肝肾移植术后受者人巨细胞病毒两种检测方法的对比研究

目的:探讨巢式PCR(Nest PCR)检测器官移植术后受体人巨细胞病毒(HCMV)DNA,并与传统ELISA法作方法学对照。方法:巢式PCR针对HCMV AD169株IEA基因设计内外两对引物,对59例肝、肾移植术后受体(肝移植27例、肾移植32例)血、尿标本进行HCMV DNA检测。分离血清作EIASA检测IgG、IgM。结果:血液Nest PCR阳性率肝移植62.9％,肾移植46.8％;ELISA法阳性率:IgC35.5％,IgM27.1％,IgG+IgM18.6％,IgM阳性标本(16例)DNA检测皆为阳性,6例IgG、IgM皆阴性标本DNA检测仍为阳性。两法检测,P<0.05,证明两法存在显著差异,结论:巢式PCR是一种敏感特异、简便快速诊断HCMV感染的方法,灵敏度及特异性高于传统ELISA,能弥补ELISA的假阴性,更适用于临床检测器官移植术后HCMV感染。     

辣根过氧化酶直接标记人巨细胞病毒DNA探针的制备和临床应用

用活化或根过氧化酶复合物直接标记人巨细胞病毒（HCMV）DNA特异片段制备酶标基因探针。与靶DNA杂交后酶催化检测系统中相应的发光剂，再经增强剂作用将光信号放大，杂交信号通过X光自显影。经决缝杂交证明该法标记的基因探针可检测到0．2Pg的同源DNA，且仅与HCMVDNA杂交，与HSV-1、EBV及正常人DNA不杂交。用此探针检测42例巨细胞包涵体（CID）患儿和20例正常同龄儿童尿中HCMVDNA，阳性率分别为550％和35％。与病毒分离相比较，杂交法敏感性为92．3％，符合率为87．1％，临床标本检出率高于病毒分离法，表明用HRP直接标记基因深外经化学发光自显影检测HCMVk安全、快速、敏感和特异的方法，适用于临床诊断和研究。     

巢式聚合酶链反应检测幽门螺杆菌方法的建立及临床初步应用

在ＨＰ高度保守的尿素酶Ａ基因内合成两对引物，建立了巢式聚合酶链反应（Ｎ－ＰＣＲ）检测ＨＰＤＮＡ的方法，实验证明有很高的特异性和敏感性，与其它４株肠道菌无交叉反应，最小检出量为１ｆｇＨＰＤＮＡ。对Ｎ－ＰＣＲ反应体系中有关实验条件如Ｍｇ￣２＋浓度、引物浓度、复性温度等进行优化选择，并对酚／氯仿提取法和裂解粗提法两种标本处理方法进行了比较。用建立的Ｎ－ＰＣＲ检测３０例有上消化道症状患者的唾液及８例胃组织标本中ＨＰＤＮＡ，结果阳性率分别为５６．６７％和６２．５０％，５例胃组织标本阳性患者中４例唾液标本亦阳性。实验表明Ｎ－ＰＣＲ是一种敏感特异的检测方法，可用于唾液等标本中ＨＰ的检测。     

RT—nestedPCR和限制性酶切分析用于HV的检测和基因分型

为建立检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清中汉坦病毒（HV）基因的RT－nestedPCR方法，并进行进一步进行限制性酶分型，设计并合成互补HV S基因片段的引物，对78例HFRS患者血清进行RT－nestedPCR检测，并对PCR产物进行酶切分析，结果显示，阳性率分别为76%（≤7天）、67％（8－14天）、43％（15－21天）和295（＞21天）。48例检测阳性患者PCR产物酶切物酶切分型，47例，Ⅰ型，1型Ⅱ型。提示RT－nestedPCR用于早期HFRS患者的HV基因，具有直接、敏感、特异等优点，其产物的限制性酶切分型能快速准确地区分国内当前流行的主要HV毒株型别。     

基于颜色判定的DNA环介导恒温扩增法快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立基于颜色判定的DNA环介导恒温核酸扩增法（100p—mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP）快速检测金黄色葡萄球菌（SAU）技术。方法利用LAMP法针对SAU特异基因rtUC基因设计7套引物,通过对7套引物扩增效率进行比较得到最佳引物组合来快速检测SAU,采用两种结果判断方法在50min内完成反应。结果LAMP方法检测核酸的最低浓度为7．16pg／μl,灵敏度为PCR法的10倍（PCR法为71．6pg／μ1）,同时采用22种同源或相似菌种进行特异性检测,结果表明具有良好的特异性。结论LAMP方法检测过程简单,实验装置简便,反应结果肉眼可视化辨别,灵敏度高,特异性强,特别适合基层防疫与检疫部门对SAU的快速检测。     

聚合酶链反应—酶谱法分型检测人疱疹病毒DNA方法的建立及应用研究

在疱疹病毒高度同源序列DNA聚合酶基因中设计一对引物，能对HSV－Ⅰ、HSV－Ⅱ、EBV和CMV4种疱疹病毒DNA进行扩增，继而用凝胶电泳和限制性内切酶BarnHⅠ或SmaⅠ酶切分析扩增产物进行鉴别，建立了能一次性分型检测上述4种病毒的POR－酶谱法。敏感性和特异性试验表明，灵敏度可测到1fgDNA，相当于6个病毒颗粒，且引物仅对4种疱疹病毒扩增。对影响PCR效果的有关因素如Mg2＋浓度、引物浓度、循环参数等进行了优化选择。用建立的PCR－酶谱法检测病毒性脑炎患者脑脊液和慢性宫颈炎患者宫颈分泌物中的疱疹病毒，取得较好结果。本方法的建立为疱疹病毒感染的临床早期准确诊断、药物疗效考核和流行病学研究等提供了有效的手段。     

耐万古霉素肠球菌检测基因芯片方法的建立和验证

目的：基于基因芯片技术建立一种能快速甄别粪肠球菌、屎肠球菌及万古霉素耐药基因的检测方法。方法根据GenBank中查找的2种常见肠球菌特异性基因序列（ ddl）及万古霉素耐药基因（ vanA,vanB）序列,设计与合成用于检测肠球菌的特异性基因及耐药基因的引物和探针,制备耐万古霉素肠球菌（VRE）检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的特异性基因与耐药基因片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光法显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光法检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏性和重复性。结果共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条细菌通用探针、4条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性和重复性,灵敏性可达103 CFU／ml。10例临床分离株样本的芯片检测结果与药敏实验基本一致（8／10）。结论初步建立了检测VRE的基因芯片方法,利用此方法可以甄别2种VRE种类并检测其耐药基因。     

SARS患者SARS冠状病毒RNA的动态检出特点及其意义

目的 观察SARS患者各种临床标本的带毒状况,分析SARS冠状病毒(SARS-CoV)在患者体内的动态变化及其临床意义。方法设计针对SARS-CoV区和N区的2套引物,应用巢式RT-PCR对84例SARS患者的血、尿、痰、粪便、咽拭子等494份不同发病时间收集的标本进行病毒定性检测,并将PCR产物直接进行DNA序列分析。结果两套引物均能较好地扩增出部分标本SARS-CoV基因的特异性片段。在所有标本中痰液阳性检出率最高,联合检测多种标本或同时应用两套引物进行PCR扩增可明显提高标本阳性检出率。跟踪观察发现,SARS患者发病第2周时PCR阳性检出率最高,第3～4周次之,但各种标本阳性检出率的动态变化不尽相同。结论应用巢式RT-PCR进行SARS早期诊断和检测是一种可行的方法,针对SARS-CoV基因组不同区域设计多对引物,联合检测多种临床标本可明显提高阳性检出率;研究SARS-CoV的检出变化特点将为SARS的临床治疗提供一定的依据。     

聚合酶链反应快速检测胃组织和唾液中的幽门螺杆菌

针对幽门螺杆菌（HP）尿素酶A基因设计一对引物进行聚合酶链反应，检测1株HP标准株和7株临床分离株均阳性，而4株其它肠道菌均阴性，特异性100％。10倍系列稀释试验表明敏感性达到100pgDNA水平。从35例胃镜检查者取幽门旁组织块进行快速和常规尿素酶试验，细菌培养及PCR检测，15例HP阳性者PCR检测也为阳性，其中7例阳性者有3例唾液PCR检测为阳性，表明HP确存在于口腔中。本研究采用直接热裂解法处理临床标本，取其粗提物行PGR免除复杂的酚-氯仿抽提步骤，该法简便快速，且损失小，成功率高，在临床实验诊断中有推广价值。     

酶谱法分型检测人疱疹病毒DNA方法的建立及应用

单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型(HSV-Ⅰ,HSV—Ⅱ)、Epstein-Barr病毒(EBV)和人巨细胞病毒(CMV)是引起中枢神经系统、生殖道感染及肿瘤等多种疾病的共同病原体。以往的实验室诊断方法,包括已建立的各种疱疹病毒的聚合酶链反应法(PCR)技术,一般只能检测一种病毒,易造成漏诊。笔者在上述4种病毒的高度同源序列DNA聚合酶基因中设计一对引物,能对4种病毒DNA进行扩增,继而用凝胶电泳和限制性内切酶BamHI或SmaⅠ酶切分析扩增产物进行鉴别,建立了能一次性分型检测上述4种病毒的PCR——酶谱法。敏感性和特异性试验表明,灵敏度可测到1 fg DNA,相当于6个病毒颗粒,且引物仅对4种疱疹病毒扩增,与临床常见的其它病原体无交叉反应。对影响PCR效果的因素如Mg~(2+)浓度、引物浓度及循环参数等进行了优化选择。用此法检测10例疱疹病毒性脑炎患者脑脊液和18例慢性宫颈炎患者宫颈分泌物中的疱疹病毒,结果分别有8例和15例出现DNA扩增区带,并经电泳和酶切能区分各型,本方法的建立为疱疹毒感染的临床早期诊断、药物疗效考核和流行病学研究提供了有效的手段。     

人巨细胞病毒潜伏感染状态下编码miRNA的研究

目的：探索潜伏感染状态下人巨细胞病毒（HCMV）所编码微小RNA（microRNA,miRNA）,为研究其在HCMV病毒学和潜伏感染机制奠定基础。方法通过HCMV感染THP－1细胞构建HCMV潜伏感染细胞模型,采用高通量Solexa测序平台对其深度测序,并利用 RNAFold 等生物信息学软件进行二级结构预测和命名。结果HCMV在潜伏感染状态表达了miR－US25－2－3p、miR－US25－2－5p、miR－UL112、miR－US25－1、miR－UL22A 以及长度为25 bp的编号为PC－5p－148467的miRNA,对PC－5p－148467进行系列分析,将其命名为hcmv－miR－US33as－5p。结论在潜伏感染状态下,HCMV亦可编码多种miRNA。     

人巨细胞病毒糖蛋白B抗原表位在大肠杆菌中的表达

目的:利用大肠杆菌表达人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白B抗原表位AD1和AD2,对表达产物进行纯化,通过ELISA方法检测表达产物与感染HCMV的人血清之间的特异结合反应,探讨其用于临床检测的可行性. 方法:以HCMV病毒基因组为模板,PCR扩增AD1和AD2基因,构建重组表达载体pET32-NusA-AD1和pET32-NusA-AD2,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中利用IPTG诱导表达,通过Ni柱亲和纯化获得NusA-AD1和NusA-AD2, ELISA方法检测NusA-AD1和NusA-AD2与感染HCMV的人血清之间的特异性结合反应.结果:可溶性表达并纯化得到融合抗原NusA-AD1和NusA-AD2.在8份已确定为HCMV IgG阳性人血清标本中,融合抗原NusA-AD1能够与5份血清发生反应,融合抗原NusA-AD2能够与6份血清反应.结论:NusA-AD1和NusA-AD2能够部分检测HCMV感染的人血清.     

人巨细胞病毒^32P标记PCR产物探针敏感度

＾３２Ｐ探针杂交是病原微生物基因诊断应用最广泛的方法之一，在建立了人巨细胞病毒ＰＣＲ、套式ＰＣＲ的基础上，我们用６１３ｂｐ ＰＣＲ外引物扩增产物的制备了杂交探针，并与３００ｂｐ内引物扩增产物进行转膜杂交，可将单纯琼脂糖凝胶电泳１７ｎｇ的检测水平提高到０．５ｎｇ，释释梯度相当于提高２个数量级。因此，利用ＰＣＲ结合＾３２Ｐ杂交就可以检测出不到１个病毒的基因拷贝（１００ａｇ），为临床人巨细胞病毒潜伏感染     

烧伤病人巨细胞病毒感染的检测分析

目的：观察严重烧伤病人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染情况及对病情的影响。方法：采用ＰＣＲ技术６０例烧伤病人创面及尿液中ＨＣＭＶ－ＤＮＡ,用ＥＬＩＳ观察血清中ＨＣＮＭＶ－ＩｇＭ、ＩｇＧ,并与５０例正常检测结果进行对照。结果：观察组血清中ＨＣＭＶ－ｇＭ和创面及尿液中ＨＣＭＶ－ＤＮＡ均高于对照组,感染ＨＣＭＶ的烧伤病人创而愈合较慢,外周血中淋巴细胞计数较高。结论：烧伤患感染ＨＣＭＶ的机会较大,且烧伤后早     

Differences of PCR efficiency between two-step PCR and standard three-step PCR protocols in short tandem repeat amplification

The effects on STR typing results, using a two-step PCR protocol that combines the annealing and extension steps, were determined using samples at various DNA concentrations. DNA samples ranging from 62.5 to 500 pg were amplified using the reagents contained within the AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit. At 250–500 pg of DNA template, the rates of detecting alleles were close to those found when using three-step PCR (the standard Identifiler protocol) and two-step PCR protocols. The two-step PCR increased by 8.1% and 64.2% the average number of amplified alleles compared with the three-step PCR at 125 pg and 62.5 pg of template DNA, respectively. At 62.5–500 pg of DNA, the average peak heights were 23.3–65.0% higher than heights using the three-step PCR protocol. When two different PCR protocols were applied to old bones, the average number of amplified loci was similar. These results suggested that the two-step PCR protocol can generate more STR alleles in low template DNA samples; however, the method may be limited with samples of very low-quality, i.e., degraded DNA, compared with the three-step protocol. A better understanding of the effects of the two-step PCR protocol on amplification conditions might help researchers improve STR typing.     

Effective removal of co-purified inhibitors from extracted DNA samples using synchronous coefficient of drag alteration (SCODA) technology

Various types of biological samples present challenges for extraction of DNA suitable for subsequent molecular analyses. Commonly used extraction methods, such as silica membrane columns and phenol–chloroform, while highly successful may still fail to provide a sufficiently pure DNA extract with some samples. Synchronous coefficient of drag alteration (SCODA), implemented in Boreal Genomics’ Aurora Nucleic Acid Extraction System (Boreal Genomics, Vancouver, BC), is a new technology that offers the potential to remove inhibitors effectively while simultaneously concentrating DNA. In this initial study, SCODA was tested for its ability to remove various concentrations of forensically and medically relevant polymerase chain reaction (PCR) inhibitors naturally found in tissue, hair, blood, plant, and soil samples. SCODA was used to purify and concentrate DNA from intentionally contaminated DNA samples containing known concentrations of hematin, humic acid, melanin, and tannic acid. The internal positive control (IPC) provided in the Quantifiler? Human DNA Quantification Kit (Life Technologies, Foster City, CA) and short tandem repeat (STR) profiling (AmpF?STR® Identifiler® Plus PCR Amplification Kit; Life Technologies, Foster City, CA) were used to measure inhibition effects and hence purification. SCODA methodology yielded overall higher efficiency of purification of highly contaminated samples compared with the QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA). SCODA-purified DNA yielded no cycle shift of the IPC for each sample and yielded greater allele percentage recovery and relative fluorescence unit values compared with the QIAquick® purification method. The Aurora provided an automated, minimal-step approach to successfully remove inhibitors and concentrate DNA from challenged samples.     

Human DNA quantification and sample quality assessment: Developmental validation of the PowerQuant¨r) system

Quantification of the total amount of human DNA isolated from a forensic evidence item is crucial for DNA normalization prior to short tandem repeat (STR) DNA analysis and a federal quality assurance standard requirement. Previous commercial quantification methods determine the total human DNA and total human male DNA concentrations, but provide limited information about the condition of the DNA sample. The PowerQuant^¨r) System includes targets for quantification of total human and total human male DNA as well as targets for evaluating whether the human DNA is degraded and/or PCR inhibitors are present in the sample. A developmental validation of the PowerQuant^¨r) System was completed, following SWGDAM Validation Guidelines, to evaluate the assay tm)s specificity, sensitivity, precision and accuracy, as well as the ability to detect degraded DNA or PCR inhibitors. In addition to the total human DNA and total human male DNA concentrations in a sample, data from the degradation target and internal PCR control (IPC) provide a forensic DNA analyst meaningful information about the quality of the isolated human DNA and the presence of PCR inhibitors in the sample that can be used to determine the most effective workflow and assist downstream interpretation.