RhoC/ROCK-Ⅰ信号通路封闭对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究

目的:探讨 RhoC/ROCK-Ⅰ信号转导通路的封闭对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响.方法:RT-PCR及蛋白质印迹法检测RhoC及ROCK-Ⅰ在不同卵巢癌细胞系中mRNA及蛋白的表达水平;将ROCK-Ⅰ反义寡核苷酸(ASODN)转染人卵巢癌细胞系SW626与Caov-3细胞后,检测转染前后ROCK-Ⅰ蛋白的表达,Boyden小室观察各株细胞转染前后侵袭及运动能力的变化,MTT比色法测定转染前后黏附能力的变化.结果:RhoC和ROCK-Ⅰ在4种卵巢癌细胞中呈不同程度表达,其中RhoC的表达水平与癌细胞侵袭力和迁移能力呈正相关,r=0.95,P<0.01,转染ROCK-Ⅰ ASODN后,细胞内ROCK-Ⅰ的表达明显减少;细胞的侵袭能力受到明显的抑制,10 μmol/L组和20 μmol/L组SW626细胞的侵袭能力分别为对照组的(75.6±3.8)%和(54.7±2.9)%,Caov-3为(68.8±4.7)%和(50.0±4.5)%;转染两种浓度ASODN的SW626与Caov-3细胞的随机运动能力分别为对照组的(80.0±1.3)%、(63.7±1.9)%、(72.0±1.3)%和(55.9±2.5)%;定向运动能力分别为对照组的(83.9±1.4)%、(64.1±1.3)%、(72.5±3.4)%和(54.5±1.9)%.结论:RhoC/ROCK-Ⅰ信号转导通路与人卵巢癌细胞的体外侵袭与迁移密切相关,阻断ROCK-Ⅰ的表达可有效地抑制卵巢癌肿瘤细胞的体外侵袭能力.     

基质金属蛋白酶-9反义寡核苷酸对卵巢癌细胞侵袭黏附能力的影响

目的 观察基质金属蛋白酶-9（MMP-9）反义寡核苷酸（ASODN）转染对卵巢癌细胞体外侵袭黏附行为的影响,并探讨其作用机制。方法 以Lipofectinmin介导的MMP-9反义寡核苷酸转染至经纤黏连蛋白诱导MMP-9表达的卵巢癌细胞株HO-8910PM,利用RT—PCR、Western blot及明胶酶谱法检测转染寡核苷酸后HO-8910PM细胞MMPO的mRNA、蛋白表达及酶活性的变化;通过细胞体外侵袭、迁移实验和黏附实验,检测细胞侵袭黏附能力的变化。结果 卵巢癌细胞HO-8910PM转染MMP-9反义寡核苷酸后,MMP-9的mRNA及蛋白的表达受到抑制,抑制率分别为34．8％和42．5％,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;明胶酶活性也受到了抑制。反义寡核苷酸的转染降低了肿瘤细胞体外侵袭、迁移和黏附能力,侵袭和迁移抑制率分别为22．4％和24．8％,在60min和90min黏附抑制率分别为49．8％和38．3％。结论 MMP-9反义寡核苷酸可抑制卵巢癌细胞的侵袭黏附能力,MMP-9有可能成为抗卵巢癌侵袭转移的分子靶点。     

畸胎瘤细胞源性生长因子反义核酸载体对高度恶性人卵巢癌细胞增殖和侵袭的抑制效应及相关机制

目的 观察畸胎瘤细胞源性生长因子(PCDGF)反义核酸载体对高度恶性人卵巢癌细胞株Sw626和A2780增殖和侵袭的抑制效应,并初步探讨其相关机制.方法 采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法和Boyden小窒体外侵袭实验,检测PCDGF反义RNA真核表达载体对Sw626和A2780细胞增殖和侵袭能力的影响.采用Western blot技术,检测转染PCDGF反义RNA真核表达载体前后Sw626细胞cyclin D1和CDK4蛋自表达的变化.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和明胶酶谱法,分析PCDGF反义RNA真核表达载体对Sw626细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达和活性的影响.结果 与空白对照组相比,PCDGF反义核酸载体转染组Sw626和A2780细胞的增殖抑制率分别为72.9%和70.9%,侵袭能力分别被抑制了62.9%和59.0%.转染组Sw626细胞cyclin D1和CDK4蛋白的表达水平分别为0.38±0.08和0.37±0.13,明显低于空白对照组(0.84±0.11和0.64±0.11,P<0.01).与空白对照组(0.89±0.09)相比,转染组Sw626细胞MMP-2 mRNA的表达水平(0.66±0.11)虽未见降低(P>0.05),但MMP-2酶原的活性被叨显抑制.结论 PCDGF反义核酸可显著抑制高度恶性人卵巢癌细胞株Sw626和A2780的增殖和侵袭能力,并逆转其部分恶性表型,这可能与其能下调cyclin D1和CDK4蛋白的表达并抑制MMP-2酶原的活性有关;PCDGF可以作为卵巢癌治疗的新靶点.     

Tiam 1表达下调对胃癌细胞骨架及裸鼠体内成瘤转移影响的观察

目的:观察T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam 1)反义寡核苷酸(ASODN)转染对胃癌细胞骨架及裸鼠体内成瘤转移能力的影响。方法:采用层粘连蛋白黏附法,由胃癌MKN-45细胞株中筛选获得高侵袭转移亚株(MH)。以脂质体介导将Tiam1ASODN转染至MH细胞中,并应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及定量细胞ELISA技术分别检测Tiam 1 mRNA和蛋白的表达。采用细胞骨架蛋白染色及裸鼠接种法分别观察Tiam1ASODN转染后MH细胞在骨架结构和裸鼠体内成瘤转移能力方面的变化。结果:应用0.43μmol/LTiam 1 ASODN转染可特异性抑制胃癌MH细胞中Tiam 1 mRNA和蛋白表达(0.162±0.018,0.982±0.119),与脂质体转染组(0.789±0.054,1.237±0.108)、正义寡核苷酸(SODN)-脂质体转染组(0.754±0.039,1.234±0.103)、未转染组(0.801±0.065,1.290±0.182)相比,分别为后3者的20.2%～21.5%、76.1%～79.6%(P=0.000、0.037)。同时ASODN转染组细胞在裸鼠体内的肺转移率25%(2/8)也较未转染组88%(7/8)、正义寡核苷酸组75%(6/8)显著下降(P=0.039),且其胞膜表面突起及伪足变稀疏或缩短、骨架结构紊乱程度减轻。结论:特异性ASODN转染可有效抑制Tiam 1在胃癌细胞中的表达并削弱其体内侵袭转移能力,这可能是通过调整胃癌细胞骨架结构重组,降低其变形、游走能力而实现的。     

VEGF-C反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株SKOV3侵袭转移能力的影响

[目的]探讨VEGF—C反义寡核苷酸（VEGF—CASODN）对人卵巢癌细胞SKOV3侵袭转移能力的影响。[方法]以VEGF—C基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸，脂质体介导转染。MTT法检测卵巢癌细胞与细胞外基质Matrigel的黏附能力；体外侵袭实验检测卵巢癌细胞侵袭能力；Western blot检测细胞VEGF—C、MMP-2、E—cadherin蛋白表达。[结果]黏附实验结果显示VEGF—C ASODN转染后，在30min、60min、90min、120min各时间段与空白对照组、LIP组及SODN组相比，细胞黏附率都有明显下降（P〈0．01）：侵袭实验结果显示VEGF—CASODN转染48h后浸润细胞数目（62．5±8．71与空白对照组、LIF组和SODN组（分别为127.2±13．6、125．8±14．1、119．3±11．21相比明显减少（P〈0．01）；Western blot结果显示VEGF—C ASODN转染后细胞中VEGF—C、MMP-2蛋白表达与空白对照组、LIF组和SODN组相比明显下降，而E—cadherin蛋白表达明显增高（P〈0．01）。[结论]VEGF—C ASODN能明显抑制卵巢癌细胞体外实验中的侵袭转移能力，可望为卵巢癌提供一种有效的辅助治疗方法。     

MT1-MMP反义核酸抑制高转移人卵巢癌SW626细胞的侵袭效应

背景与目的:MT1-MMP(MMP-14)是新发现的一种膜型基质金属蛋白酶,研究表明MT1-MMP在肿瘤转移中发挥关键性作用。本研究应用反义核酸技术,观察了MT1-MMP反义核酸对高转移人卵巢癌SW626细胞体外生长和侵袭的抑制效应。方法:应用自行设计的引物,借助RT-PCR技术获得两端含不同限制酶位点的MT1-MMPcDNA片段,反向插入pcDNA3.1中,并应用脂质体介导的基因转染技术,将重组质粒导入SW626细胞中,应用MTT、Westernblot、明胶酶谱和体外侵袭实验等方法观察了SW626细胞转染前后,细胞生长、MT1-MMP蛋白表达、MMP-2和MMP-9酶活性及细胞体外侵袭能力等指标的变化。结果:成功构建了反义MT1-MMP真核表达载体(pMMP14as),将其转染入SW626细胞后,与空质粒转染组相比,MT1-MMP反义核酸转染组细胞MT1-MMP表达显著降低,抑制率为65.8%;MMP-2酶原的活化受到明显抑制;pMMP14as转染组的穿膜细胞百分数为(63.3±5.8)%,明显低于空质粒转染组(97.6±7.5)(P<0.05)%。结论:MT1-MMP反义核酸可明显抑制高转移SW626细胞体外生长和侵袭效应,提示MT1-MMP可作为人卵巢癌抗侵袭治疗的分子靶点。     

Tiam 1反义寡核苷酸转染对胃癌细胞体内外侵袭转移能力的影响

背景与目的:作为细胞骨架结构调节因子,T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam 1)与胃肠道肿瘤侵袭转移密切相关。本研究应用反义寡核苷酸(ASODN)转染技术,特异抑制胃癌细胞中Tiam1表达,进而观察对胃癌细胞体内、外侵袭转移能力的影响。方法:采用层粘连蛋白黏附法,由胃癌MKN-45细胞株(M0)中筛选获得高侵袭转移亚株(MH)。以脂质体介导将Tiam 1 ASODN转染至MH细胞中,并应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及定量细胞ELISA技术分别检测Tiam 1 mRNA和蛋白的表达。应用Boyden小室及裸鼠接种法分别观察ASODN转染后MH细胞在体内、外侵袭转移能力方面的改变。结果:应用0.43μmol/L Tiam 1 ASODN转染能特异性抑制胃癌MH细胞中Tiam1 mRNA和蛋白表达(0.162±0.018,0.982±0.119),与脂质体转染组(0.789±0.054,1.237±0.108)、正义寡核苷酸(SODN)-脂质体转染组(0.754±0.039,1.234±0.103)、未转染组(0.801±0.065,1.290±0.182)相比,分别约为后三者的20.2%~21.5%、76.1%~79.6%(P<0.05)。ASODN转染组细胞的体外侵袭、移行能力(10±3、21±9)较SODN转染组(27±10、56±13)、未转染组(26±6、53±12)明显受抑制(P<0.05),同时ASODN转染组细胞在裸鼠体内的肺转移率(1/5=20%)也较SODN转染组(4/5=80%)、未转染组(4/5=80%)显著下降(P<0.05)。结论:特异性ASODN转染可有效抑制Tiam1在胃癌细胞中的表达并削弱其体内、外侵袭转移能力。     

骨桥蛋白反义寡核苷酸抑制卵巢癌细胞SKOV3粘附侵袭的实验研究

目的研究骨桥蛋白（OPN）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）抑制人卵巢癌细胞株SKOV3粘附侵袭及诱导凋亡的作用。方法用脂质体将骨桥蛋白ASODN转染卵巢癌细胞SKOV3。实验分3组：对照组,随机序列寡核苷酸（random oligonucleotide,rODN）组和ASODN组。通过荧光定量RT-PCR、流式细胞仪检测法、黏附细胞计数法和Boyden小室法分别测定骨桥蛋白mRNA和细胞表面骨桥蛋白的蛋白表达及癌细胞黏附力、侵袭力的变化。Annexin V染色法、DNA ladder法和Hoechst染色法检测凋亡。结果转染后ASODN组骨桥蛋白mRNA的相对定量比值较对照组显著降低（1.95&#177;0.81 vs 5.26&#177;0.66,P〈0.01）;流式细胞仪检测骨桥蛋白表达结果显示,转染后平均荧光指数明显降低,细胞表面骨桥蛋白的蛋白表达下降（P〈0.01）;转染后ASODN组黏附力和侵袭力均较对照组显著下降（黏附细胞百分数值为16.97&#177;1.60 vs 36.14&#177;1.16,穿透聚碳酸酯膜细胞数为44.67&#177;2.08 vs 83.67&#177;4.51,P值均〈0.01）;经骨桥蛋白ASODN作用后SKOV3细胞发生凋亡。而rODN组上述各指标较对照组无明显变化。结论骨桥蛋白的表达与黏附侵袭能力密切相关,反义寡核苷酸能有效抑制卵巢癌细胞株SKOV3细胞骨桥蛋白基因的表达,从而抑制蛋白质的合成,降低其黏附侵袭能力,并能够诱导凋亡。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对肺癌A549细胞黏附、侵袭和凋亡的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人肺癌A549细胞黏附、侵袭和凋亡的影响。方法:设计并合成HPSE特异性ASODN(HPSE-ASODN),脂质体介导转染A549细胞。West-ern blotting检测A549细胞中HPSE蛋白的表达。黏附实验和侵袭实验检测HPSE-ASODN对A549细胞黏附和侵袭的影响,Hoecht 3222染色法检测HPSE-ASODN对A549细胞凋亡的影响。结果:与对照组和脂质体组相比,HPSE-ASODN转染下调A549细胞中HPSE蛋白的表达,且显著抑制A549细胞的黏附和侵袭(P<0.01);HPSE-ASODN转染可诱导A549细胞凋亡,凋亡率明显高于未转染组和脂质体组[(44.7±18.9)%vs(1.2±3.3)%、(5.8±20.1)%,P<0.01]。结论:HPSE-ASODN能下调肺癌A549细胞中HPSE蛋白的表达,抑制A549细胞的黏附和侵袭,诱导其凋亡。     

VEGF-C反义寡核苷酸对乳腺癌细胞MDA-MB-435黏附、侵袭能力的影响

目的　探讨 VEGF- C反义寡核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide,ASODN )对人乳腺癌细胞 MDA-MB- 4 35黏附、侵袭能力的影响。方法　以 VEGF- C基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸 ,脂质体介导转染。 RT-PCR法检测转染后 VEGF- C m RNA表达水平 ;MTT法检测乳腺癌细胞与细胞外基质黏附 ;利用 Transwell小室 ,检测乳腺癌细胞侵袭人工基底膜能力 ;Western- blot法检测乳腺癌细胞中 MMP- 2蛋白表达。结果　与空白对照及正义序列 (sense oligodeoxynucleotide,SODN)转染组比较 ,ASODN组 VEGF- C m RNA水平下调 ,差异有显著性 (t=5 .6 4 ,5 .4 8,P<0 .0 1) ;对胞外基质黏附率明显降低 (χ2 =7.15 ,7.2 9,P<0 .0 5 ) ,穿透重组基底膜数目显著下降 (t=5 .2 9,5 .17,P<0 .0 1) ;细胞裂解液中 MMP- 2蛋白表达显著下调 (t=7.36 ,7.4 3,P<0 .0 1)。结论　 VEGF- C基因 ASODN脂质体介导转染可明显抑制乳腺癌细胞体外实验中的黏附和侵袭能力 ;下调 MMP- 2的表达可能是其作用途径。     

RhoA、RhoC及其效应分子ROCK-1的表达与卵巢癌细胞系恶性行为相关性的体外研究

目的　研究RhoA、RhoC及其效应分子ROCK 1在卵巢癌细胞中的表达水平 ,探讨其与卵巢癌转移的相关性。方法　逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测RhoA、RhoC及ROCK 1在SW6 2 6、Skov 3、A2 780和Caov 34种卵巢癌细胞中mRNA的表达水平 ;Westernblot法检测RhoA和ROCK 1蛋白质的表达情况 ;Boyden小室体外侵袭试验测定 4种卵巢癌细胞的体外迁移与侵袭能力。结果　RhoA、RhoC和ROCK 1在 4种卵巢癌细胞中呈不同程度表达 ,其中仅RhoC的表达水平与癌细胞侵袭力和迁移能力呈正相关 (r=0 .95 ,P <0 .0 1)。RhoA在转录水平和蛋白水平中呈不同步变化 ,且RhoA和RhoC的表达与ROCK 1的表达无相关性。 4种卵巢癌细胞的体外侵袭和迁移能力相一致 ,其中SW6 2 6最强 ,Caov 3最弱 ,Skov 3和A2 780居中。结论　RhoC的表达与卵巢癌细胞的体外侵袭和迁移能力相关 ,可能作为一个独立因素在卵巢癌的转移过程中起作用 ,有望成为阻断卵巢癌转移的新靶点。     

Down-regulation of MT1-MMP expression suppresses tumor cell invasion in metastatic human SW626 ovarian cancer cells

Membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP/MMP-14) is a key enzyme involved in degradation of extracellular matrix (ECM) and various surface-associated proteins that control cell growth, differentiation and survival, plays crucial roles in molecular carcinogenesis, tumor cell growth, invasion, and angiogenesis. We tested the inhibitory effect of antisense MT1-MMP on the ability of metastatic human ovarian carcinoma cell line SW626 in proliferation and invasion. RT-PCR was used to amplify MT1-MMP cDNA fragments with two different restriction sites at its 5'-end. Antisense MT1-MMP cloned in eukaryotic expression vector pMMP14as was transfected into SW626 cells. MT1-MMP protein expression, activities of MMP-2 and MMP-9, changes of cell proliferation, and cell invasion ability were detected by Western blot, optimized gelatin zymography, MTT assay and matrigel in vitro invasion assay, respectively. After 48 h transfection, decreased expression of endogenous MT1-MMP protein was detected in pMMP14as-transfected SW626 cells and showed significantly lower proliferation level when compared with control cells. The activation of proMMP-2 was inhibited markedly, and the mean percentage of invasive cells was 63.30+/-5.80% in pMMP14as-transfected cells, which was less than that (97.60+/-7.50%) in control cells (P<0.05). Both cell proliferation and invasion in SW626 cells were inhibited effectively by antisense MT1-MMP transfection, suggesting that MT1-MMP may be a proper target molecule for anti-invasion therapy for human ovarian cancers.     

Secretion of soluble complement inhibitors factor H and factor H-like protein (FHL-1) by ovarian tumour cells

We observed that the soluble complement regulators factor H and factor H-like protein were abundantly present in ascites samples as well as in primary tumours of patients with ovarian cancer. RT-PCR and immunoblotting analyses showed that the two complement inhibitors were constitutively produced by the ovarian tumour cell lines SK-OV-3 and Caov-3, but not PA-1 or SW626 cells. The amounts of factor H-like protein secreted were equal to those of factor H. This is exceptional, because e.g. in normal human serum the concentration of factor H-like protein is below 1/10th of that of factor H. In ascites samples the mean level of factor H-like protein (130+/-55 microg ml(-1)) was 5.5-fold higher than in normal human serum (24+/-3 microg ml(-1)). Ovarian tumour cells thus preferentially synthesise factor H-like protein, the alternatively spliced short variant of factor H. The tumour cells were found to bind both (125)I-labelled factor H and recombinant factor H-like protein to their surfaces. Surprisingly, the culture supernatants of all of the ovarian tumour cell lines studied, including those of PA-1 and SW626 that did not produce factor H/factor H-like protein, promoted factor I-mediated cleavage of C3b to inactive iC3b. Subsequently, the PA-1 and SW626 cell lines were found to secrete a soluble form of the membrane cofactor protein (CD46). Thus, our studies reveal two novel complement resistance mechanisms of ovarian tumour cells: (i) production of factor H-like protein and factor H and (ii) secretion of soluble membrane cofactor protein. Secretion of soluble complement inhibitors could protect ovarian tumour cells against humoral immune attack and pose an obstacle for therapy with monoclonal antibodies.     

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞 SKOV3的抑制作用

背景与目的:在大多数肿瘤组织中都发现了 survivin的异常高表达,这说明 survivin在肿瘤发生中具有重要作用.本研究探讨 survivin反义寡核苷酸 (survivin ASODN)对人卵巢癌细胞 SKOV3的抑制作用及其机制.方法:脂质体介导 survivin反义寡核苷酸转染 SKOV3,用 MTT法检测细胞抑制率. Western blot法检测相关基因蛋白表达,应用流式细胞术、梯形 DNA片段分析及 DAPI染色光镜观察细胞凋亡情况.激酶活性检测方法测定半胱氨蛋白水解酶 3( caspase-3)活性的变化.结果:脂质体介导 survivin反义寡核苷酸转染后, SKOV3细胞的生长受到明显抑制, 1 000 ng/ml ASODN转染组的细胞抑制率为( 60.30± 2.95)%,明显高于对照组( P< 0.05).凋亡细胞比率由转染前的 0.65%增加至 32.10% ,SKOV3细胞内 survivin基因蛋白表达下调 26.3%, caspase-3活性为 0.998± 0.001,较对照组显著增高( P< 0.01).结论: Survivin ASODN可通过诱导细胞凋亡抑制细胞生长, 具有明显的抗癌作用.     

Rac1活化在大肠癌细胞SW480迁移侵袭中的作用

目的研究Racl的活化在大肠癌迁移侵袭中的作用。方法对大肠癌SW480细胞株,分别导入活化的Rac1 L61重组体和对照用质粒;采用配体结合免疫共沉淀法通过Western blot检测细胞中活化Rac1的含量,进一步用。Transwell小室研究具有不同活性Rac1的SW480细胞其迁移及侵袭能力。结果SW480细胞的转染效率高达80%以上,配体结合免疫共沉淀结果显示,转染Rac1 L61重组体后Rac1的活性显著高于对照组;应用Transwell小室对SW480细胞迁移及侵袭能力研究时,发现Rac1活性高的实验组迁移及侵袭的细胞数显著高于对照组(迁移细胞数43±9:22±5, P<0.01;侵袭细胞数73±13:38±1,P<0.01)。结论Rac1的活化在大肠癌迁移侵袭中起重要的作用。     

CAR抑制卵巢癌细胞株SKOV3侵袭转移表型的研究

背景与目的:柯萨奇-腺病毒受体(coxsackieandadenovirusreceptor,CAR)最早作为2,5型腺病毒的受体而被人们发现和认识,近年的研究发现它还是粘附分子家族的一员,并参与肿瘤恶性表型改变。本研究通过转染真核表达载体,探讨其对卵巢癌细胞株SKOV3侵袭转移表型的影响。方法:利用Westernblot和RT-PCR检测4株卵巢癌细胞CAR的表达;脂质体介导转染含有全长CAR基因的真核表达质粒至SKOV3细胞,经G418筛选出稳定表达的阳性细胞克隆;体外粘附实验及软琼脂克隆形成实验验证CAR对SKOV3侵袭转移表型的影响。结果:4株卵巢癌细胞中,CAR表达水平不同程度下调,其中SKOV3细胞CAR表达缺失。转染后,SKOV3细胞CARmRNA和蛋白质水平表达均明显增高;细胞间粘附力明显增强;软琼脂克隆实验显示转染细胞每孔克隆形成数(25.3±8.9)明显低于未转染组(88.8±14.0)和转染空质粒组(82.5±19.4)。结论:外源性CAR基因的导入可以增强卵巢癌细胞SKOV3间的粘附性,从而抑制肿瘤细胞的侵袭转移表型。     

survivin反义寡核苷酸提高人肺腺癌A549耐药细胞系对顺铂敏感性的研究

目的探讨存活素反义寡核苷酸(ASODN)体外转染对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/ CDDP凋亡及其对顺铂(CDDP)敏感性的影响。方法常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的survivin ASODN转染细胞,采用RT-PCR法和免疫细胞化学法检测survivin mRNA及蛋白表达。通过形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、caspase-3酶活性及细胞凋亡率(AI)的测定,评价细胞凋亡程度。采用MTT法测定细胞存活率和生长抑制率,计算半效抑制浓度(IC_(50))及耐药倍数(RI)。结果转染组survivin mRNA及蛋白表达下调明显,分别达41．56%和0．864±0．045,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。细胞形态学显示有细胞凋亡改变,表现为细胞核固缩、核边集和核碎裂等;DNA凝胶电泳可见DNA梯形条带;ASODN转染组细胞凋亡率和caspase-3相对活性分别增高至34．03%和1．1298±0．2502,而ASODN+CDDP组增高更为明显,分别达65．85%和1．6805±0．2758,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。ASODN转染组和ASODN+CDDP组生长抑制率分别增高至59．3%和83．7%(P＜0．05);而ASODN转染组细胞对CDDP的IC_(50)由对照组的(225．03±10．59)μmol/L减低至(158．84±4．26)μmol/L,RI由11．9减至8．4。结论survivin ASODN通过下调survivin的表达,自身诱导了细胞凋亡,并逆转细胞对CDDP诱导的细胞凋亡的耐受,降低凋亡阈值,从而增强了人肺腺癌细胞对CDDP的敏感性。     

层黏连蛋白受体反义核酸对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究67 kD层黏连蛋白受体(67kDLN-R)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对卵巢癌细胞HRA体外侵袭转移能力的影响.方法:采用流式细胞仪、RT-PCR及Transwell小室的方法检测反义核酸对67 kD LN-R基因和蛋白表达影响,及转染前后细胞体外侵袭转移能力变化.结果:67 kD LN-R ASODN可从蛋白质和mRNA水平下调67kDLN-R的表达,且下调作用呈剂量依赖性.与正义组及对照组相比差异有显著性(P＜0.05).体外侵袭实验证实转染后HRA穿透人工基底膜的能力显著降低并呈现剂量依赖性.结论:67kDLN-R ASODN可降卵巢癌细胞体外侵袭转移能力,有望为卵巢癌治疗提供新方向.