷酸对免疫细胞基因表达的影响

目的:研究CpG-寡核苷酸(CpG-ODN)对免疫细胞基因表达的影响.方法:用Cy3和Cy5两种荧光分子通过逆转录反应将CpG-ODN刺激前后的单核-巨噬细胞系RAW264.7细胞的mRNA分别标记成探针,混合后与小鼠基因表达谱芯片杂交,通过扫描、计算机分析,寻找经CpG-ODN刺激后差异表达的基因.结果:CpG-ODN刺激RAW264.7细胞6 h后,2次芯片杂交筛选出重复差异表达的基因119条,其中74条上调,45条下调;这些基因涉及细胞周期、免疫调控、脂肪代谢、泡沫细胞形成、信号转导等过程.结论:CpG-ODN可广泛调控巨噬细胞内多种基因的表达,对相关基因群的进一步研究有助于深入了解CpG-ODN的作用机制.     

有机锗对粒-巨噬集落形成细胞的作用

利用体外琼脂半固体培养体系探索了有机锗(Ge-132)对粒—巨噬集落形成细胞(CFC-GM)的作用。结果表明,体系中无集落刺激因子时(CSF),Ge-132不能刺激CFC-GM形成集落。若体系中有CSF,则Ge-132不能增加CFU-GM的集落数量,二者无协同作用。把Ge-132加入到含肺组织的双层培养体系中,则发现它能显著地促进CFC-GM集落的形成,而Ge-132对含其他组织的双层培养体系无此现象。提示Ge-132刺激了肺组织的某些细胞(内皮细胞或者是巨噬细胞),产生活性的集落刺激因子而促进CFU-GM集落的形成。     

巨自噬与细胞泡沫化在动脉粥样硬化中的研究进展

泡沫细胞是积聚于动脉粥样硬化病变部位的主要细胞,参与了脂质斑块的形成和发展。研究发现,血管平滑肌细胞和巨噬细胞大量吞噬脂质后会向泡沫细胞转化,而激活基础自噬可以介导脂质的逆向转运,减少泡沫细胞形成。本文综述了自噬以及细胞泡沫化与动脉粥样硬化的关系,为动脉粥样硬化的防治提供参考。     

姜黄素对THP-1源性巨噬泡沫细胞B类1型清道夫受体表达的影响

目的研究姜黄素对人单核细胞(THP-1)源性巨噬泡沫细胞B类1型清道夫受体(SR-B1)表达的影响。方法使用不同浓度姜黄素(12.5、25、50 mg/L)作用于THP-1巨噬泡沫细胞,观察三组不同浓度姜黄素作用的THP-1源性巨噬泡沫细胞SR-B1表达情况。结果仅50 mg/L姜黄素作用24 h细胞存活率低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);其他浓度及时间姜黄素组细胞存活率与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。50 mg/L姜黄素组SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表达水平明显低于其他组,差异有统计学意义(P0.05);25 mg/L姜黄素组上述指标表达水平低于12.5 mg/L姜黄素组和对照组,差异有统计学意义(P0.05);12.5 mg/L姜黄素组与对照组上述指标表达水平比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论一定浓度姜黄素可抑制THP-1源性巨噬泡沫细胞中SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA的表达,从而减少泡沫细胞,达到抗动脉粥样硬化的目的。     

脂肪因子chemerin促进巨噬泡沫细胞形成

目的观察脂肪因子chemerin是否调节巨噬泡沫细胞形成,以及对巨噬泡沫细胞CD36、ATP结合盒转运子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)表达和炎症因子释放的影响。方法 100nmol/L佛波酯(phorbolmyristate acetate,PMA)诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞,随机分组,Chemerin不同浓度和作用时间下联合相同浓度(50μg/mL)氧化型低密度脂蛋白与THP-1源性巨噬细胞共孵育。油红O染色观察细胞内脂滴变化,Western blot和实时PCR检测CD36、ABCA1的mRNA和蛋白水平的表达。ELISA法检测培养液中炎症因子———肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)的浓度,酶法检测细胞内胆固醇含量。结果Chemerin诱导巨噬细胞内脂滴蓄积,下调CD36和ABCA1mRNA及蛋白的表达,增加培养液中促炎因子TNF-α的释放而降低抗炎因子IL-10的释放,提高细胞内胆固醇的含量,且有浓度和时间依赖性。结论 Chemerin通过下调CD36和ABCA1基因的mRNA及蛋白的表达,诱导THP-1巨噬细胞内脂滴蓄积和泡沫细胞形成;ABCA1表达下调可能与促炎因子TNF-α释放增加和抗炎因子IL-10释放减少有关。     

反义寡核苷酸对淋巴瘤细胞Livin基因表达及细胞凋亡的影响

目的 分析凋亡抑制蛋白Livin基因的反义寡核苷酸(ASODN)对人淋巴瘤细胞株(Raji)Livin mR-NA表达的抑制作用及其对细胞凋亡的影响.方法 合成Livin特异性全硫代修饰的ASODN及其对照错义寡核苷酸(MSODN),通过脂质体转染Raji细胞,MTT法检测细胞的增殖抑制率;RT-PCR法检测转染前后Livin mRNA表达水平的变化;Hoechst染色观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仅检测细胞的凋亡率.结果 Livin ASODN能显著抑制Raji细胞的增殖(P<0.01),并呈现一定的剂量效应关系.0.6μmol/L的A-SODN作用Raji细胞48h后,Livin mRNA的表达水平明显下调,细胞出现凋亡的形态学改变,细胞凋亡率为(37.54±2.65)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 Livin ASODN能有效降低Livin mRNA表达水平,抑制Raji细胞增殖,并增强细胞凋亡的敏感性,有望成为淋巴瘤基因治疗的分子靶向.     

反义寡核苷酸对HL60细胞c-myc基因表达的抑制和诱导分化作用

目的研究ｃｍｙｃ反义寡核苷酸对ＨＬ６０细胞中ｃｍｙｃ基因的表达及ＨＬ６０细胞分化的影响。方法采用针对原癌基因ｃｍｙｃ的ｍＲＮＡ５’非翻译区的一个１８ｂｐ的反义寡核苷酸５’ｄ（ＣＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧ）３’与人早幼粒白血病细胞系ＨＬ６０细胞共培养５ｄ，检测ｃｍｙｃｍＲＮＡ量的变化及其对ＨＬ６０细胞分化的影响。结果用ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测出ＨＬ６０细胞ｃｍｙｃｍＲＮＡ的含量减少；细胞形态学变化以及非特异性酯酶（ＮＳＥ）染色、硝基四氮唑蓝（ＮＢＴ）还原试验均提示ＨＬ６０细胞出现了分化，部分细胞向粒细胞方向分化，部分细胞向单核细胞方向分化。结论ｃｍｙｃ反义寡核苷酸能够抑制ｃｍｙｃ基因的表达并能诱导ＨＬ６０细胞分化。     

反义寡核苷酸对HL60细胞c—myc基因表达的抑制和诱导分化作用

研究ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸对ＨＬ６０细胞中ｃ－ｍｙｃ基因的表达及ＨＬ６０细胞分化的影响。方法 采用针对原癌基因ｃ－ｍｙｃ的ｍＲＮＡ５’非翻译区的一个１８ｂｐ的反义寡核苷酸５‘ｄ（ＣＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＧＡ ＧＧＧ）３「与人早幼粒白血病细胞系ＨＬ６０细胞共培养５ｄ，检测ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ量的变化及其对ＨＬ６０细胞分化的影响。     

反义寡核苷酸抑制端粒酶活性对鼻咽癌细胞癌基因表达的影响

目的：检测针对端粒酶的反义寡核苷酸（AS-ODN）对鼻咽癌HNE-1细胞株bcl-2及c-myc基因表达的影响。方法：用PCR-ELISA法检测细胞内端粒酶活性。用免疫细胞化学法检测bcl-2和c-myc基因的表达。结果：鼻咽癌细胞株HNE-1与20μmol/L反义寡核苷酸共同孵育1天，对其端粒酶活性抑制率为61.6%。而同浓度正义寡核苷酸（S-ODN）对细胞端粒酶活性无抑制作用。20μmol/L反义寡核酸作用2天后鼻咽癌细胞c-myc基因表达HSCORE评分由3.65下降为1.98，而bcl-2基因表达HSCORE评分无明显变化。结论：该反义寡核苷酸可抑制鼻咽癌细胞端粒酶活性。此作用有序列特异性。该反义寡核苷酸抑制了鼻咽癌细胞c-myc基因的表达，而对bcl-2基因表达无明显影响。     

NF-κB途径介导硫酸吲哚酚抑制THP-1源性巨噬泡沫细胞SR-B1的表达

目的观察尿毒症毒素硫酸吲哚酚(IS)是否促进巨噬泡沫细胞脂滴的蓄积,以及对细胞内B类1型清道夫受体(SR-B1)表达和核因子NF-κB活化的影响。方法体外佛波酯(PMA)诱导人源单核细胞系THP-1分化为巨噬细胞,加入氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)培养促进巨噬细胞泡沫化,随后以不同浓度的IS干预巨噬泡沫细胞,油红O染色观察细胞内脂滴变化,实时PCR和Western blotting检测SR-B1 m RNA和蛋白表达的水平,ELISA法检测NF-κB活化情况;经NF-κB抑制剂四氢化吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)预处理后IS再干预,实时PCR检测巨噬泡沫细胞内SR-B1 m RNA表达的变化。结果与对照组(IS 0μmol/L)比较,IS干预后巨噬泡沫细胞内脂滴明显增加,随着IS浓度的升高,细胞内脂滴逐渐增加;IS干预后巨噬泡沫细胞的NF-κB活化程度增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,细胞在不同浓度的IS(2.5、25、250μmol/L)处理下,SR-B1 m RNA和蛋白的表达下降,随着IS浓度的增加,SR-B1和蛋白逐渐减少,呈现浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。PDTC预处理后SR-B1m RNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IS抑制SR-B1 m RNA和蛋白的表达,增加THP-1源性巨噬泡沫细胞胆固醇的蓄积,促进巨噬细胞泡沫化,从而促进动脉粥样硬化。NF-κB活化可能是IS抑制SR-B1 m RNA表达的可能机制之一。     

小鼠MME基因真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆小鼠巨噬细胞金属弹力酶(MME)基因结构域Ⅰ和Ⅱ,构建真核细胞表达载体,用于动物肿瘤原位种植模型的研究.方法通过PCR选择性扩增MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切及PCR鉴定.结果以MME cDNA为模板进行PCR扩增的特异性片段在750 bp和1 000 bp之间.以此构建的pGEM-T-MME克隆载体和表达载体, 经限制性内切酶酶切证实载体中带有MME目的基因片段; 与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%; 证明MME基因已正确克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中.结论成功构建了pcDNA3.1-MME重组质粒,奠定了转基因研究MME表达与肿瘤生长转移关系的实验基础.     

SIRT1激动剂通过降低ACAT1表达抑制平滑肌泡沫细胞形成

目的 探讨沉默信息调节因子1 (silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cell,VSMC)泡沫化的作用和相关的分子机制.方法 用组织贴块法体外培养原代VSMC,用80μg/mL ox-LDL刺激VSMC诱导泡沫细胞形成.检测SIRT1在ox-LDL刺激不同时间(24、48、72 h)的表达变化.SIRT1的活性调控分别应用SIRT1激动剂(SRT1720,SRT,1μmol/L)和抑制剂(nicotinamide,Nic,100 μmoL/L)进行干预.干预24 h后采用Western blot检测VSMC过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(A-cholesterol acyhransferase 1,ACAT1)的蛋白表达,干预48 h后采用油红O染色检测细胞内脂质沉积和泡沫细胞形成情况.应用PPARγ激动剂(Rosiglitazone,RSG,50 μmol/L)和抑制剂(GW9662,10 μmol/L)调控PPARγ的表达,Western blot检测VSMC中ACAT1的表达.结果 ①ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中,SIRT1蛋白表达在48 h降低约47％ (P ＜0.01);油红O染色显示,SRT可以抑制VSMC泡沫细胞形成,而Nic可逆转SRT的抑制作用;②ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中ACAT1的表达显著增加[(2.77±0.70),P＜0.01],SIRT1激动剂SRT可显著抑制ACAT1的表达[(0.90±0.27),P＜0.01],而SIRT1抑制剂Nic可阻断这一作用,升高ACAT1的表达[(2.25±0.37),P＜0.05];③ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中PPARγ的表达减少[(0.73±0.12),P＜0.05],SIRT1激动剂SRT可上调VSMC中PPARγ的表达[(0.98±0.16),P＜0.05],SIRT1抑制剂Nic抑制PPARγ的表达[(0.47 ±0.13),P＜0.01];④PPARγγ激动剂RSG可抑制ACAT1的表达[(0.73±0.09),P＜0.01],而PPARγ抑制剂GW9662则上调ACAT1表达[(1.68±0.09),P＜0.01].结论 SIRT1通过上调VSMC中PPARγ表达而抑制ACAT1表达,从而抑制ox-LDL诱导的VSMC泡沫样变.     

Thymic Stromal Lmphopoietin Pomotes Macrophage-derived Foam Cell Formation简

The effect of thymic stromal lymphopoietin（TSLP） on macrophage-derived foam cell formation and the underlying mechanism were studied. Macrophages isolated from C57BL/6 mice were co-cultured in vitro with different concentrations of TSLP or TSLPR-antibody in the presence of oxidized low density lipoprotein（ox-LDL）. The effects of TSLP on macrophage-derived foam cell formation were observed by using oil red O staining and intracellular lipid determination. The expression levels of foam cell scavenger receptors（CD36 and SRA） as well as ABCA1 and TSLPR were detected by using RT-PCR and Western blotting. As compared with the control group, TSLP treatment significantly promoted lipid accumulation in macrophages, significantly increased protein expression of CD36 and TSLPR in a dose-dependent manner, and significantly reduced the expression of ABCA1 protein in a dose-dependent manner. No significant differences were noted between the TSLPR-antibody group and the control group. TSLP may down-regulate the expression of cholesterol efflux receptor ABCA1 and up-regulate scavenger receptor expression via the TSLPR signaling pathway, thereby promoting macrophage-derived foam cell formation.     

壳寡糖对体外培养的巨噬细胞IL-18基因表达的影响

目的 :研究壳寡糖对小鼠巨噬细胞IL 18基因转录水平和翻译水平的影响。方法 :将壳寡糖作用于体外培养的小鼠巨噬细胞 ,运用相对定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)技术和酶联免疫吸附实验 (ELISA)技术 ,检测壳寡糖对巨噬细胞IL 18基因转录水平和翻译水平的影响。结果 :RT PCR和ELISA结果表明 ,巨噬细胞加入壳寡糖作用 2 4h后 ,IL 18基因转录水平为对照组的 1.7倍 (P <0 .0 1) ,其分泌量为空白对照组的 1.8倍 (P <0 .0 1)。结论 :壳寡糖可以增强小鼠巨噬细胞IL 18的基因表达 ,使细胞因子IL 18基因转录及翻译水平增高。     

联合应用塞莱西布和CpG-ODN对树突状细胞功能的影响

目的 观察联合应用COX-2抑制剂塞莱西布和免疫佐剂CpG-ODN对树突状细胞(DC)功能的影响,研究其生物效应.方法 分离和培养人脐血来源树突状细胞,按分组进行预处理和诱导成熟,光镜及电镜观察DC形态,流式细胞仪检测表面标志CD1a、CD83、HLA-DR的表达情况以及进行细胞因子IL-10、IL-12水平测定(ELlSA).结果 按预定方法诱导成熟的DC,其形态学无明显异常,流式细胞检测证实了其正常成熟并具有生物活性,细胞因子的测定表明实验组IL-12含量明显增高,IL-10含量明显降低,Th1/Th2应答平衡出现明显的免疫漂移现象.结论 联合应用COX-2抑制剂和CpG-ODN可明显增强DC的生物学活性,为建立基于DC的肿瘤生物治疗打下了良好的基础.     

The effect of neferine on foam cell formation by anti-low density lipoprotein oxidation

Summary Oxidatively modified low density lipoprtein (LDL) plays an important role in atheroslerosis (AS) development. To investigate the role of neferine (Nef) in anti-LDL oxidation and foam cell formation, the lipoprotein was derived and subjected to three different treatments: N-LDL (normal LDL), Cu²⁺+LDL and Cu²⁺ + Nef+LDL. The LDLs were put at 25 C for 24 h and the thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) values were determined. They were 0. 57 ±0. 02, 6. 01 ±0. 22 and 2. 26±0.13 nmol/mg protein, respectively. The difference was very significant (P<0. 01) for each two groups byt test. Mouse peritoneal macrophage (MΦ) were exposed to 50 μg protein/ml of Cu²⁺+LDL and Cu²⁺+Nef+LDL at 37 °C for 60 h. The tryglyceride (TG) and total cholesterol (TC content in MΦ were assayed. The results showed that Cu²⁺+ LDL was more efficient than Cu²⁺+Nef+ LDL in stimulating lipid accumulation in MΦ(P <0. 001). The study demonstrated that Nef could inhibit Cu²⁺-mediated LDL oxidation and thereby inhibiting macrophage-derived foam cell formation.     

扇贝糖胺聚糖对平滑肌源性泡沫细胞形成及其功能的影响

目的:研究扇贝裙边糖胺聚糖(SS- GAG)对氧化低密度脂蛋白(Ox- LDL)诱导的猪血管平滑肌细胞泡沫化过程及其表达的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH- PX)和一氧化氮 (NO)分泌含量的影响,以探讨SS GAG抗动脉粥样硬化(AS)的作用机制。　方法:采用猪血管平滑肌细胞与 15mg/L的Ox -LDL孵育 72h,建立平滑肌源性泡沫细胞模型。将培养的平滑肌细胞分为 6组: 正常细胞对照组、模型组、肝素对照组和低、中、高浓度的SS GAG药物组。通过酶法测定不同处理组细胞内总胆固醇 (TC)、游离胆固醇 (FC)、胆固醇酯 (CE)含量及CE/TC,观察不同浓度SS- GAG对平滑肌细胞泡沫化过程中细胞内脂质代谢的影响。通过黄嘌呤氧化酶法、过氧化氢还原法、硝酸还原酶法,分别检测不同处理组细胞分泌的SOD、GSH- PX和NO的含量。　结果:培养的平滑肌源性泡沫细胞中TC、FC、CE和CE/TC均明显高于正常平滑肌细胞 (P<0. 01),CE/TC超过 50%,高达 62. 99%。而加入SS GAG的 3个药物组和肝素对照组则有不同程度降低,CE/TC均在 50%以下,抑制了泡沫细胞的形成,以800mg/LSS GAG组降低最为明显(P<0. 01)。SOD在各组中的表达差异无显著性意义 (P>0. 05)。泡沫细胞中GSH PX和NO的表达量明显低于正常平滑肌细胞(P<0. 01),而加入SS GAG的 3个组     

Role of VLDL receptor in the process of foam cell formation

Summary The role of very low density lipoprotein receptor (LVLDR) in the process of foam cell formation was investigated. After the primary cultured mouse peritoneal macrophages were incubated with VLDL, β-VLDL or low density lipoprotein (LDL), respectively for 24 h and 48 h, foam cells formation was identified by oil red O staining and cellular contents of triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) were determined. The mRNA levels of LDLR, LDLR related protein (LRP) and VLDLR were detected by semi-quantitative RT-PCR. The results demonstrated that VLDL, β-VLDL and LDL could increase the contents of TG and TC in macrophages. Cells treated with VLDL or β-VLDL showed markedly increased expression of VLDLR and decreased expression of LDLR, whereas LRP was up-regulated slightly. For identifying the effect of VLDL receptor on cellular lipid accumulation, ldl-A7-VR cells, which expresses VLDLR and trace amount of LRP without functional LDLR, was used to incubate with lipoproteins for further examination. The results elucidated that the uptake of triglyceride-rich lipoprotein mediated by VLDLR plays an important role in accumulation of lipid and the formation of foam cells. QU Shen, male, born in 1954, Professor This project was supported by a grant from National Natural Sciences Foundation of China (No. 39970307).