CD112(Nectin2/PRR2)在结肠癌的表达及其临床意义

目的:研究NK细胞活化性受体CD226(DNAM-1)的配体CD112(nectin-2)在结肠癌细胞系中的表达情况,检测结肠癌组织中CD112的表达,分析其与临床病例组织病理分级的关系.方法:流式细胞术(FCM)及Western blot检测结肠癌细胞系(Colo205、SW116、SW480)上CD112的表达情况.以免疫组织化学法检测90例结肠癌组织和30例正常结肠组织对照中CD112的表达情况.结果:FCM检测CD112在Co-lo205、SW116和SW480结肠癌细胞系的阳性表达率分别为99.3%、47.1%和98.7%.CD112在结肠癌组织中其阳性表达率为42.35%,在正常结肠组织对照中阳性表达率为10%,两组之间的阳性表达率差异有统计学意义(P=0.001).不同分化程度、不同Dukes分期结肠癌组织之间CD112的阳性表达率差异无统计学意义(P=0.997、P=0.777);CD112阳性表达强度与分化程度和Dukes分期之间无相关性(r=0.006、r=-0.032).结论:CD112在结肠癌组织中表达高于正常对照组织,有统计学意义.在结肠癌细胞系表达较高.可以试图通过基因转染上调结肠癌组织中CD112的表达强度,利用CD112与NK细胞活化性受体CD226结合,活化NK细胞并启动NK细胞对结肠癌的杀伤作用,为结肠癌临床免疫治疗提供思路和理论依据.     

人SUMO1蛋白表达纯化及单克隆抗体的制备、鉴定

目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究.     

人CD81胞外区EC2基因的克隆和原核表达

CD８１是一种跨膜的非糖基化蛋白。在人类和黑猩猩中,CD８１胞外区EC２区氨基酸序列高度保守。CD８１可影响细胞的粘附、激活、增殖和分化,改变细胞形态及抑制合胞体形成等生物学功能〔１〕。近年研究发现,CD８１可能作为HCV的受体引导病毒进入细胞内〔２〕。进一步研究发现,CD８１胞外区EC２是CD８１与HCVE２相互作用的部位,是HCV感染的关键因素〔３〕。目前,CD８１的功能及作用机制尚有待进一步研究,我们采用分子生物学技术,构建了CD８１胞外区EC２原核表达载体,为今后进一步研究CD８１与HCV感染的关系奠定了基础…     

鼠抗人CD20单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备CD20融合蛋白及制备CD20的单克隆抗体(mAb),并对其进行特性鉴定.方法:以人单核细胞cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX- 4T-1-CD20 (即CD20-GST) 和pET-32a-CD20(即CD20-His).以融合蛋白CD20-GST为免疫源免疫BALB/c雌性小鼠制备(mAb),用间接ELISA法测定抗体的效价,Western blot、免疫荧光鉴定其特异性及免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位.结果:CD20-GST 和CD20-His蛋白在大肠杆菌中可高效表达,经纯化后可获得高纯度的CD20蛋白,经细胞融合得到1株稳定分泌CD20抗体的杂交瘤细胞株,Western blot和免疫组化显示抗CD20 mAb与CD20蛋白具有良好的反应性.结论:成功制备高纯度CD20蛋白并以此为抗原制备了1株能够稳定分泌抗人CD20的鼠mAb的杂交瘤细胞株BD11F4,为进一步研究CD20对非霍奇金淋巴瘤的诊断治疗提供基础.     

小鼠抗NLRP3单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备小鼠抗含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)的单克隆抗体(mAb)并检测其特异性。方法 将编码小鼠NLRP3基因外显子3(Ms-N3)的基因片段插入载体p36-G3-throhFc中构建重组质粒Ms-N3-throhFc,然后将该质粒转染到HEK293F细胞中,进行真核蛋白表达。进一步利用蛋白A亲和层析柱纯化得到Ms-N3蛋白并免疫NLRP3基因敲除(NLRP3^-/-)小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。进而通过ELISA和免疫荧光方法筛选能够分泌特异性识别小鼠NLRP3的mAb的杂交瘤细胞。结果 成功构建Ms-N3-throhFc重组质粒并证明该质粒能在HEK293F细胞中稳定表达。ELISA初步筛选获得12株杂交瘤细胞,经过免疫荧光实验检测发现其中的9-B8-3-2-C5分泌的mAb能够特异性识别非变性的小鼠NLRP3蛋白,该mAb的重链亚型为IgM,轻链亚型为κ。结论 成功获得小鼠抗NLRP3 mAb。     

抑制和激活蛋白1(Rap1)单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备并鉴定人端粒相关蛋白抑制和激活蛋白1(Rap1)的单克隆抗体。方法用重组原核人Rap1蛋白免疫BALB/c小鼠;细胞融合后,间接ELISA筛选阳性杂交瘤,建立分泌抗人Rap1蛋白单克隆抗体(m Ab)的杂交瘤细胞株,并进行效价测定和特异性鉴定。结果制备并获得1株稳定分泌抗人Rap1蛋白m Ab的杂交瘤细胞株。ELISA测定腹水效价高达1∶10 000以上。Western blot法、免疫沉淀和免疫荧光染色证实该m Ab能特异性识别人Rap1蛋白并可用于上述不同检测。结论成功制备获得了亲和力高、特异性好的抗人端粒相关蛋白Rap1的m Ab。     

小鼠抗人肿瘤抑制素2(ST2)单克隆抗体的制备及应用

目的 制备针对人肿瘤抑制素2(ST2)的小鼠源性单克隆抗体,并进行功能和应用的初步鉴定.方法 用真核表达的重组人ST2分子免疫BALB/c小鼠,利用常规B细胞杂交瘤技术制备抗ST2单克隆抗体,并鉴定其在Western blot法、免疫组织化学染色和流式细胞术中的应用价值;建立检测可溶性ST2的夹心ELISA,检测热射病...     

HCA518的蛋白表达、纯化和单克隆抗体的制备

目的:对HCA518蛋白进行表达和纯化,并制备HCA518蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在原核系统表达HCA518蛋白,金属镍螯合的Ni-NAT亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA方法进行单克隆抗体细胞株的筛选;Westem blot方法鉴定单克隆抗体的特异性;免疫荧光法对HCA518蛋白进行定位。结果:成功表达和纯化了HCA518重组蛋白,其纯度达98％。共筛选出2株分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了HCA518的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体的效价分别为1×10-4、5×10-4,属于IgG2b亚型和IgM,该抗体能与重组蛋白和肿瘤细胞核蛋白(P100)发生特异性反应,免疫荧光显示HCA518蛋白主要定位于细胞核中。结论:建立了稳定分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体特异性好,对进一步应用于检测肿瘤组织中HCA518蛋白和判断肿瘤细胞的恶性增生程度预测肿瘤预后具有重要的实用价值。     

LAIR-1/LAIR-2(CD305/CD306)推定配体分布的研究

目的：研究LAIR-1（CD305）及LAIR-2（CD306）推定配体在多种细胞系上的分布，为鉴定LAIR-1／LAIR-2推定配体提供了实验依据。方法：建立稳定表达LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白的细胞系。以纯化的融合蛋白进行活细胞免疫荧光染色，用流式细胞仪检测LAIR-1及LAIR-2推定配体在多种细胞系膜表面的表达，并比较LAIR-1和LAIR-2推定配体的分布及可能结合的位点。结果：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体均在人羊膜来源的上皮细胞系WISH上高表达，在人黑色素瘤细胞系C32、人胚肾上皮细胞系293T及人脐静脉内皮细胞系ECV304上有一定程度的表达。LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白与推定配体的结合，可分别被可同时识别LAIR-2和LAIR-1的单克隆抗体（mAb）FMU-LAIR-2．2和FMU-LAIR-2．1阻断。结论：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体的分布基本一致，主要表达于WISH、C32、293T和ECV304细胞系。LAIR-1和LAIR-2可能拥有共同的配体。     

纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物单克隆抗体的制备及鉴定

目的 :制备纤溶酶 α2 抗纤溶酶复合物 (PAP)的单克隆抗体(mAb)。方法 :以从血浆中纯化的PAP免疫BALB/c小鼠。按常规方法融合 ,以固相等分子浓度的纤溶酶原、α2 抗纤溶酶(α2 AP)及PAP为抗原 ,建立间接ELISA筛选杂交瘤细胞培养上清 ,并对杂交瘤细胞分泌的mAb的特异性和亲和力进行鉴定。结果 :共获得 2 4株可稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞。其中 ,针对PAP分子中纤溶酶结构的mAb 16株 ,针对α2 AP结构的mAb 1株 ,针对新抗原 (PAP分子中新出现的不同于前体分子纤溶酶原及α2 AP的抗原决定簇 )结构的mAb 7株。这些腹水中抗PAPmAb的滴度为 2× 10 -4～ 1× 10 -8,其中 4株mAb的亲和常数为 5 .6 2× 10 -9～ 3.5 8× 10 -11mol/L之间。结论 :成功地制备针对PAP新抗原的具有高亲和力的mAb ,为建立不受其前体分子干扰的PAP特异性检测方法 ,研究纤溶系统的激活状态提供了工具。     

抗人RANTES分子单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗人RANTES分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定,为研究RANTES分子的组织分布和功能提供实验手段。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,制备小鼠源性抗人RANTESmAb。用ELISA法鉴定腹水mAb的效价。用Q FastFlow阴离子交换柱纯化mAb。用Westernblot鉴定mAb的抗原结合活性。用免疫组化染色法,对RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠移植肠组织中的分布进行鉴定。结果:获得4株分泌抗RANTESmAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6,3株mAb为IgG1亚类(κ),1株为IgG2b(κ)。Westernblot的结果显示,3株mAb与人RANTES均有良好的结合活性。用3株mAb进行免疫组化染色的结果显示,RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠小肠腺上皮细胞胞质中呈高表达。结论:获得4株能特异性识别天然RANTES分子的mAb。大鼠小肠移植后其肠上皮细胞中可高水平地表达RANTES。     

抗人CD100单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：研制可识别天然CD100分子的单克隆抗体（mAb)。方法：采用真核表达的CD100分子免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤，并分别用人急性T淋巴细胞性白血病细胞系MOLT-4，猿T淋巴细胞系MLA-144及猴EB病毒转化的B淋巴细胞系（BLCL），进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。结果：共获得7株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。所有mAb均可识别人和猴细胞系的膜表面天然CD100分子，其中6株可识别猿细胞系膜表面的天然CD100分子，结论：成功地制备了7株抗CD100分子的特异性mAb。为研究人和猿，猴CD100分子的结构与功能提供了新的手段。     

抗大鼠Nogo分子单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：制备抗大鼠Nogo分子单克隆抗体(mAb)，为研究Nogo分子的组织分布和功能提供实验手段。方法：应用淋巴细胞杂交瘤技术制备小鼠源性抗大鼠Nogo mAb。用免疫荧光组织化学技术，对Nogo分子在大鼠中枢神经系统(CNS)的分布进行鉴定。结果：获得3株分泌抗Nogo mAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA测定腹水效价达10^-6，两株mAb为IgG1(κ)亚类，另一株为IgG2b(κ)，在免疫荧光组织化学技术应用中获得较满意效果。结论：获得3株能特异性识别天然Nogo分子的mAb，为进一步研究Nogo分子的结构和功能奠定了基础。     

抗丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2,PDC-E2)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果 获得1株可稳定分泌抗人PDC-E2 mAb 的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ), 该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化和免疫沉淀实验.结论 成功制备了抗人PDC-E2的mAb,为PDC-E2的研究提供了有力的工具.     

抗人跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子单克隆抗体的制备

目的：制备抗人跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(TACI)单克隆抗体(mAb)，研究TACI分子的细胞分布。方法：应用淋巴细胞杂交技术制备鼠源性抗TACI mAb。用免疫荧光染色、流式细胞术及免疫组织化学染色法，对TACI在外周血单个核细胞(PBMC)上的分布进行鉴定。结果：获得两株分泌抗TACI mAb的杂交瘤细胞株。mAb的腹水效价达10^-7，均为IgGl亚类，可识别T细胞表面天然的TACI分子，在PHA活化的模型中，TACI主要表达于活化的CD4^ T细胞上。结论：获得两株能特异性识别天然TACl分子的mAb，为进一步研究TACl分子的结构和功能奠定了基础。     

抗人SSX2分子单克隆抗体的制备及初步应用

目的　制备抗滑膜肉瘤X断点 2 (Synovialsarcoma,Xbreakpoint2 ,SSX2 )分子的单克隆抗体 ,探讨SSX2的组织分布及其与肿瘤的关系。方法　应用淋巴细胞杂交瘤技术制备小鼠源性抗人SSX2mAb。应用间接ELISA测定腹水效价 ,间接免疫荧光胞内染色检测抗体与肿瘤细胞系的反应性。用酶免疫组织化学技术 ,对SSX2分子在人正常睾丸组织和直肠癌组织的分布进行了鉴定。结果　获得 1株分泌抗SSX2mAb的杂交瘤细胞株LX SSX2 ,间接ELISA测定腹水效价达 1× 10 - 5,为IgG1(κ)亚类 ,能识别K5 6 2胞内天然及变性SSX2分子。在酶免疫组织化学技术应用中获得较满意效果 ,SSX2分子表达于睾丸精原细胞的细胞核内 ,并在直肠癌标本中检出到SSX2的表达。结论　LX SSX2mAb有很好的特异性 ,为进一步研究SSX2分子的分布及其与肿瘤的关系奠定了基础     

鼠抗人内皮抑素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人内皮抑素的单克隆抗体(mAb),为深入研究内皮抑素的作用机制提供一种有用的试剂。方法:以毕赤酵母表达的内皮抑索为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,以间接ELISA法筛选分泌抗人内皮抑素的特异性mAb的杂交瘤细胞株,并诱生腹水。腹水中的mAb采用 Protein A Sepharose CL-4B进行纯化。以标准的抗Ig血清做ELISA,鉴定mAb的Ig类、亚类及型;用免疫印迹法鉴定mAb的特异性。结果:获得1株可分泌抗人内皮抑素mAb的杂交瘤细胞株4E7,该株杂交细胞分泌的mAb属于IgGl(λ型)。腹水mAb的效价为1×10-4-1×10-6,纯化后大于1×10-10。免疫印迹结果显示,mAb 4E7可特异性地与酵母及大肠杆菌表达的内皮抑素起反应,而与bFGF等其他细胞因子不发生交叉反应。结论:分泌抗人内皮抑素mAb杂交瘤细胞株的建立,为进一步研究奠定了基础。     

抗重金属Cr3+单克隆抗体的制备及其应用

目的:制备重金属Cr3+的单克隆抗体(mAb)并建立间接竞争ELISA法,用于Cr3+的检测。方法:用合成的重金属铬-螯合剂-BSA抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆化和ELISA等技术建立杂交瘤细胞株;腹水型mAb经硫酸铵沉淀纯化后建立间接竞争ELISA法并与9种金属进行交叉实验;水样加标后,进行间接竞争ELISA法与ICP-AES法检测Cr3+的比较,计算两种方法符合率。结果:获得3株稳定分泌抗重金属Cr3+mAb的杂交瘤细胞株,其中5G12C5株mAb间接ELISA效价>1∶1×105,间接竞争ELISA法检测Cr3+的范围为0.783~50μg/L,最低检测限为1μg/L,与Fe3+存在<10%交叉,而与其他金属无交叉反应;当水样中加标量>1μg/L时,间接竞争ELISA法与ICP-AES法检测Cr3+的符合率达96.95%。结论:获得效价高、特异性强的重金属Cr3+mAb,初步建立了检测Cr3+的间接竞争ELISA法,该方法检测的灵敏度可达到国家地下Ⅰ类水的检测标准(0.005 mg/L)。     

抗rhNDPK-A单克隆抗体的制备及鉴定

目的 :研制抗rhNDPK A (recombinanthumannucleosidediphosphatekinase A)单克隆抗体 (mAb) ,并鉴定其特性。 方法 :以纯化的rhNDPK A免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备抗rhNDPK AmAb ;用免疫双扩散鉴定Ig亚类 ;West ernblot鉴定mAb的特异性 ;间接ELISA检测mAb的腹水效价、亲和常数 ,并进行表位分析。结果 :获得 6株可分泌特异性mAb的抗rhNDPK A的杂交瘤细胞系 2D9、8C7、13E2、15D9、15E3和 2 0D9,Ig亚类均为IgG1;其效价为 1× 10 -4～5× 10 -6;亲和常数为 4 .5× 10 -9～ 2 .8× 10 -10 mol/L ;共有3个抗原表位。结论 :获得抗rhNDPK A的mAb ,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件