创造酶切位点与PCR-RFLP原理在基因多态检测中的应用探讨

摘要:目的:探讨创造酶切位点与PCR - RFLP原理在基因多态检测中的应用及其注意事项.方法:应用创造酶切位点原理设计引物,通过PCR - RFLP技术判断多个基因多态性.结果:共对MGMT、ADH2、MTH -FR和PON2基因多种多态位点进行了实验研究,均成功完成检测.结论:应用创造酶切位点PCR - RFLP原...     

多重PCR-RFLP用于药酶CYP2C9基因分型的研究

目的 建立鉴定CYP2C9基因型的多重PCR-RFLP方法.方法 用2对引物分别在同一管中PCR扩增针对外显子2中T269C和外显子7中A1075C两个多态位点的靶片段,PCR产物用MvaⅠ酶切分型;另用2对引物分别在同一管中PCR扩增针对外显子3中C430T和外显子6中A895G两个多态位点的靶片段,PCR产物用VpaK11B Ⅰ酶切分型.结果 多重PCR-RFLP分型结果与单管单位点PCR-RFLP分型结果一致.结论 建立了一种一次可以同时检测CYP2C9基因T269C,A1075C两个多态位点及C430T,A895G两个多态位点的方法,该法具有简单、快速、灵敏、经济、准确等特点.     

一种简单、稳定、可靠的屏氧酶1基因多态性分析法

目的：建立一种简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。方法：取外周静脉血100μl，用ROSE法提取基因组DNA，用两对引物：P192F 5′-TAT TGT TGC TGT GGG ACC TGA G-3′,P192R 5′-CAC GCT AAA CCC AAA TAC ATC TC-3′；P55F 5′-GAA GAG TGA TGT ATA GCC CCA G-3′,P55R 5′-TTT AAT CCA GAG CTA ATG AAA GCC-3分别进行PCR扩增，用限制性内切酶AlwI,NlaⅢ对两种PCR产物分别进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的两个PCR产物在192、55多态性位点大小分别为99bp、170bp。Alw I酶切后，凝胶电脉得到完全酶切（66bp,33bp)，部分酶切（99bp、66bp、33bp)，未被酶切（99bp)三种类型DNA片段（RR，QR，QQ基因型）；NlaⅢ酶切后，凝胶电脉得到部分酶切（170bp,126bp,44bp)，未被酶切（170bp)两种类型DNA片段（LM，LL基因型）。经双盲重复检测，结果一致。应用此方法对胃癌患者血样标本检测，发现其PON1基因多态性在192位点频率较高。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。     

人芳香二烷基磷酸酯酶基因多态性同步分析研究

目的 :建立一种对PON1 192和PON1 5 5位密码子等位基因同步分型的方法。方法 :在Multiplex PCR RELP基础上 ,通过引物设计错配 ,在一体系中同时扩增分别含密码子PON1 192和PON1 5 5的DNA片段 ,当等位基因为PON1 192R/PON1 5 5L时 ,其PCR扩增产物均被引入唯一的限制性内切酶HinfⅠ的识别位点G ANTC。PCR产物经酶消化 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳后 ,根据不同组合片段 ,确认为不同的基因型 ,从而同时对两个位点进行基因分型。结果 :在检测的 80例健康个体中PON1 192 :Q 4 6 .9% ,R 5 3.1% ;PON1 5 5 :L 95 .6 % ,M 4 .4 % .结论 :此方法同时可分析基因两个位点的多态性 ,省时省力 ,方法简便 ,便于两个位点以及与疾病之间的连锁分析 ,很有推广价值 .     

广东人群药物代谢酶CYP2C9基因374G〉A位点多态性调查

目的调查广东人群CYP2C9基因第3外显子374G〉A位点多态性。方法应用创造酶切位点PCR扩增跨越374G〉A位点的DNA片断,用MluI酶切PCR产物,通过PAGE－银染判断基因型。结果在受检的532例广东人中,未检出A374突变等位基因即CYP2C9。14等位基因,所有个体的基因型均为野生型纯合子G374／G374。结论CYP2C9女14等位基因为广东人群的稀有等位基因。     

酶联免疫法检测MTHFRC677T位点基因多态性

目的建立一种基于错配杂交及酶联免疫检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的新方法。方法针对多态位点设计两条寡核苷酸探针,分别与野生型及突变型序列互补。将两条地高辛标记的探针分别与含多态位点C677T的PCR扩增产物杂交,然后显色检测,根据两条探针的吸光度值之比确定样品的基因型。结果用本法随机检测了50例DNA样品,结果三种基因型的发光值之比可以严格区分,其中野生型(C/C)15例,杂合型(C/T)28例,突变型(T/T)7例,与参考方法(PCR-RFLP)的检测结果完全一致。结论本方法操作简便、检测快速而且费用低廉,可广泛应用于MTHFR基因突变及多态性检测。     

单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性

目的:建立了一种单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性(SNP).方法:以TYP基因外显子1上的3个SNP位点(71G>A、425A>T和758G>A)为例,首先采用PCR预扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;然后用限制性内切酶将其消化成短片段,在连接酶的作用下与设计的DNA适配器相连;以此连接产物为模板,在单个PCR管中加入一种适配器特异性通用引物和所有等位基因特异性引物进行PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳法分离检测PCR扩增产物,并根据扩增片段的大小判断SNP的类型.结果:采用该法成功测定了30名健康中国人的TYP基因中的3个SNP位点,与限制性片段长度多态性法(RFLP)测定结果完全一致.结论:该方法特异性高、结果准确、检测成本低,可用于同时测定多个SNP位点.     

ras癌基因点突变的研究

N-ras基因第12密码子、K-ras基因第12和13位密码子无已知的限制性内切酶的酶切位点,不能使用PCR-RFLP方法分析这些位点的突变。我们在PCR引物的3’端引入了一个误配的硷基使之正好成为某限制性内切酶的酶切位点,因而能使用PCR-RFLP方法分析上述位点的突变。本文使用PCR-RFLP方法分析了c-Ha-ras基因第12和61位、N-ras基因第12位、K-ras基因第12位和13位密码子的点突变。     

内毒素受体 TLR4基因多态性"Asp299Gly"的分型检测

目的:建立一种用于内毒素受体TLR4基因多态性"Asp299Gly" 检测的方法,并在中国汉族人中进行该位点的检测.方法:以等位基因特异性PCR原理为基础,在两个等位基因特异性引物的3′端第3位引入不配对碱基以增加特异性,与共同的下游引物分别构成两个PCR反应体系.采用PCR定点突变方法得到含和不含"Asp299Gly"突变位点的DNA片段插入质粒作为标准模板,用以验证这一方法的鉴别效果,并采用PCR-RFLP分析和测序加以验证.结果:该方法用于"Asp299Gly"检测的结果,与PCR-RFLP分析的结果及测序的结果完全相符,采用我们建立的已知基因型的突变型和野生型重组质粒作模板验证,结果也完全相符.采用该方法共检测92份汉族人群DNA 样本,未发现"Asp299Gly"的携带者.结论:以等位基因特异性PCR原理为基础的检测方法,是一种可用于TLR4基因多态性"Asp299Gly" 检测的简便、快速、准确、适合于一般实验室的好方法.中国汉族人群携带这一突变的基因频率可能很低.     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的 建立一种简便，准确，实用的乙型肝炎病毒（HBV）耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法。方法 根据已公布的HBVDNA序列，在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物，其中一只为错配引物；应用巢式错配聚合酶链反应特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段，扩增产物用限制性内切酶（NdeⅠ）酶切，琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的目的片段限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，部分标本进行DNA测序，结果 （1）所建立的巢式错配PCR-RFLP方法操作简便，快速，从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时；灵敏度高，可以检测到10^3copies/ml的HBVDNA；特异性强，结果准确，经DNA测序证实，（2）应用该方法对20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清进行了检测，发现YMDD变异者（45%）9例，YMDD野毒株者（55%）11例，表明该方法可有效地鉴别HBVYMDD野毒株与变异株，结论 本实验所建立的巢式错配PCR-RFLP方法简单，敏感，特异，适合于一般实验室应用及大规模的人群调查。     

PLUNC基因编码区单核苷酸多态位点G14595T与鼻咽癌的相关研究

目的检查腭、肺及鼻咽上皮克隆（PLUNC）基因编码区单核苷酸多态（SNP）位点G14595T与广东地区鼻咽癌易感性有无明显关联。方法用直接测序的方法检测基因编码区、调控区和侧翼区及部分内含子区,确定SNP位置和类型。用聚合酶链式反应一限制性酶切片段长度多态性（PER-RFLP）结合测序方法对编码区多态性位点G14595T在广东地区239例鼻咽癌患者和286例对照人群中进行相关性分析。结果通过测序共获取9个SNP;其中8个SNP位点之间均呈高度连锁不平衡;3个SNP位点可以作为htSNP;编码区多态位点G14595T在239例鼻咽癌患者和286例对照人群中等位基因型频率差别很小。结论PLUNC基因编码区多态位点G14595T在鼻咽癌患者和对照人群中等位基因型频率差别很小,这说明该位点与中国广东地区鼻咽癌易感性无明显关联。     

慢病毒载体表达外源PON1对小鼠巨噬细胞的影响

目的:为探讨对氧磷酯酶1(PON1)在机体代谢性疾病中的作用及机制,本实验构建含人源性PON1基因的慢病毒表达载体,研究其表达分泌PON1的能力及对小鼠巨噬细胞的影响。方法:根据人肝cDNA文库的PON1序列设计特定引物,定点诱变PCR获得两端为PmeⅠ内切酶位点的目的基因,经酶切连接到pWPI-GFP载体上,筛选及DNA测序鉴定。磷酸钙法瞬时转染293T细胞,荧光显微镜观察GFP表达反映转染效率,Western Blotting检测细胞培养基中PON1分泌表达量,采用对氧磷为底物检测PON1活性。含PON1的培养基与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育,ELISA法检测氧化条件下细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的水平。结果:构建的pWPI-PON1慢病毒表达载体序列正确,高效转染293T细胞(转染效率可达到80%-90%)可有效分泌表达PON1至培养基,显著提高培养基PON1活性,与对照组相比,培养基中PON1可明显抑制巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-6的分泌(P<0.01)。结论:pWPI-PON1慢病毒载体高效表达分泌的外源PON1能有效降低巨噬细胞的炎症反应。     

自噬体基因ATG16L1多态性与炎症性肠病的相关性研究

目的 检测炎症性肠病(IBD)患者ATG16L1基因单核苷酸多态性(SNP)位点rs2241880的等位基因多态性与IBD易感性间的关系.方法 抽取80例IBD患者,其中40例克罗恩病(CD)患者、40例溃疡性结肠炎(UC)患者,50例健康者外周静脉血并提取DNA,根据目的 基因片断设计特异性引物,并应用PCR方法 扩增DNA样本中的目的 基因片断.并对扩增的目的 基因片断进行测序,其测序结果与正常序列进行比较并分析等位基因的多态性与疾病易感性之间的相关性.结果 CD和UC患者与正常对照组之间ATG16L1基因SNP位点rs2241880的等位基凼多态性之间无明显差异(X2=4.94,P=0.293).结论 国外文献报道的与CD相关的易感基因ATG16L1的多态性位点rs2241880,在本组CD患者中并未发现与CD易感性相关,国外发现的与CD易感性相关的ATG16L1基因的SNP位点可能不是中国CD患者的易感性基因位点.     

自动双向测序法检测基因的单核苷酸多态性

目的：通过检测21号染色体上的所有已知基因中存在的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism，SNP)，建立一种检测基因SNP的高通量的方法。方法：应用聚合酶链反应技术和荧光标记的自动双向测序法，对中国汉人、少数民族共96个人DNA标本，在21号染色体上所有已知基因的启动子区、全部编码区及其临近的内含子区进行自动测序，并通过Polyphred软件识别SNP。结果：应用聚合酶链反应技术和荧光标记的自动双向测序法在128个基因发现了许多SNP。汉族人与少数民族在一些基因有SNP的差异。结论：自动双向测序法检测基因的SNP是直接、可靠和高通量的一种方法。     

以DNA测序及限制性酶切反应鉴定PCR产物特异性

目的：对PCR产物进行特异性鉴定。方法：采用DNA测序及限制性酶切反应方法。结果：DNA测序可排除PCR产物的假阳性。另一种简便易行的方法是，设计包含某一已知偏位性酶切位点的特异引物进行PCR，通过酶切反应及电泳分析鉴定其特异性。结论：此方法对PCR产物特异性鉴定十分必要。     

郑州地区汉族正常人群、糖尿病和糖尿病并发冠心病患者芳香酯酶Q192R基因多态性

目的：研究郑州地区汉族正常人群、2型糖尿病（DM）及DM并发冠心病（DM－CAD）患者芳香酯酶（Arylesterase/Paraoxonase,ArE/PON1)192位基因多态性。方法：用比色法测定郑州地区汉族正常人群（61例）、DM（60例）和DM－CAD（67例）患者血清Ar/PON1活性，用聚合酶链式反应分析技术检测ArE/PON1基因192位多态性，用酶法和酶联免疫法分别测定血清胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（HDLc)、氧化型低密度脂蛋白（oxLDL)等指标。结果：郑州地区汉族人群中存在有ArE/PON1192位基因多态性，Q、R基因频率健康人群中分别为0.56与0.44；DM组为0.53与0．47；DM－CAD组为0．38和0．62。DM－CAD组R基因频率高于DM组和对照组。基因型百分比DM－CAD组RR（31％）高于DM组（13％）和对照组（11％）（P＜0．05）。DM与DM－CAD组血清ArE/PON1活性水平低于对照组，以DM－CAD组为最低（P＜0．05）。酶活性的降低与HDLc、HDL2C呈正相关，与oxLDL呈负相关。结论：郑州地区汉族人群存在ArE/PON1 192位基因多态性，并提示R基因是郑州地区汉族人群DM－CAD的危险因素。     

IPO8基因启动子的克隆及转录活性分析

目的：克隆IPO8基因5'端非编码序列,探讨其转录活性。方法：应用cDNA 5'末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,5'CE)方法定位IPO8基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区包括转录起始点在 内的–3302 ~ +134区域分段进行PCR扩增,将产物克隆入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。经酶切鉴定后,将重组质粒与 内参质粒pRL-TK共转染人骨肉瘤细胞Saos-2,用双荧光素酶活性检测以确定其转录活性。结果：成功确定IPO8基因 转录起始位点,酶切结果证实IPO8基因5'端非编码区6条续减片段正确插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组 质粒转染Saos-2细胞后检测到荧光素酶的高表达(P<0.05)。结论：成功构建具有转录活性的IPO8启动子片段,为进一 步研究IPO8表达调控机制奠定了基础。     

冠心病患者对氧磷酶基因192位Gln-Arg多态性的研究

目的　探讨冠心病 (CHD)患者血脂改变是否与对氧磷酶 (PON)基因 192位 Gln- Arg变异有关。方法　应用多聚酶链反应 (PCR)对成都地区汉族 118例冠心病患者及 12 8例正常对照者 PON基因酶切位点的限制性片段长度多态性 (RFL P)进行研究。血脂用酶法测定。结果　 CHD患者和正常对照组 PON基因均以 QR基因型为主 ,其频率分别为 0 .5 78和 0 .5 2 5。正常对照组和 CHD组 PON基因 R等位基因频率分别为 0 .5 2和 0 .5 0 ,无显著差异 (P>0 .0 5 )。中国人 PON基因 R等位基因频率显著高于白种人及印度人 (P<0 .0 1) ,而低于日本人及中国台北人(P<0 .0 1) ,存在种族差异。结论　未发现 PON1基因 192位 Gln- Arg多态性与中国人 CHD有关联