原发性肾病综合征相关基因的筛选

目的：比较原发性肾病综合征（PNS）患儿与正常健康儿童外周血单个核细胞（PBMC）的基因表达谱变化，筛选出PNS相关基因，进而为PNS的基因诊断和治疗提供线索。方法：分离初发的PNS患儿和正常健康儿童的PBMC，用TRIzol一步法从PBMC中抽提总RNA，将等量的PNS患者和正常健康儿童的mRNA分别用Cy5和Cy3逆转录荧光标记，制备cDNA探针；将两种探针混合后与代表8096条基因的表达谱芯片杂交，经严格洗涤后，用GenePix4000B扫描仪扫描杂交信号荧光强度，用GenePix3.0软件分析扫描结果。结果：在进入研究的8096条基因中，有418条在PNS患者PBMC中存在差异表达。其中，表达增加的有128条，表达降低的有290条；在肾脏病中曾有相关研究的有29条，其余389条在肾脏病中未发现相关研究。这些基因的功能涉及免疫、细胞骨架与运动、细胞信号转导、细胞周期与细胞增殖、凋亡、物质代谢等多个方面。结论：运用基因芯片技术能有效地筛查出新的PNS相关基因；PNS的发生、发展涉及多个基因的改变，是具有不同功能的多个基因相互作用的结果。     

急性非淋巴细胞白血病患儿人类端粒酶逆转录酶基因的表达

目的探讨人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达与儿童急性非淋巴细胞白血病(ANLL)关系和临床意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测HL-60白血病细胞株、14例ANLL患儿和11例正常对照的hTERT基因表达。结果HL-60白血病细胞株、14例ANLL患儿中11例及健康儿童2例有hTFRT基因表达;hTERT基因表达见于ANLL所有亚型;其表达水平明显高于正常对照,但较K562细胞株低。结论儿童ANLLhTERT-mRNA表达水平上调;hTERT基因表达与儿童ANLL发生发展有关。     

E2A-PBX1融合基因的实时定量检测在小儿急性淋巴细胞白血病微小残留病监测中的应用

目的：实时荧光定量PCR方法检测E2A-PBX1融合基因的表达水平,探讨其在监测急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿微小残留病（MRD）及判断预后中的临床价值。方法：采用实时荧光定量RT-PCR方法,动态检测11例E2A-PBX1融合基因阳性的ALL患儿在初治期（11例）、完全缓解期（11例）、复发期（3例）和10例同期骨髓细胞形态学正常的非血液及肿瘤疾病对照组患儿的E2A-PBX1融合基因表达水平。结果：11例ALL患儿初治期和复发期的E2A-PBX1基因表达水平均显著高于缓解期及对照组（P<0.01）。与诱导缓解治疗第33天E2A-PBX1水平表达阴性的患儿比较,表达阳性的患儿3年的复发率增高,无病生存率降低（均P<0.05）。结论：实时荧光定量RT-PCR检测E2A-PBX1融合基因的表达水平是监测MRD、预测复发、指导个体化治疗的良好指标,诱导缓解第33天E2A-PBX1融合基因水平可用于判断预后。     

基因芯片筛选先天性肛门直肠畸形相关基因

目的 应用基因芯片筛选先天性肛门直肠畸形(ARM)的相关基因.方法 用Affy-metrix U133 Plus 2.0表达谱芯片对2例高位肛门直肠畸形直肠末端及1例死于非胃肠道疾病患儿直肠末端组织的基因表达谱进行分析.应用RT-PCR的方法对筛选出的7个表达差异基因进行了表达水平的实验验证.结果 肛门直肠畸形直肠末端与正常直肠末端组织中表达差异在2倍以上的基因有776条,其中ARM下调的基因有399条,上调基因377条.差异表达4倍以上的基因259条,其中ARM下调的基因有150条,上调的基因109条.RT-PCR技术验证的7个差异表达基因中,RHOB、HOXA5基因在高位肛门闭锁患儿直肠末端组织中的表达水平高于正常对照,而SOX11、MMP7、SALL1、NKX3-1和EPHB2基因在高位肛门闭锁患儿直肠末端组织中的表达水平明显低于正常对照.结论 基因芯片可有效筛查出肛门直肠畸形发生的相关基因,在ARM的发生发展中有多种类型的基因参与.本研究中基因表达谱的实验结果具有较好的可信度和可靠性.应用基因芯片筛查差异表达基因为先天性肛门直肠畸形的病因及病理生理学研究奠定基础.     

特发性矮身材儿童循环microRNA表达水平的研究

目的 研究特发性矮身材（ISS）患儿循环miRNA表达水平,初步建立ISS循环miRNA表达谱,为进一步探索miRNA与ISS发生、发展及寻找新的生物标记物提供理论依据。方法 选取20例ISS患儿和20例健康对照儿童,提取血清总RNA,利用microRNA microarray技术比较ISS患儿与对照儿童血清miRNA的表达差异;实时荧光定量PCR技术验证芯片结果,生物信息学分析软件对筛选出的具有显著差异表达的miRNA进行靶基因预测。结果 ISS组与对照组对比共有40个差异表达的miRNA,其中表达上调的miRNA有24个;表达下调的有16个;实时荧光定量 PCR对其中2个表达上调（miR-185和miR-574-5p）和2个表达下调（miR-497和miR-15a）的miRNA进行验证,ISS患儿血清中miR-185较对照组明显上调（P<0.05）,miR-497明显下调（P<0.05）。结论 ISS患儿与健康对照血清miRNA表达存在显著差异,提示血清miRNA可能与ISS的发生发展有密切的关系。     

转录因子FOXP2调控先天性巨结肠相关基因表达的生物信息学分析

目的鉴定与肠神经系统发育以及先天性巨结肠(HSCR)发生相关的转录因子。方法运用ChEA3数据库对调控HSCR易感基因表达的转录因子进行预测以及富集分析,使用GeneMANIA在线工具构建转录因子与靶基因的蛋白-蛋白相互作用网络图,探讨其可能调控的分子通路,以Human Protein Atlas数据库对转录因子进行蛋白表达定位,探究其在神经系统和结肠的表达情况。采用实时荧光定量PCR方法,验证相关转录因子在30例HSCR患儿的狭窄段和扩张段肠管标本中的表达差异。结果用ChEA3数据库对已报道的119个HSCR易感基因的转录因子预测及富集分析发现,FOXP2可以靶向作用于其中46个基因。在GeneMANIA数据库中分析显示FOXP2可能调控多个HSCR易感基因的表达,与Hedgehog通路的GLI3共表达,与PTCH1存在遗传相互作用。Human Protein Atlas数据库分析显示,FOXP2蛋白在脑神经元细胞和结肠组织中高表达。30例HSCR患儿中位年龄为1岁,其中男23例、女7例,荧光定量PCR结果显示,FOXP2的mRNA表达量在病变组织较临近正常组织下降,差异有统计学意义(t=5.819,P0.001)。结论 FOXP2可能通过调控Hedgehog信号通路,影响肠神经细胞发育过程,与HSCR的发病相关。     

基因表达谱芯片筛选室间隔缺损胎儿心肌组织差异表达基因

目的 利用基因芯片技术观察室间隔缺损(VSD)胎儿心肌组织基因谱表达的变化,对其可能的分子机制进行初步分析.方法 病例组为孕中期VSD胎儿,对照组为同胎龄无心脏畸形的难免流产的胎儿,取胎儿心室心肌组织,提取其总RNA,采用安捷伦4×44k人全基因组表达谱芯片观察其心肌组织基因表达谱的变化,对基因芯片数据进行处理和生物信息学分析,差异基因信号通路分析,并用实时PCR方法验证芯片结果.结果 芯片筛选发现VSD胎儿心肌组织与正常胎儿心肌组织差异表达基因 1 490 个,表达差异2倍、3倍、4倍以上的基因数分别为1 314个、157个、19个;信号通路分析差异基因得到18个具有统计学意义的信号通路,其中包括与心脏发育密切相关的信号通路,如:Notch、PI3K/AKT、MAPK信号通路;随机挑选表达差异的5个基因进行验证,结果表明定量PCR检查结果与芯片筛选结果基本相符.结论 VSD胎儿心肌组织与正常胎儿心肌组织差异表达基因与心脏发育密切相关的信号通路(Notch、PI3K/AKT、MAPK信号通路)有关,这为先天性心脏病发生机制的研究奠定了良好的基础.     

多药耐药基因在肾病综合征患儿外周血单个核细胞中的表达研究

目的 探讨肾病综合征(NS)患儿外周血单个核细胞(PBMC)中多药耐药基因(MDR1)的表达与不同激素(GC)效应患儿的关系.方法 收集2007年5月-2008年2月收治的原发特发性肾病(PNS)患儿47例,按照GC对患儿的效应分为GC敏感组(SSNS)、GC耐药组(SRNS)两组,根据GC敏感患儿临床疗效又分为非频反复组(NFR)和频反复(FR)及GC依赖(SD)组(简称FR&SD)两组,采用荧光定量PCR方法检测NS患儿的外周血中PBMC中MDR1 mRNA表达水平,以12例健康正常儿童为对照.结果 GC治疗后NS患儿PBMC中MDR1 mRNA的表达均高于正常对照组,而SRNS组PBMC中MDR1 mRNA的表达高于SSNS组;且FR&SD组患儿MDR1 mRNA的表达量要比NFR更高;SSNS患儿MDR1 mRNA的表达与缓解时间、复发次数、病程呈正相关.尤其是FR&SD组患儿MDR1 mRNA的表达与其缓解时间呈正相关(r=0.796,P<0.01).结论 GC治疗后NS患儿MDR1的高表达与GC耐药、GC依赖和复发有关.     

原发性肾病综合征患儿外周血单个核细胞多药耐药基因1及P-糖蛋白170的表达

目的检测原发性肾病综合征(PNS)患儿不同时间点外周血单个核细胞(PBMC)多药耐药基因1(MDR1)及其产物P-糖蛋白170(P-gp170)的表达,探讨MDR1及P-gp170在PNS患儿糖皮质激素(GC)耐药中的作用及介导耐药的可能机制。方法选择在苏州大学附属儿童医院住院的30例PNS患儿为研究对象,根据随访结果分为2组:激素耐药型肾病综合征(SRNS)组和激素敏感型肾病综合征(SSNS)组,每组各15例。选取10名健康体检儿童作为健康对照组。分3个时间点采集其外周血标本:发病初未用GC时,足量GC治疗4周后,病情缓解停用GC 2个月后或病情不缓解但泼尼松减量至<0.5 mg.kg-1.d-1时。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PNS患儿不同时间点PBMC MDR1 mRNA的表达。流式细胞仪(FCM)检测PNS患儿不同时间点PBMC P-gp170的表达水平。结果健康对照组儿童和PNS患儿PBMC均有MDR1 mRNA及P-gp170表达。PBMC MDR1 mRNA与P-gp170的表达呈高度正相关(r=0.853,P<0.05)。SRNS组患儿3个时间点的PBMC MDR1 mRNA及...     

神经母细胞瘤SK—N—SH细胞在氯化钴模拟缺氧后侧群细胞基因表达谱的变化北大核心CSCD

目的探讨SK—N—SH神经母细胞瘤株在氯化钴模拟缺氧条件下侧群（sidepopulation,SP）细胞比例的变化及SP细胞基因表达谱的改变。方法采用二氯化钴模拟缺氧条件,然后利用Hoechst33342染料法,通过流式细胞仪紫外激光检测分选功能分选出缺氧及常氧SK—N—SH细胞中的SP细胞,利用Agilent8×60K人（Human）G3表达谱芯片进行检测,并对基因芯片结果进行分析,以荧光定量PCR验证芯片结果。结果SK—N—SH细胞株的SP细胞比例约为8．65％,缺氧后降至约2．08％;缺氧SP细胞和常氧SP细胞mRNA及lincRNA的表达谱存在明显差异。差异〉2倍的基因有5077mRNA、1383lincRNA、其中上调的有2550mRNA、572lincRNA,下调的有2527mRNA、811lincRNA。差异表达的基因主要涉及细胞周期、DNA复制、p53及MAPK信号通路等生物学过程。荧光定量PCR基因结果与芯片差异基因结果表达趋势一致。结论缺氧使SP细胞比例下降,并使SP细胞mRNA和lincRNA的表达谱均发生显著改变,提示mRNA和lincRNA共同参与调节神经母细胞瘤SP细胞在缺氧环境中的生物学行为。     

大鼠胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共重组腺病毒的构建及表达

目的构建胶质细胞源性营养因子（GDNF）及内皮素B受体基因（EDNRB）共表达腺病毒并观察其在神经干细胞（NSC）中的表达。方法利用AdEasy腺病毒表达系统构建GDNF及EDNRB基因共表达腺病毒AdGE，体外感染NSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RT-PCR、流式细胞仪法鉴定外源基因的表达。结果NSC经Ad—GE感染后24h可观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达，RT-PCR、流式细胞仪法证实外源性GDNF及EDNRB基因均可在NSC中表达。结论成功构建GDNF及EDNRB基因共表达重组腺病毒，证实了其在NSC的表达，为先天性巨结肠的联合基因治疗打下基础。     

Nitric oxide synthase gene polymorphisms in children with minimal change nephrotic syndrome

Aims:  Nitric oxide (NO) attenuates many functions within the kidney, and all NO synthase (NOS) isoforms are constitutively expressed in the kidney. But the exact role of NO in renal diseases is still debatable. The aim of the present study was to investigate endothelial ( eNOS ), and neuronal ( nNOS ) NOS gene polymorphisms in children with minimal change nephrotic syndrome (MCNS).
Materials and methods:  Eighty-six Turkish children with clinical MCNS, ranging in age from 2 to 10 years, were compared with 114 healthy age- and sex-matched controls. The glu 298 Asp (G/T) polymorphism of the eNOS, and C276T (C/T) polymorphism of nNOS genes were genotyped using polymerase chain reaction.
Results:  The distribution of GG, TG, and TT genotypes for eNOS was 52%, 33% and 15% in MCNS compared with 61%, 26% and 13% in the controls ( P  > 0.05). The distribution of CC, TC, and TT genotypes for nNOS was 16%, 66% and 18% in MCNS compared with 10%, 43% and 47% in the controls. TT genotype distribution of nNOS was found to be lower in patients ( P  = 0.003). The eNOS and nNOS gene polymorphisms were not associated with gender, positive family history, frequency of relapses, or response to steroid.
Conclusions:  The present study is the first to investigate eNOS and nNOS gene polymorphisms in children with MCNS. The nNOS gene polymorphism may be associated with MCNS in children, but further studies in a larger population with different glomerular diseases are needed to confirm the results.     

微小病变型肾病患儿外周血淋巴细胞糖皮质激素膜受体与激素对其凋亡、增殖的作用

目的探讨微小病变型肾病(MCNS)外周血淋巴细胞(PBLs)糖皮质激素膜受体(mGR)表达及其与糖皮质激素(GC)对PBLs调亡、增殖作用的关系,并观察GC对mGR表达影响。方法分别以间接免疫荧光、碘化丙啶染色及3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法分析MCNS和NMCNS患儿mGR表达、PBLs凋亡及增殖情况。结果1.MCNS患儿mGR表达高于非微小病变组(NMCNS)及正常组,临床GC治疗后降低;2.mGR表达与10-7mol/L地塞米松(DEX)诱导PBLs凋亡率及抑制其3H-TdR掺入率呈正相关。结论MCNS患儿mGR表达增高。mGR可能参与GC诱导PBLs凋亡和(或)抑制其增殖作用。GC对mGR表达有下调作用。     

Low Expression of Basic Fibroblastic Growth Factor in Mesenchymal Stem Cells and Bone Marrow of Children with Aplastic Anemia

Background: Our previous experiments with gene chip suggested that basic fibroblastic growth factor (FGF2) levels were lower in mesenchymal stem cell (MSC) from aplastic anemia patients. The purpose of this study was to determine the expression of FGF2 in MSC and in bone marrow of children with aplastic anemia to better understand the role of low FGF2 expression in the pathogenesis of aplastic anemia. Procedure: MSCs from the bone marrow of aplastic anemia children and control group were cultured in vitro. Growth curves of primary and passage MSC were plotted. FGF2 gene expression in MSCs was detected using quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). FGF2 protein expression in mononuclear cells and FGF2 protein level in extracellular fluid of bone marrow were also investigated. Result: Decreased growth of MSCs from aplastic anemia children was observed after passage 8 in serial subcultivation, and FGF2 gene expression was downregulated. Within the patients’ bone marrow, low FGF2 expression was validated both in mononuclear cells and in the extracellular fluid. Conclusion: Low FGF2 gene expression in MSCs and low FGF2 protein level in bone marrow of aplastic anemia may involve to pathogenesis of aplastic anemia.     

儿童肺炎链球菌分离株红霉素耐药性与相关耐药基因研究

目的检测儿童肺炎链球菌(SP)红霉素耐药性和相关耐药基因。方法对肺炎儿童进行痰培养,分离、鉴定SP菌株,经红霉素药敏试验检测SP药敏,通过PCR检测红霉素核糖体甲基化酶基因(ermB、ermA/B)、主动外排转运基因(mefA)3种基因表达。结果临床分离的31株SP,29株对红霉素耐药(93.5%),ermB基因阳性12株(38.7%),ermA/B基因阳性19株(61.3%),mefA基因阳性7株(22.6%),24株检出erm或和mef基因(77.4%),其中1株ermA/B、mefA基因表达均为阳性,1株ermB、ermA/B、mefA基因表达均为阳性。结论erm基因在SP有高表达,mef基因也有相当的表达,SP对红霉素具有高度耐药。     

Quantitation of gene expression by real-time PCR disproves a "retroviral hypothesis" for childhood-onset diabetes mellitus.

Children with insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) suffer from a chronic autoimmune beta cell destruction of unknown origin, maybe due to superantigens or retroviral endogenous genes. Recently, a novel endogenous retrovirus designated as IDDMK 22 was proposed to encode for such a candidate autoimmune gene in type 1 diabetes. We therefore analyzed the expression of IDDMK 22 genes in peripheral blood leukocytes and plasma from 55 healthy children and 55 diabetic children including 11 patients with acute disease onset. In our study we applied an improved quantitative and highly specific real-time PCR assay. In contrast to previous data obtained by conventional PCR. IDDMK 22 gene expression did not differ between diabetic and nondiabetic individuals. For this reason, we propose that IDDMK 22 is an ubiquitous endogenous retroviral element in the human genome but not a candidate autoimmune gene for IDDM, especially in childhood-onset disease. Real-time PCR proved to be a highly sensitive and specific method for detection and quantitation of very low amounts of mRNA and will thereby be useful regarding the special demands in pediatric studies dealing with very low amounts of specimen.