抗艰难梭菌A毒素单克隆抗体的制备及特性分析

目的 :制备抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体 (mAb)并鉴定其特性。方法 :用纯化的艰难梭菌A毒素免疫BALB/c小鼠 ,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2 / 0融合 ,采用间接ELISA筛选杂交瘤细胞。用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析 ;用Westernblot检测mAb的特异性。结果 :得到 6株杂交瘤细胞株 ,5C10株细胞分泌的mAb为IgG2a ,4B5和 8A1株细胞分泌的mAb为IgG1,其他 3株细胞mAb (2H7、3E9和 6G8)均分泌IgM。中和试验表明 ,所有的mAb均无中和活性。腹水mAb的效价均在 10 -4以上 ,其中mAb 2H7、6G8、5C10、4B5和 8A1具有共同的表位 ,而mAb 3E9识别的位点与其他 5株不同。mAb 8A1和 4B5的相对亲和力>10 5,其他 4株mAb的相对亲和力 >10 4。在非变性条件下 ,PAGE后Westernblot的结果显示 ,6株mAb均可与相对分子质量 (Mr)为 5 5× 10 4的A毒素产生反应 ;而在变性条件下 ,还原与非还原SDS PAGE后Westernblot均显示 ,6株mAb均可与Mr 为 5× 10 4～ 2 4× 10 4的A毒素产生反应。结论 :6株杂交瘤细胞株均能分泌抗艰难梭菌A毒素的特异性mAb ,为艰难梭菌A毒素的研究提供了有利的工具     

抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B(GPA/GPB)的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用人“O”型血红细胞作为免疫源,免疫BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备mAb,用谱红细胞筛选阳性克隆;采用直接、间接血凝试验检测杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价。分别用快速定性试纸和酶处理红细胞检测mAb的Ig亚类及抗原表位。用Western blot鉴定抗GPA/GPB mAb的特异性。结果:获得4株分泌抗M、1株抗N及3株抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞培养上清mAb的效价介于1×2-4~1×2-8之间,腹水mAb的效价在1×2-7~1×2-12之间。除1株mAb 1C1C9C4为IgM外,其他7株mAb均为IgG。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞的反应格局,结合mAb抗原表位的检测,确定4株和1株mAb可分别特异性结合于GPA的M、N抗原表位;另3株mAb 6D7C9、7C9H4和7C9G11与“O”型血红细胞膜的Western blot结果显示,均可结合GPA、GPB蛋白。结论:成功地建立了4株分泌抗M、1株分泌抗N及3株分泌抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株,可用于MNSs血型系统的研究及鉴定,并为制备双功能抗体用于病毒、肿瘤疾病的诊断和治疗打下了坚实的基础。     

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2 4抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础     

抗人ILT-4单克隆抗体制备及初步鉴定

目的: 制备抗人ILT4分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法: 应用淋巴细胞杂交瘤技术, 制备小鼠源性抗人ILT4 mAb.用间接ELISA法测定腹水mAb的效价.以Western blot测定mAb的抗原结合活性.通过流式细胞术(FCM)对mAb结合转染细胞表面及天然细胞表面ILT4分子的活性进行鉴定.结果: 获得7株分泌抗ILT4 mAb的杂交瘤细胞株.ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6, 7株mAb均为IgG1(κ).Western blot结果显示, 3株mAb与人ILT4有良好的结合活性.用转染细胞及U937细胞做FCM分析发现另外4株mAb可结合真核表达的及天然的ILT4分子.结论: 获得7株能特异性识别ILT4分子的mAb, 为研究ILT4分子的组织分布和功能研究提供了可靠的实验手段.     

抗森林脑炎病毒单克隆抗体的制备及夹心ELISA的建立

目的: 制备抗森林脑炎 (TBE)病毒单克隆抗体(mAb), 建立夹心ELISA法检测森林脑炎病毒。方法: 以纯化的TBE病毒抗原加福氏佐剂, 免疫BALB/c小鼠, 制备鼠源性TBE病毒mAb。并用mAb建立夹心ELISA法测定病毒抗原的效价。结果: 获得了 6株TBE病毒mAb杂交瘤细胞株, 它们均属于Ig亚类。mAb杂交瘤细胞培养液上清的效价为 1×10-3 ~1×10-4; 腹水效价为 1×10-6 ~1×10-7。结论:获得的 6株能特异性识别TBE病毒的mAb, 可用于免疫学检测, 为进一步研究TBE病毒的生物学性状奠定了基础。     

抗SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

目的:研制抗SARSCoVN蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化的GSTN免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗SARSCoVN蛋白mAb;用免疫双扩散鉴定Ig亚类;Westernblot和免疫组化鉴定mAb的特异性;间接ELISA检测mAb的腹水效价、相对亲和常数。结果:获得1株可分泌特异性mAb的抗SARSCoVN蛋白的杂交瘤细胞系3E10H,Ig亚类为IgG2b;其腹水效价为8×10-5;其相对亲和力1.725×10-10mol/L,Westernblot和免疫组化阳性。结论:获得特异性抗SARSCoVN蛋白的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

抗人红细胞膜抗原非凝集型单克隆抗体的研制及特性鉴定

目的:制备抗人红细胞膜抗原的非凝集型单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:应用杂交瘤技术,以人O型红细胞膜抗原免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,用聚凝胺试管法筛选识别红细胞表面共同抗原的抗体,玻片凝集实验剔除凝集型抗体(完全抗体),再将分泌非凝集型mAb(不完全抗体)的杂交瘤细胞株用有限稀释法克隆化3次。对杂交瘤细胞的稳定性和mAb的特性进行鉴定。结果:获得1株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞2E8。mAb2E8为IgG1类,可特异性地识别红细胞膜上的H抗原,没有种属交叉血凝反应。杂交瘤细胞的培养上清与人的A、B、AB和O型红细胞均能产生强凝集,凝集效价为1∶1024,腹水mAb的凝集效价达到1∶64×106。mAb的亲和力用凝集试验检测,出现血凝的时间为7s,3min以内凝块>1mm。结论:成功地制备了针对红细胞膜H抗原的非凝集性mAb,此mAb的凝集效价、相对亲和力及特异性均较良好,为构建双特异性抗体奠定了基础。     

抗人RANTES分子单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗人RANTES分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定,为研究RANTES分子的组织分布和功能提供实验手段。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,制备小鼠源性抗人RANTESmAb。用ELISA法鉴定腹水mAb的效价。用Q FastFlow阴离子交换柱纯化mAb。用Westernblot鉴定mAb的抗原结合活性。用免疫组化染色法,对RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠移植肠组织中的分布进行鉴定。结果:获得4株分泌抗RANTESmAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6,3株mAb为IgG1亚类(κ),1株为IgG2b(κ)。Westernblot的结果显示,3株mAb与人RANTES均有良好的结合活性。用3株mAb进行免疫组化染色的结果显示,RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠小肠腺上皮细胞胞质中呈高表达。结论:获得4株能特异性识别天然RANTES分子的mAb。大鼠小肠移植后其肠上皮细胞中可高水平地表达RANTES。     

抗人IgG单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高效价的抗人IgG单克隆抗体(mAb),并用于肾脏免疫性疾病的免疫荧光诊断。方法:以人IgG全长分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,经筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗IgGmAb的杂交瘤细胞株。用ELISA及Westernblot鉴定mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)。以纯化的mAb建立免疫荧光染色法,并用于肾小球肾炎的诊断。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人IgGmAb的细胞株,腹水效价为1×10-6,Ig亚类为IgG2a(κ),相对亲和力达到1×10-5,Westernblot显示在相对分子质量(Mr)为53×103处出现特异性的条带,说明mAb能与IgG的γ链特异性结合。免疫荧光染色的结果显示,IgG分子在肾小球肾炎的活检组织中表达。结论:获得1株能特异性识别人IgG的mAb,可用于肾脏免疫性疾病的病理诊断。     

抗rhNDPK-A单克隆抗体的制备及鉴定

目的 :研制抗rhNDPK A (recombinanthumannucleosidediphosphatekinase A)单克隆抗体 (mAb) ,并鉴定其特性。 方法 :以纯化的rhNDPK A免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备抗rhNDPK AmAb ;用免疫双扩散鉴定Ig亚类 ;West ernblot鉴定mAb的特异性 ;间接ELISA检测mAb的腹水效价、亲和常数 ,并进行表位分析。结果 :获得 6株可分泌特异性mAb的抗rhNDPK A的杂交瘤细胞系 2D9、8C7、13E2、15D9、15E3和 2 0D9,Ig亚类均为IgG1;其效价为 1× 10 -4～5× 10 -6;亲和常数为 4 .5× 10 -9～ 2 .8× 10 -10 mol/L ;共有3个抗原表位。结论 :获得抗rhNDPK A的mAb ,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件     

抗IL-13Rα2单克隆抗体轻链和重链可变区基因的克隆及鉴定

目的:在成功制备小鼠抗人IL-13Rα2高亲和力单克隆抗体(mAb)的基础上,通过分子克隆方法获得该抗体可变区基因序列。方法:从1株小鼠抗人IL-13Rα2 mAb杂交瘤细胞LX147-7中提取总RNA,以此为模板反转录获得cDNA,用针对小鼠mAb重链和轻链可变区基因序列的特异性引物分别进行PCR反应。将PCR产物连入克隆载体,经筛选阳性克隆,PCR和酶切鉴定正确后送测序,测序结果进行生物信息学分析。结果:成功克隆了抗人IL-13Rα2 mAb LX147-7重链和轻链的可变区基因。结论:获得了抗人IL-13Rα2 mAb LX147-7重链和轻链的可变区基因序列,为构建相关基因工程抗体打下了良好基础。     

抗ICAM-1单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备有生物学活性的抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:以纯品ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠4次。采用杂交瘤技术,经3次亚克隆筛选稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株。采用动物体内诱生的方法大量制备mAb。以protein G对其进行纯化后,用间接ELISA法测定mAb的效价并鉴定其Ig亚类。用Western blot鉴定mAb的特异性。结果:筛选出4株可稳定分泌抗人ICAM-1 mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为B9株、F1株、C11株和D6株。4株mAb的Ig亚类均为IgG1。4株mAb培养上清的效价均为1∶1 000;腹水的效价B9株与D6株为1∶2×105,F1株与C11株为1∶4×105。纯化后mAb的蛋白浓度为1.2 g/L,均可与ICAM-1特异性结合。结论:成功制备出效价高、特异性良好的4株抗ICAM-1 mAb,为进一步研究ICAM-1的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

抗O139群霍乱弧菌单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的制备抗O139群霍乱弧菌(vibriocholeraeO139)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性,为进一步研制检测O139群霍乱弧菌的胶体金免疫试纸条创造条件。方法以灭活的O139群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗O139群霍乱弧菌的mAb。采用间接ELISA方法和Westernblot对mAb的特异性进行鉴定。采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、检测其腹水效价及相对亲和力,并进行表位分析。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(O4D7和O4D10),其Ig亚类分别为IgG2b和IgG3;腹水mAb的效价均为1∶107;mAbO4D7的相对亲和力在1×105以上,O4D10在1×104以上。ELISA相加实验的结果显示,2株mAb可识别不同的抗原表位。结论成功地制备抗O139群霍乱弧菌的两株mAb,为建立快速特异检测O139群霍乱弧菌感染的试验方法提供了有力的工具。     

抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人绒毛膜促性腺激素(HCG)的单克隆抗体(mAb).方法:利用从人工流产刮宫物中提取的HCG免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞同NS-1小鼠骨髓瘤细胞融合, 采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞株, 并对mAb的亚型、亲和力及特异性进行鉴定.结果:共获得26株能稳定分泌抗HCG特异性mAb的杂交瘤细胞株.mAb的亚类均为IgG1, 亲和力介于1.14×108～2.0×108 mol/L之间, 其中4株mAb与HCG的β亚基有较强的反应, 而与黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)均无交叉反应.结论:成功获得4株鼠抗人HCG mAb的杂交瘤细胞株, 其分泌的mAb能特异识别人HCG的β亚基, 可用于早孕、肿瘤等诊断的进一步研究.     

抗KDR胞内区(KDR-CD)单克隆抗体的制备和鉴定

目的:研制特异性针对肿瘤新生血管内皮细胞生长因子受体(或含激酶插入区受体)胞内区(KDR-CD)的特异性单克隆抗体(mAb).方法:以谷胱甘肽转硫酶耦联的KDR-CD(GST-KDR-CD)可溶性融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞;用间接ELISA法测定其亲和力、亚类,Western blot检测其特异性.结果:获得1株稳定分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞株,命名为2B8H2A5;它分泌的抗体亚类为IgG1,к型轻链,而且亲和力强、特异性高.结论:成功获得能分泌抗KDR-CD mAb杂交瘤细胞,为以后将该mAb改造成小分子酪氨酸激酶抑制剂,使其能进入细胞内与受体KDR-CD特异性结合并阻断血管内皮细胞生长因子强大的生物学功能奠定了重要的基础.     

抗死亡受体-5单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:研制抗DR5单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法:以纯化的DR5免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DR5mAb。用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DR5mAb的亚类。用ELISA法测定sDR5对抗DR5mAb与DR5结合的阻断作用及流式细胞术检测与Jurkat细胞膜上DR5结合的阻断作用,以鉴定mAb的特异性。用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析。结果:获得4株可分泌抗DR5mAb的的杂交瘤细胞系YM366EC、YM366ED、YM369F5和YM369E6。4株mAb的Ig亚类均为IgG1;腹水mAb效价为1×10-4~5×10-6;亲和常数为1×109水平,4株mAb可识别2种不同的抗原表位。结论:获得4株抗DR5的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

重组人颗粒溶素的纯化及其单克隆抗体的制备

目的:纯化原核系统表达的颗粒溶素(GNLY),并制备其单克隆抗体(mAb)。方法:用Ni亲和层析纯化重组人GNLY,用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。mAb纯化后,用间接ELISA法测mAb的效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸盐洗脱法测定mAb的相对亲和力指数,并进行Ig亚类、特异性及杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性检测。结果:经Ni亲和层析纯化的可溶性GN-LY融合蛋白,其纯度和含量分别为95%和0.8g/L。共筛选出能稳定分泌抗人GNLYmAb的杂交瘤细胞4株,分别为6C8、9C6、5G7和5E5。4株杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价分别为1∶100～1∶3200和(0.1～8)×10-4,5E5mAb的Ig亚类为IgM,其余3株mAb均为IgG1。结论:成功地纯化人GNLY融合蛋白。以其为免疫原制备的鼠抗人GN-LYmAb,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

抗CD1d单克隆抗体的制备及其识别结构域的鉴定

目的:制备抗人CD1d单克隆抗体(mAb)并研究其结合特性。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠源性抗人CD1d mAb。用免疫荧光染色和流式细胞术鉴定其识别位点。结果:获得1株分泌抗CD1d mAb的杂交瘤细胞株。mAb的腹水ELISA效价达10-6,为IgG1亚类,可识别293T细胞转染的CD1d分子的α1结构域。结论:获得1株可特异性识别CD1dα1结构域的mAb,为进一步研究CD1d的结构及功能提供了手段。     

鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:研制鼠抗人B7-H4分子的单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人B7-H4分子的转基因细胞L929/B7-H4为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴瘤杂交技术,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选、多次克隆化培养,获得两株可特异分泌鼠抗人B7-H4分子mAb的杂交瘤细胞株。采用快速定性试纸分析法鉴定mAb所属的Ig亚类。用Dot-blot、Western blot鉴定mAb的特异性,竞争结合抑制实验鉴定mAb所识别的抗原结合位点,T细胞增殖抑制阻断实验对mAb的生物学功能进行初步的鉴定。结果:获得两株持续、稳定地分泌抗B7-H4 mAb的杂交瘤细胞,分别命名为1F10和2B2。Dot-blot的结果显示,两株mAb均能特异性识别B7-H4分子。Westernblot检测显示,mAb 2B2可以特异性识别B7-H4分子,而mAb 1F10则不能识别。位点竞争实验表明,两株mAb之间,mAb 1F10与商品化的mAb H74之间识别位点不同,mAb 2B2与商品化mAb识别位点相近。T细胞增殖抑制阻断试验显示,这两株mAb均能一定程度地阻断B7-H4对T细胞的抑制作用。结论:成功地获得两株抗人B7-H4分子的mAb,为进一步研究B7-H4分子的生物学功能提供了有效的工具。     

抗人μ链单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备高效价的鼠源性抗人μ链单克隆抗体(mAb),并建立可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。方法:以人IgM全分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用间接ELISA法筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗μ链mAb的杂交瘤细胞株。mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)采用ELISA及Westernblot法鉴定。以纯化的mAb包被建立ELISA捕捉法,并用于可疑乙脑患者标本中特异性IgM抗体的检测。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人μ链mAb的细胞株2E5。mAb腹水的ELISA效价为1×10-6,Ig亚类(型)为IgG1(κ),相对亲和力为1×10-5。Westernblot结果显示mAb2E5仅与IgM的μ链结合,Mr为75000。以辛酸硫酸铵法纯化的mAb2E5包被,建立了ELISA捕捉法,用于30份乙脑患者血清IgM的检测,敏感性及特异性良好。结论:成功地制备1株抗人μ链mAb2E5,建立了可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。