VEGF特异siRNA对骨肉瘤细胞凋亡和仿血管发生的影响

目的：探讨VEGF特异siRNA在骨肉瘤细胞株（MG63）增殖、凋亡以及仿血管发生中的作用。方法：以pSilienc-er载体构建VEGF特异siRNA质粒pSilencer-VEGF siRNA,并转染骨肉瘤细胞MG63;将细胞分为pSilencer-VEGF siRNA质粒组（试验组）和空siRNA质粒组（对照组）,Western blotting在蛋白水平检测转染重组质粒后MG63细胞VEGF表达情况;MTT比色法、光镜、流式细胞仪结合Annexin V-FITC/PI染色和H-E染色观察质粒转染后骨肉瘤细胞增殖、凋亡和仿血管发生情况。结果：测序证实成功构建了针对VEGF的siRNA重组质粒。转染pSilencer-VEGF siRNA重组质粒后的试验组培养液中及骨肉瘤细胞内VEGF蛋白表达下降;转染后48、72、96h骨肉瘤细胞的增殖抑制率分别为41.67%、43.92%、35.32%,并发生了早期凋亡,凋亡率为28.27%。转染pSilencer-VEGF siRNA重组质粒的骨肉瘤细胞未见仿血管发生,转染空质粒的对照组骨肉瘤细胞则有仿血管发生。结论：RNA干扰VEGF基因能抑制骨肉瘤细胞增殖,促进骨肉瘤细胞早期凋亡,干扰骨肉瘤细胞仿血管发生,为临床基因治疗骨肉瘤提供了新的思路。     

RNA干扰沉默mdm2治疗骨肉瘤的实验研究

目的 观察靶向mdm2的小干扰RNA(siRNA)对骨肉瘤生长的影响.方法 构建PGCsilencerTM-mdm2 siRNA,转染至骨肉瘤细胞U2OS.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测siRNA对mdm2的沉默效果,采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测siRNA对细胞增殖的影响,应用流式细胞术检测诱导细胞凋亡的情况.通过裸鼠移植瘤模型观察siRNA对骨肉瘤体内治疗效果.结果 成功构建simdm2质粒.在转染simdm2的U20S细胞中,simdm2-1组和simdm2-2组的mdm2 mRNA表达量分别下降至空白对照组的35.6%和42.1%(P<0.05),mdm2蛋白表达分别降低至空白对照组的34.0%和47.2%(P<0.05),而且增殖能力显著降低,发生明显凋亡,simdm2-1组和simdm2-2组的细胞凋亡率分别为29.9%和20.9%.阴性对照组和空白对照组的差异无统计学意义.裸鼠移植瘤实验结果显示,simdm2转染组的肿瘤受到抑制,而且mdm2基因和蛋白表达明显下调.结论 simdm2能有效的抑制骨肉瘤生长,并抑制mdm2基因和蛋白的表达.     

靶向生存素基因siRNA诱导骨肉瘤细胞株U-2OS的凋亡

目的:体外转录合成生存素(survivin)基因siRNA,观察其在骨肉瘤细胞株U-2OS中抑制survivin基因后细胞增殖及细胞凋亡情况.方法:将U-2OS细胞分为A组(空白对照组)、B组(非特异性转染组)、C组(特异性转染组),在荧光显微镜下观察转染前后细胞形态的改变,用RT-PCR和Western blot法分别检测转染前后survivin基因mRNA和蛋白的干涉效果,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并比较各组结果.结果:荧光显微镜下可见转染后细胞增殖变慢,凋亡细胞增加;RT-PCR结果显示survivin siRNA明显抑制survivin基因mRNA表达.Western blot法检测C组蛋白阳性表达率比A、B两组显著降低(P＜0.01);特异性转染组的细胞增殖缓慢,与其它两组比较有显著性差异(P＜0.01).流式细胞仪检测C组细胞凋亡率与其他两组比较有显著性差异(P＜0.01).结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制U-2OS细胞中survivin mRNA及蛋白表达,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.RNA干扰技术为骨肉瘤的基因治疗提供了一种新策略.     

靶向Bcl-xL基因siRNA在前列腺癌细胞增殖和凋亡中的作用

目的研究Bcl-xL基因特异性RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞株体外增殖能力和凋亡的影响。方法构建靶向Bcl-xL的小干扰RNA(siRNA)表达载体,转染PC-3细胞后,采用半定量RT-PCR和Western blot法检测转染前后Bcl-xL mRNA及蛋白表达水平的改变;采用噻唑兰(MTT)法检测细胞生长增殖情况;TUNEL试剂盒测定细胞的凋亡情况。结果靶向Bcl-xL的序列特异性的siRNA可以有效地抑制PC-3细胞Bcl-xL基因的表达。转染靶向Bcl-xL的siRNA表达质粒可以显著抑制PC-3细胞的增殖（P<0.001）,诱导细胞凋亡（P<0.001）。结论Bcl-xL基因特异性RNA干扰可以显著抑制前列腺癌PC-3细胞的体外增殖并诱导细胞凋亡。     

Stathmin siRNA表达载体的构建及对LM8细胞生物学行为的影响

背景与目的:Stathmin在多种恶性肿瘤细胞中都有高水平表达,通过抑制其表达可以干扰恶性肿瘤细胞的分裂,影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。本研究构建并观察stathmin基因RNA干扰表达载体转染LM8细胞系后对stathmin表达及细胞生物学行为的影响。方法:构建靶向stathmin干扰质粒pGenesil-1-Stathmin和通用对照质粒pGenesil-1-HK,以脂质体法将2个重组质粒分别转染骨肉瘤LM8细胞系。实时荧光定量PCR和Western印迹技术检测各组LM8细胞系stathmin在mRNA和蛋白水平的表达,MTT(噻唑蓝)法比色分析检测细胞体外生长抑制率,软琼脂集落形成实验观察单个细胞体外增殖活力,细胞HE染色观察细胞形态学的变化,Hoechst染色观察细胞凋亡特征并计算凋亡率,流式细胞术定量分析细胞周期变化,C3H小鼠移植瘤实验显示肿瘤细胞成瘤能力。结果:DNA测序证实成功构建pGenesil-1-Stathmin重组质粒。转染LM8细胞后,明显抑制stathmin基因表达;细胞体外生长抑制率显著增加;单个细胞体外增殖活力显著下降;细胞HE染色部分细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变;Hoechst染色显示细胞凋亡特征,细胞凋亡率明显高于对照组;流式细胞术检测显示细胞周期阻滞于G2/M期,明显高于对照组;C3H小鼠移植瘤实验显示特异转染组致瘤率下降,肿瘤生长减缓。结论:成功构建的靶向干扰质粒pGenesil-1-Stathmin能有效抑制stathmin基因在骨肉瘤LM8细胞的表达并影响其相关生物学行为,其抑制骨肉瘤细胞的增殖与生长,为stathmin基因应用于骨肉瘤的基因治疗研究奠定了理论基础。     

RNA干扰抑制Skp2表达对人喉癌细胞系Hep-2的影响

[目的]研究RNA干扰抑制Skp2表达对喉癌鳞状细胞p27表达、细胞增殖和凋亡的作用.[方法]利用脂质体将重组质粒转染Hep-2细胞,用慢病毒系统建立干扰Skp2基团的稳定细胞株;荧光实时定量PCR和Western blot法检测转染细胞株中Skp2和p27mRNA及其蛋白表达;采用MTr法和流式细胞仪检测转染细胞的增殖和凋亡情况.[结果]通过慢病毒siRNA技术,Skp2可持续稳定抑制Hep2喉癌细胞,siRNA可诱导抑制Skp2,增加p27表达,降低细胞增殖,增加喉癌细胞的凋亡.[结论]靶向Skp2基因的siRNA对Hep-2细胞的抑制作用可能是通过上调p27基因水平来实现的,Skp2是基因疗法治疗喉癌的有利靶点.     

促凋亡基因PDCD5在骨肉瘤U2-OS细胞表达及对其促凋亡作用的研究

目的:观察外源性PDCD5基因对骨肉瘤细胞系U2-OS的促凋亡作用。方法:扩增重组质粒PCI-neo-PDCD5,采用脂质体转染的方法,将PDCD5基因转染骨肉瘤细胞U2-OS,RT-PCR检测转染后表达情况;撤除血清培养16h后,四甲基偶氮唑盐MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况;An-nexinV-染色流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白质印迹法分析凋亡通路。结果:转染骨肉瘤细胞U2-OS后,RT-PCR检测到PDCD5的表达,MTT实验发现撤除血清后转染重组质粒组细胞的增殖被明显抑制。于转染空载体和对照组细胞相比,存活细胞明显减少,P<0.001。AnnexinV染色,流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与转染空质粒组(凋亡率为1.47%)相比,其凋亡率为10.28%。经PDCD5处理的细胞中,Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的表达与对照组比较,差异均有统计学意义。结论:PDCD5基因可以在转染的骨肉瘤细胞系U2-OS细胞中表达,并在撤出血清因素的诱导作用下可显著抑制转染细胞的生长,并通过线粒体激活途径发挥促凋亡作用并诱导细胞发生凋亡。     

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的：构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促调亡作用。方法：通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接,构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv/tBid载体,转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,Annexin V染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果：流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv/tBid。重组质粒转染E10细胞后,间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达;细胞色素C在细胞质中出现;细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16.1% vs 4.5%）;TUNEL染色显示,E10细胞出现典型的凋亡特征。结论：重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达,并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。     

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用。方法通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接，构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv／tBid载体，转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化，AnnexinV染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv／tBid。重组质粒转染E10细胞后，间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达；细胞色素C在细胞质中出现；细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。AnnexinV染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16．1％VS4．5％）；TUNEL染色显示，E10细胞出现典型的凋亡特征。结论重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达，并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。     

靶向Survivin的siRNA对胰腺癌细胞PC-2的放射增敏作用

目的采用RNA干扰技术阻断Survivin基因的表达,观察其诱导胰腺癌细胞凋亡及对放射的增敏作用。方法构建靶向Survivin的siRNA真核表达载体,采用lipofectamineTM2000转染胰腺癌细胞PC-2,采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞Survivin基因表达的变化;采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡及对放射的增敏作用。结果靶向Survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制PC-2细胞Survivin基因的表达,在mRNA水平其表达抑制率为81.25%;在蛋白质水平其表达抑制率为74.24%;转染靶向Survivin的siRNA真核表达载体48h后可以诱导7.03%的细胞凋亡;阻断Survivin基因的表达,可以显著提高PC-2细胞对放射的敏感性,靶向Survivin的siRNA联合放射可以诱导14.58%的细胞凋亡。结论本研究所构建的靶向Survivin的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断Survivin基因的表达,阻断Survivin基因的表达可以诱导一定程度的PC-2细胞的自发凋亡,并显著增强其对放射的敏感性。靶向Survivin的RNA干扰技术在胰腺癌的基因治疗中具有重要的潜在价值。     

siRNA干扰FoxM1基因表达对人骨肉瘤MG63细胞增殖与凋亡影响研究

目的通过抑制骨肉瘤细胞株MG63中FoxM1基因表达,观察对骨肉瘤细胞系增殖与凋亡的影响。方法采用蛋白质印迹法检测不同人骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607中FoxM1基因的表达。将骨肉瘤细胞株MG63分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组转染FoxM1特异性siRNA（FoxM1-siRNA）,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做处理。实时-聚合酶链反应（Real-time PCR）和蛋白质印迹法检测转染前后FoxM1基因在mRNA及蛋白表达水平的变化;四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖率,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果人骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607中存在FoxM1基因的表达。实验组MG63细胞转染siRNA后,FoxM1的mRNA表达为0.39±0.09,低于阴性对照组的0.91±0.07,t=7.92,P〈0.001;也低于空白对照组的0.96±0.08,t=8.68,P〈0.001。实验组FoxM1蛋白表达为0.31±0.06,显著低于阴性对照组的0.81±0.10,t=7.20,P〈0.001;也低于空白对照组的0.89±0.09,t=8.35,P〈0.001。实验组MG63细胞增殖率为0.36±0.03,显著低于阴性对照组的0.61±0.02,t=12.86,P〈0.001;也低于空白对照组的0.65±0.02,t=14.92,P〈0.001。实验组MG63细胞凋亡率为（13.69±1.15）%,显著高于阴性对照组的（2.38±0.90）%,t=14.16,P〈0.001;也高于空白对照组的（2.87±0.86）%,t=13.54,P〈0.001。结论人骨肉瘤细胞株中存在FoxM1蛋白的表达;特异性siRNA可下调骨肉瘤细胞株MG63中FoxM1基因的表达,对细胞的增殖具有负性调控作用,并能诱导细胞凋亡。     

RNA干扰FGFR3基因表达诱导骨肉瘤细胞凋亡及下调Wnt信号通路的 研究

目的:探讨RNA干扰人成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）基因表达对骨肉瘤细胞凋亡及Wnt信号通路的影响。方法:以LipofectamineTM 2000为载体，参照其转染说明将设计合成的2个针对FGFR3的特异性siRNA及阴性对照siRNA转染人骨肉瘤MG63细胞，同时设置空白对照组，转染48 h，Western blotting检测FGFR3、β-catenin、Survivin和Bax蛋白的表达；流式细胞术检测细胞凋亡率；二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFHDA）探针检测活性氧（ROS）含量。结果:2个FGFR3 siRNA转染MG63细胞后FGFR3蛋白表达均明显受到抑制，与空白对照组及NC组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。MG63细胞转染FGFR3 siRNA后细胞凋亡率明显升高，ROS含量明显升高，β-catenin和Survivin蛋白的表达明显降低，Bax蛋白的表达明显升高，与NC组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:RNA干扰FGFR3基因表达可诱导骨肉瘤细胞凋亡，机制可能与细胞内ROS含量升高及Wnt信号通路下调有关。     

沉默TRIM29对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向三联基序蛋白29（TRIM29）对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测骨肉瘤细胞株（MG63和U2OS）的TRIM29水平,采用脂质体法将两条靶向TRIM29的siRNA片段（siTRIM29-1和siTRIM29-2）高效转染至MG63和U2OS细胞,经QPCR法检测后选取抑制效率最高的siRNA进行后续实验,并设转染siControl的MG63和U2OS细胞为对照;分别采用MTT、流式细胞术及Transwell 法检测转染后MG63和U2OS细胞的增殖、凋亡及侵袭情况。结果 QPCR检测结果显示MG63和U2OS细胞的TRIM29 mRNA水平较正常成骨细胞株hFOB1-19均升高（P＜0.05）;MG63和U2OS细胞转染siTRIM29-1和siTRIM29-2片段72 h后的TRIM29 mRNA水平均低于转染siControl的细胞,差异均有统计学意义（P＜0.05）,同时选取沉默率较高的siTRIM29-1进行后续实验;与转染siControl的MG63和U2OS细胞相比,两种细胞转染siTRIM29-1后的存活率及穿膜细胞数目减少,凋亡率升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 骨肉瘤细胞中TRIM29高表达,且靶向沉默TRIM29可抑制骨肉瘤细胞增殖及侵袭并诱导细胞凋亡,对骨肉瘤靶向治疗有一定参考价值。     

沉默Epha2对前列腺癌PC3细胞生物学性状与血管生成拟态的影响

目的 探究沉默Epha2基因对前列腺癌PC3细胞生物学性状的改变及对血管生成拟态的影响.方法 培养人前列腺癌细胞株PC3(高表达EGFR,对EGFR-TK1吉非替尼敏感),筛选对Epha2基因具有有效下调作用的siR-NA序列,并利用筛选得到的有效siRNA转染PC3细胞,分别在RNA水平与蛋白水平观察Epha2的下调效果;转染细胞后,加入吉非替尼共培养48 h后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡;同时,观察转染后对三维培养的模型条件下PC3血管生成拟态的影响.结果 从设计的四条siRNA中筛选得到一条最有效下调Epha2基因表达的序列,利用该siRNA转染前列腺癌细胞PC3后,与对照组相比明显增强了吉非替尼诱导PC3细胞的凋亡,同时减少了PC3在三维培养条件下的血管生成拟态.结论 抑制Epha2基因的表达可促进前列腺癌细胞PC3的凋亡,减少PC3的血管生成拟态,Epha2基因可作为临床治疗前列腺癌的靶点.     

沉默 H19对骨肉瘤细胞系 MG63增殖、侵袭的影响

目的：研究长链非编码 RNA H19对骨肉瘤 MG63细胞增殖、侵袭的影响。方法：RNA 干涉技术沉默MG63细胞中 H19,荧光实时定量 PCR（RT －qPCR）检测骨肉瘤 MG63细胞中 H19的表达情况;流式细胞术检测细胞周期的变化;MTT 实验检测沉默 H19表达对细胞增殖的影响;Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果：H19－siRNA 可有效沉默 H19在骨肉瘤细胞 MG63中的表达,沉默 MG63细胞中 H19的表达可以明显抑制骨肉瘤细胞的细胞周期,降低骨肉瘤细胞的增殖、侵袭能力。结论：H19在骨肉瘤的发生发展及侵袭中发挥重要作用。     

The Role of VE-cadherin in Osteosarcoma Cells

Osteosarcoma cells can generate vasculogenic-like, patterned networks to obtain nutrients and oxygen, which mimic some function of endotheial-like cells and facilitate tumor malignant progress. These cells also express vascular endothelial-cadherin (VE-cadherin), which is generally accepted as a strictly endothelial-specific transmembrane protein. However, its role is still relatively obscure in osteosarcoma cells. So we inhibit the VE-cadherin gene expression with siRNA in osteosarcoma cells (MG63), and culture those cells in three-dimensional medium, containing Type I collagen or Matrigel, to observe the role of VE-cadherin. Western blotting analysis show that sequence-specific siRNA can significantly decrease the expression of VE-cadherin in MG63 cell. After knockdown of VE-cadherin, osteosacoma cells cann’t induced angiogenic sprout and form osteosarcoma-generated, endotheial-like networks. Our data indicate that VE-cadherin may be a positive and specific regulator not only in angiogenesis, but also in vasculogenic mimicry of osteosarcoma cells. And it can be considered as a new prospective option in the combining treatment of aggressive tumor with highly vascularity, including osteosarcoma.     

大黄酸通过抑制STAT3基因的表达调控骨肉瘤细胞的增殖和凋亡

目的:探讨大黄酸对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及潜在的作用机制。方法:以人骨肉瘤MG-63细胞为研究对象,利用CCK-8实验检测大黄酸对MG-63细胞增殖的影响,并计算大黄酸作用48 h的半数抑制浓度（IC50）,采用该浓度进行后续的实验。转染STAT3 siRNA至MG-63细胞,qRT-PCR和Western blot检测分别在mRNA和蛋白水平上检测转染效果,采用CCK-8实验、克隆形成实验、流式细胞术验证大黄酸和STAT3 siRNA及其联合作用对MG-63细胞存活率、克隆形成、凋亡能力的影响,Western blot检测各组MG-63细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3的表达情况。结果:大黄酸能够呈浓度依赖性的抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖,干预48 h的IC50为46.05 μmol/L。大黄酸或STAT3 siRNA均能降低MG-63细胞中STAT3的表达,抑制MG-63细胞存活率,阻碍细胞克隆形成能力,促进细胞凋亡,上调细胞中Bax和Cleaved Caspase-3的表达,下调Bcl-2的表达;且二者联合效果更显著。结论:大黄酸通过抑制STAT3基因表达抑制骨肉瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。     

MicroRNA-145对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响

背景与目的 MicroRNA145(miRNA145)是microRNA家族中的重要一员,已被证实在多种肿瘤细胞中呈现低表达,并认为miRNA 145作为一种抑癌基因可以影响肿瘤细胞的生长和侵袭能力,但其在骨肉瘤中的作用未见相关报道.该研究旨在探讨miRNA145对骨肉瘤细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响.方法 用脂质体法将miRNA145真核表达质粒瞬时转染入人骨肉瘤细胞(MG63),实验设置空白对照组、空载体转染组和miRNA145质粒转染组3组,转染后荧光显微镜下观察转染效率,实时定量RT-PCR检测各组细胞miRNA145的表达,MTT增殖实验检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡率.结果 转染后miRNA145质粒转染组细胞增殖速度明显下降,细胞周期停止在G1期之前,凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 miRNA145可以有效地抑制骨肉瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡.