大鼠骨髓细胞体外诱导分化神经细胞的演变规律

【目的】摸索从全骨髓诱导培养分化神经细胞的方法，并从神经巢蛋白(nestin)和神经核蛋白(NeuN)两种标记物上观察其分化的演变规律。【方法】抽取sD大鼠骨髓做全骨髓细胞培养，采用免疫细胞化学和荧光激活细胞计数仪(FACS)追踪由骨髓到神经元样细胞不同阶段nestin和NeuN的表达趋势，给予定性、定量分析。【结果】免疫细胞化学检测，细胞培养5d时对上述抗体呈弱阳性，逐渐增强，培养第15天细胞呈典型nestin强阳性反应，而NeuN强阳性反应在25～30d达到高峰，发育成为神经元样细胞。FACS同步追踪显示了nestin和NeuN在培养第5天时即有表达，前者3．4％，后者2．5％。随着骨髓细胞的分化，在15d时nestin阳性细胞为22．7％，达到高峰，随后下降。NeuN于30d达到高峰为41．2％，而此时nestin阳性细胞为5．9％。【结论】从神经干细胞和神经细胞特征性标记物演变探知骨髓细胞的分化发育规律；骨髓细胞可分化为神经细胞；骨髓源性神经前体细胞早期亦有nestin和NeuN的表达。     

大鼠骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓基质细胞（MSCs）体外诱导分化为神经细胞的可行性,为MSCs移植治疗缺血性脑血管病提供实验依据.方法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞,应用bFGF进行预诱导,然后用ATRA和NGF来诱导骨髓基质细胞,观察细胞的形态变化,用免疫组化法检测细胞的NSE和GFAP的表达.结果大鼠MSCs经ATRA和NGF诱导后,细胞的形态发生改变,免疫组化显示部分细胞表达NSE和GFAP.结论骨髓基质细胞可被ATRA和NGF在体外诱导分化为神经细胞和胶质细胞.     

大鼠骨髓细胞体外诱导分化神经细胞的演变规律

[目的] 摸索从全骨髓诱导培养分化神经细胞的方法,并从神经巢蛋白(nestin)和神经核蛋白(NeuN)两种标记物上观察其分化的演变规律.[方法] 抽取 SD大鼠骨髓做全骨髓细胞培养,采用免疫细胞化学和荧光激活细胞计数仪 (FACS)追踪由骨髓到神经元样细胞不同阶段 nestin和 NeuN的表达趋势,给予定性、定量分析.[结果] 免疫细胞化学检测,细胞培养 5 d时对上述抗体呈弱阳性,逐渐增强,培养第 15天细胞呈典型 nestin强阳性反应,而 NeuN强阳性反应在 25～ 30 d达到高峰,发育成为神经元样细胞. FACS同步追踪显示了 nestin和 NeuN在培养第 5天时即有表达,前者 3.4%,后者 2.5%.随着骨髓细胞的分化,在 15 d时 nestin阳性细胞为 22.7%,达到高峰,随后下降. NeuN于 30 d达到高峰为 41 2%,而此时 nestin阳性细胞为 5.9%.[结论] 从神经干细胞和神经细胞特征性标记物演变探知骨髓细胞的分化发育规律;骨髓细胞可分化为神经细胞;骨髓源性神经前体细胞早期亦有 nestin和 NeuN的表达.     

骨髓细胞多向分化潜能的初步研究

目的：探讨骨髓细胞在受致死剂量照射的受体鼠体内的多向分化潜能。方法：将C57－TgN(Mx-cre)雄性小鼠的骨髓细胞经尾静脉植入受致死剂量照射的雌性受体鼠，重建受体鼠骨髓，然后分别用PCR和免疫组化分析检测受体鼠的多个器官组织中sry及Mx-cre基因的分布及表达情况。结果：PCR和免疫组化分析结果均显示，供体细胞的两个标志sry及Mx-cre在受体鼠的肝脏，肾脏，皮肤，脾脏等多个器官中都有表达。结论：骨髓细胞不仅可以重建受致死剂量照射受体鼠的造血系统，而且具有分化为肝脏，肾脏，皮肤，脾脏等组织细胞类型的多向潜能性。     

胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨胚胎干细胞（ＥＳ）向神经细胞定向分化发育的可能性。方法 ＥＳ－Ｄ３在无小鼠白血病抑制因子（ｍＬＩＦ）存在的条件下培养ＥＳ细胞４ｄ,形成ＥＳ集落（即胚胎样小体）,经胰酶消化打散后种植于粘附性培养皿上。结果 上述细胞表达ＭＡＰ－２和ＧＦＡＰ蛋白。ＲＴ－ＰＣＲ分析进一步证明这些细胞能表达γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）γ亚单位和酷氨酸羟化酶以及脑因子－１神经相关基因。结论 ＥＳ细胞在体外能有效地被诱导成具有多种神经元特性的神经样细胞,可为神经移植提供源源不断的材料。     

大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经细胞的研究

①目的 探讨大鼠骨髓基质细胞体外向神经细胞分化的特性。②方法 大鼠的骨髓基质细胞传代培养4代后，以成纤维细胞生长因子（bFGF）及β-巯基乙醇预诱导24小时，再以β-琉基乙醇、二甲基亚砜和3-叔丁基4-羟基茴香醚联合进行正式诱导6小时。诱导后的细胞采用免疫组化法进行鉴定。③结果 诱导后大鼠骨髓基质细胞神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达率分别为84．13％和4．27％。④结论 G-巯基乙醇、二甲基亚砜和3-叔丁基4-羟基茴香醚可以促进大鼠骨髓基质细胞向神经元和神经胶质细胞分化。     

黄芩甙诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的研究

目的　探讨中药单体黄芩甙体外诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞的可行性。方法　以黄芩甙作为主要诱导剂 ,诱导成年大鼠骨髓基质细胞 6d。采用免疫细胞化学染色、蛋白质印迹 (WesternBlot)、逆转录PCR(RT PCR)法检测神经细胞、胶质细胞标记蛋白和mRNA的表达 ;原位末端标记染色评价细胞凋亡率 ;绿色荧光蛋白转染后 ,进行同种异体脑移植 ,观察诱导后细胞在脑内存活情况。结果　黄芩甙诱导 6d后 ,骨髓基质细胞形成较典型的神经细胞形态。诱导前骨髓基质细胞不表达神经细胞、胶质细胞标记蛋白和mRNA ;诱导 6h ,nestin出现暂时表达 ,诱导 6d表达神经细胞标记蛋白和mRNA ,不表达胶质细胞标记蛋白和mRNA。细胞凋亡率为 12 2 %± 2 8%。同种异体脑移植 14d ,移植物存活良好。结论　黄芩甙可以定向诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞。     

骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质细胞是一类起源于骨髓中支持结构的细胞,在适当的实验条件下能分化为神经细胞,为细胞移植以及中枢神经系统功能重建和神经再生提供了新的途径。目前体外诱导MSCs向神经细胞分化的方案主要有化学试剂单独诱导、生长因子单独诱导及化学试剂和生长因子联合诱导,其中两种诱导剂联合诱导的效果较好。MSCs向神经细胞分化的研究已取得了一些成果,但仍存在许多问题,如MSCs的鉴定、MSCs向神经细胞诱导分化模式和分子调控机制等。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的：对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs）进行分离、培养与鉴定,并探讨全反式维甲酸（retinoic acid,RA）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,basic, bFGF）和表皮生长因子（ epidermal growth factor , EGF ）联合诱导BMSCs分化为神经细胞的可行性。方法全骨髓贴壁法分离培养BMSCs ,观察细胞形态及生长增殖情况;流式鉴定细胞表面标志物CD29、CD34、CD90;选用第3代细胞,经RA、bF-GF和EGF联合诱导后,细胞免疫化学染色检测神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（ neuron specific enolasen , NSE）的表达。结果体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,第3、4、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。 BMSCs的均一性较好,第3代细胞CD29、CD90阳性率均在90％以上,而CD34阳性率仅为0．58％;BMSCs经诱导后分化为神经细胞,并表达神经细胞标志NSE。结论成功建立BMSCs 的体外培养体系,所得细胞纯度高、生物学特征稳定,并可诱导分化为神经细胞,为移植治疗神经系统损伤提供实验基础。     

骨髓间充质干细胞培养及向神经细胞诱导分化的实验研究

目的：体外培养骨髓间充质干细胞(BM—MSC)，诱导BM—MSC向神经细胞分化。方法：采用DMEM培养液加胎牛血清(DMEM／FBS)或无血清培养基体外培养人BM—MSC，测定细胞倍增时间；免疫组织化学法分析BM—MSC的表面标记；纤维母细胞集落形成(CFU—F)试验检测BM—MSC增殖能力；应用二甲基亚砜／羟丁苯甲酯(DMS0／BHA)化学因子诱导BM—MSC向神经细胞分化。结果：BM—MSC为单层贴壁生长，呈现规则的集束辐射状排列。在对数生长期，细胞倍增时间约为46h。CFU—F试验表明，体外培养的MSC的集落形成能力为正常骨髓单个核细胞(MNC)的15000倍以上。免疫组化分析表明，BM—MSC为CDl3和CDl05阳性，CD34阴性。DMS0／BHA化学因子能诱导BM—MSC分化为神经细胞，但是分化后即失去增殖能力，并于48h后逐渐死亡。结论：通过体外培养可以获得大量高度均一的BM—MSC。BM—MSC可向神经细胞诱导分化，但尚缺乏实际应用的可能性。     

人骨髓间充质干细胞向Leydig细胞或产类固醇激素细胞体外诱导分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向睾丸Leydig细胞分化,并确定诱导条件。方法将分离培养所获得的第3代MSCs细胞经含黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血小板衍化生长因子(PDGF)及白介素-1α(IL-1α)的诱导液诱导,按诱导液中各因子浓度不同分为A、B、C组和对照组,分别于7d、14d、21d时观察细胞形态变化,并行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫细胞化学染色和免疫荧光染色,检测各组细胞3β-HSD的表达。以人睾酮ELISA试剂盒检测诱导细胞分泌类固醇的功能情况。结果诱导10～14d后,细胞具有Leydig细胞的形态特点;免疫细胞化学染色及免疫荧光染色显示,本研究条件下,随着诱导液中各因子浓度加大及诱导时间延长,诱导细胞3β-HSD表达阳性数和阳性率逐渐增多,以A组浓度及21d为最佳诱导浓度及时间(P<0.05),并且A组诱导21d分泌睾酮量最高(P<0.05)。结论人骨髓MSCs经体外诱导后可以分化为Leydig细胞或产类固醇细胞。     

全反式维甲酸联合细胞因子诱导无血清培养的骨髓基质干细胞向神经细胞分化

目的研究全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子等细胞因子联合诱导体外无血清培养的骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经细胞分化的作用。方法用含2%Utroser G的UltraCULTURE无血清培养体系体外扩增大鼠BMSCs，免疫细胞化学染色鉴定其表面标志，用以全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子为主要成分的复合诱导液诱导BMSCs向神经细胞方向分化，镜下观察细胞形态学变化，用抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体和抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体进行免疫细胞化学染色鉴定诱导后的神经细胞。结果经全反式维甲酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合诱导后的BMSCs表现为神经细胞形态特征，诱导后的细胞可存活14 d以上，免疫细胞化学染色显示NSE和GFAP均有阳性表达，前者阳性率为65.6%，后者阳性率为12.5%。结论全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合应用可在体外高效、稳定地诱导无血清培养的BMSCs分化为神经细胞。     

人骨髓干细胞分离及其向神经细胞诱导分化的实验研究

目的研究骨髓间充质细胞向神经样细胞诱导分化的能力,探讨利用其治疗神经损伤疾病的可行性。方法采用直接分离培养法从人骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术对其细胞特性进行鉴定,化学诱导法诱导其向神经样细胞分化,免疫组化技术验证诱导细胞特性。结果成功获得骨髓间充质干细胞,免疫表型鉴定结果为CD73、CD90、CD105表达阳性,CD14、CD34、CD45表达阴性;免疫组化染色显示诱导分化的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、GFAP和成熟神经元标志物NSE等。结论骨髓间充质细胞在特定诱导因子作用下能向神经细胞表型转化,并能稳定表达神经细胞因子,可以作为神经损伤疾病组织工程的种子细胞来源。     

体外定向诱导人骨髓基质干细胞内皮化

目的 探索体外定向诱导人骨髓基质干细胞(human bone marrow stromal cell，hMSC)内皮分化的潜能与条件。方法 采用含多种生长因子的内皮细胞支持液EGM2-MV(Cloneties)作为体外内皮化诱导剂，观察形态学和细胞表面免疫标志的变化，研究hMSC体外内皮化的条件和诱导效果。结果 经25％EGM2-MV诱导后，细胞生长良好，在多种生长因子的刺激下，原先长梭形的细胞缩短，出现鹅卵石样形态。诱导培养10d后，经流式细胞学检测，内皮干细胞标志CD133阳性率明显升高，基质干细胞标志CD106阳性率下降。结论 hM-SC具有向血管内皮细胞分化的潜能。利用含有多种生长因子的内皮细胞支持液EGM2-MV，可在体外诱导hMSC向内皮细胞分化。本研究为利用自体MSC移植重建心脏血运提供实验依据。     

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法：选取2月龄约2．5kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果：全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论：全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。     

骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨大鼠骨髓间充质干细胞 ( rat mesenchymal stem cells,r MSCs)体外诱导分化成神经元的能力。方法 :用 0 .2 5、0 .5、1 .0 mmol· L-1IBMX诱导传代的 r MSCs,待细胞分化后进行形态学观察 ,并用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定。结果 :0 .5 mmol· L-1IBMX诱导细胞效果最好 ,2 d即可见有神经元样细胞出现 ,6d神经元样细胞占细胞总数的 ( 2 3.2± 2 .3) %,NSE染色阳性。未分化细胞表达 nestin,诱导 3d,阳性细胞增多 ,6d减少。结论 :体外 r MSC能扩增、传代 ,并被诱导分化成神经元样细胞     

人胚胎骨髓基质干细胞的长期培养及体外成骨特性

研究了人胚胎骨髓基质干细胞(hBMSCs)在体外长期培养时的基本特性和向成骨细胞的分化能力。结果表明：前三代hBMSCs多数呈长梭形,生长快速,增殖能力强;而后几代细胞变得比较扁平,生长缓慢,增殖能力下降;至第六代,细胞已失去增殖能力。每一代细胞生长均分为延滞期、对数生长期和稳定期,延滞期一般为6～7d,对数生长期为4～5d,最后是稳定期。前三代细胞对数生长期的群体倍增时间(PD71)基本相同,而第四代细胞的PDT略有上升,第五代细胞的PDT最大。在体外扩增能力方面,前三代细胞均可以扩增18倍左右,而第四、第五代细胞则下降至11倍、5倍。实验结果表明扩增后的细胞经过诱导可以形成钙化小结,与未诱导细胞相比碱性磷酸脂酶(ALP)活性显著提高。