bcr-ab1和白介素-7共表达基因疫苗诱导小鼠免疫保护作用

目的探讨小鼠白介素-7(IL-7)基因对bcr-abl融合基因疫苗诱导机体免疫应答的影响。方法采用pVbcr-abl/mIL-7质粒免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清中bcr-abl特异性抗体水平。以转染bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞为靶细胞,用LDH释放实验检测免疫小鼠脾细胞特异性细胞毒活性。结果pVbcr-abl/mlL-7质粒能诱导小鼠产生血清特异性抗bcr-abl抗体,pVbcr-abl/mIL-7免疫组的血清特异性抗体滴度高于pVbcr-abl免疫组,脾细胞杀伤SP2/0/bcr-abl靶细胞的细胞毒活性明显增强。结论共表达bcr-abl和mIL-7的基因疫苗能在小鼠体内诱导较高的特异性体液免疫和细胞免疫水平,为慢性粒细胞白血病基因疫苗的临床前实验研究提供了依据。     

融合基因pEGFP-C3-B7.2-hTERT诱导小鼠免疫应答及抑制肝癌移植瘤

目的：构建融合DNA疫苗pEGFP-C3-B7．2-hTERT，观察其诱导小鼠免疫应答的能力和抗小鼠肝癌H22细胞移植成瘤的作用。方法：通过RT-PCR扩增B7．2和hTERT cDNA，以pEGFP-C3为载体构建pEGFP-C3-B7．2-hTERT融合基因质粒，肌肉注射接种C57BL／6小鼠，间隔7d，共3次，以注射接种pEGFP-C3-B7．2、pEGFP-C3-hTERT、pEGFP-C3和PBS为对照。检测免疫小鼠脾淋巴细胞CTL杀伤活性、脾细胞培养上清IL-2和IFN-γ水平、外周血淋巴细胞亚群变化及血清中抗hTERT抗体水平。将融合基因pEGFP-C3-B7．2-hTERT免疫已负荷肝癌细胞H22／hTERT或H22／B7．2的小鼠，观察小鼠成瘤时间、生存时间。结果：琼脂糖凝胶电泳、酶切及序列测定证实，成功构建了融合基因质粒pEGFP-C3-B7．2-hTERT。融合基因免疫小鼠的脾淋巴细胞对B7．2-hTERT阳性靶细胞的杀伤活性明显高于各对照组（P〈0．01），每只pEGFP-C3-B7．2-hTERT免疫小鼠都产生了抗体，免疫鼠外周血CD4^＋、CD8^＋ T细胞和脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2水平较各对照组明显升高（均P〈0．01）。pEGFP-C3-B7．2．hTERT融合基因质粒免疫已负荷肝癌细胞H22／hTERT或H22／B7．2的小鼠后，小鼠60d未成瘤，其他各组22d时所有小鼠均已成瘤，60d时均死亡。结论：DNA疫苗pEGFP-C3-B7．2-hTERT在体内能诱导出明显的B7．2-hTERT特异性的抗肿瘤免疫应答，且能抑制体内已经存在的少量肿瘤细胞的成瘤。     

异位hCGβ-CTP37基因疫苗的抗肿瘤作用

目的 :研究异位hCGβ CTP37基因免疫诱导的肿瘤特异性免疫应答及其抗肿瘤作用 ,为肿瘤的免疫生物治疗寻求新途径。方法 :分离获取异位hCGβ CTP37的编码基因 ,并将 4拷贝基因以头尾串联形式克隆于真核表达载体TR42 1构建重组质粒TR42 1 CTP37.4,以PCR、酶切和DNA序列测定进行鉴定 ;肌内注射法对BALB/c小鼠实施 3次基因免疫 (1 0 0 μg/ 1 0 0 μl) (每只小鼠 ) ,间隔 3周 ,并以空载质粒为对照。ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗hCGβ IgG抗体 ;免疫小鼠脾细胞经特异性抗原hCGβ刺激后 ,用3H TdR掺入法和同位素释放法分别检测其特异性淋巴细胞增殖活性和CTL细胞毒活性 ;皮下接种SP2 / 0 hCGβ细胞攻击免疫小鼠 ,以成瘤率及实体瘤重量评估体内抗瘤效果。结果 :TR42 1 CTP37.4质粒免疫小鼠产生了较高水平的抗hCGβ IgG抗体 ,与空载质粒组有显著差异 ;hCGβ蛋白刺激TR42 1 CTP37.4质粒免疫小鼠脾细胞生产了高水平的特异性淋巴细胞增殖活性 ,且明显高于空载质粒免疫小鼠 ;特异抗原诱导的TR42 1 CTP37.4质粒免疫小鼠脾细胞对SP2 / 0 hCGβ细胞的CTL活性明显高于SP2 / 0 preS2 /S细胞 P <0 .0 1 ) ;空质粒免疫小鼠接种SP2 / 0 hCGβ细胞后成瘤率为 1 0 0 % ,瘤重达 3 .37g,而TR42 1 CTP37.4质粒免     

异位hCGβ基因免疫诱导的特异性抗肿瘤免疫应答

目的　观察异位hCGβ基因免疫诱导的肿瘤特异性免疫应答及其抗肿瘤作用 ,为肿瘤的免疫生物治疗寻求新途径。方法　构建含hCGβ编码基因的质粒TR4 2 1 hCGβ ,对BALB/c小鼠实施基因免疫 ,并以空质粒为对照。采用ELISA法和3 H TdR掺入法分别检测免疫小鼠血清中特异性抗hCGβ IgG抗体及其对肿瘤细胞体外生长的抑制作用 ;特异抗原体外刺激免疫小鼠脾细胞后 ,用3 H TdR掺入法和3 H TdR释放法分别检测其特异性增殖活性和细胞毒活性 ;皮下接种SP2 /0 hCGβ细胞攻击免疫小鼠 ,以成瘤率及实体瘤重量评估体内抗瘤效果。结果　全部TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠均产生高水平的抗hCGβ IgG抗体 ,该抗体可抑制肿瘤细胞的体外生长 ,与对照血清相比 ,差异有显著差性 (P <0 .0 5 ) ;hCGβ蛋白、灭活SP2 /0 hCGβ细胞以及两者混合均能刺激TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞的体外增殖 (SI值分别为 1.5 3、1.81和 2 .0 5 ) ,与空质粒免疫小鼠相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ;特异抗原刺激的TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞对SP2 /0 hCGβ细胞的细胞毒活性明显高于SP2 /0细胞(P <0 .0 1) ;空质粒免疫小鼠接种SP2 /0 hCGβ细胞后成瘤率为 10 0 % ,瘤重达 3.37g ,而TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠的成瘤率为 16 .6 6 % ,瘤重为     

PML-RARα-hIL-2DNA疫苗诱导BALB／C小鼠的细胞和体液免疫应答

目的分析PML-RARα融合基因疫苗诱导小鼠特异体液和细胞免疫应答情况。方法用成功构建的重组质粒（pIRES-PML-RARα-hIL-2）免疫小鼠后，分别利用ELISA法检测小鼠血清中INF-γ生成情况；LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL细胞针对APL细胞株NB4的杀伤率；用间接免疫荧光法检测血清中抗PML-RARα抗体。结果免疫后第7周时，小鼠血清中INF-γ含量、抗PML-RARα抗体及脾脏CTL细胞针对NB4的杀伤率均高于对照组。结论所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒可诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答。     

ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生的效应脾细胞过继免疫抗肿瘤作用的研究

目的:探讨ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生的效应脾细胞过继免疫在抗肿瘤中的作用.方法:通过转染建立稳定表达ehCGβ和HBV-preS2/S的细胞株Sp2/0-ehCGβ和Sp2/0-preS2/S.以TR421-hCGβ质粒实施基因免疫,免疫后检测小鼠脾细胞,特异性细胞毒活性;同期将脾细胞过继免疫给正常小鼠,以过继TR421-hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞为实验组、过继TR421质粒免疫小鼠脾细胞为对照组,检测脾细胞杀伤效应.结果:效应脾细胞对SP2/0-ehCGβ的杀伤率明显高于Sp2/0-preS2/S(P＜0.05).Sp2/0-ehCGβ在实验组小鼠仅2只形成实体瘤,TR421-hcGβ质粒基因免疫抗肿瘤任用有肿瘤特异性,两组有显著性差异(P＜0.05),而在对照组小鼠均形成实体瘤.Sp2/0-preS2/S在所有的小鼠均形成了实体瘤,其瘤重无显著性差异.结论:ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生的效应细胞可特异性杀伤肿瘤,过继免疫效应细胞能使正常小鼠获得明显的特异性抗肿瘤能力.     

血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体肿瘤疫苗的免疫活性

目的:采用噬菌体展示技术,构建人血管内皮生长因子重组T7噬菌体疫苗,并检验疫苗诱导小鼠产生特异性抗体的免疫活性。方法:将人VEGF165基因与T7Select10-3b噬菌体基因重组,构建T7Select10-3b-VEGF噬菌体疫苗。将疫苗免疫C57BL/6J小鼠。免疫4周后,用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度。结果:疫苗组血清产生较高水平抗VEGF抗体。结论:异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗可打破机体对自身VEGF的免疫耐受,诱导产生较高水平的特异性抗VEGF抗体。     

重组EGFR噬菌体疫苗抗肿瘤效果的研究

目的构建重组EGFR噬菌体疫苗并且观察其抗肿瘤效果。方法将鸡源EGFR膜外部分的5个基因片段插入到T7噬菌体展示系统中,EGFR蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的外壳蛋白10B上,从而构建成噬菌体疫苗。Western blot方法检测噬菌体壳蛋白上是否有EGFR表达。利用ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗EGFR抗体。分离免疫小鼠脾细胞,检测淋巴细胞对靶细胞A431的细胞毒作用。C57小鼠经过4次免疫,接种Lewis肺癌,记录肿瘤的生长情况,评价疫苗的抗肿瘤效果。结果本实验成功构建5种鸡源EGFR噬菌体疫苗。Western blot。显示噬菌体壳蛋白上有EGFR表达。免疫后的小鼠血清中检测到抗EGFR抗体。体外分离脾细胞证明免疫后的小鼠脾细胞对EGFR受体高表达的A431细胞具有杀伤作用。靶细胞和效应细胞的比例在1:10时,最大杀伤率可达(45．74±7．21)％(P<0．001)。肿瘤生长曲线显示免疫后的C57小鼠Lewis肺癌生长受到明显的抑制。结论利用噬菌体展示技术构建的噬菌体疫苗是一种有效的抗肿瘤方法。     

共表达基因疫苗MAGE-1/IL-18的抗肿瘤免疫治疗作用

目的观察已构建的共表达基因疫苗pcIL-18-MAGE诱导特异性免疫应答的能力和抗肿瘤免疫治疗作用。方法共表达疫苗肌注小鼠,间隔十天加强免疫一次,共免疫三次,以pcMAGE-1、 pcIL-18、pcDNA3和PBS为对照,检测小鼠脾细胞上清液IL-12和IFN-γ的浓度、脾细胞CTL杀伤活性及小鼠T细胞亚群情况;观察基因疫苗免疫MAGE (+)小鼠的成瘤时间和生存时间。结果pcIL-18-MAGE质粒免疫的小鼠,其脾细胞对SMMC-7721的杀伤率最高,与各对照组相比,差异有统计学意义;脾细胞CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T细胞和上清液中细胞因子IL-12和IFN-γ均明显升高。共表达疫苗免疫MAGE (+)小鼠后,小鼠成瘤时间明显延迟,生存时间明显延长。结论共表达基因疫苗pcIL-18-MAGE在实验动物体内有显著的诱导特异性抗肿瘤免疫作用,且对肿瘤的生成有一定的抑制作用。     

ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生抗体的抗肿瘤作用

目的：探讨ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生抗hCGβ抗体的抗肿瘤作用。方法：以TR421ehCGβ质粒实施基因免疫、空载质粒为对照，ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗hCGβIgG抗体；以3HTdR掺入法检测灭活补体前后免疫血清对ehCG+肿瘤细胞增殖活性的抑制作用；倒置显微镜和FACS分别观察Hela细胞的形态变化及细胞凋亡情况。结果：TR421ehCGβ质粒诱导小鼠产生高水平抗hCGβIgG抗体；抗hCGβ免疫血清对Hela细胞的抑制增殖作用明显强于对照血清，灭活补体后抑制率无明显变化；免疫血清的抑制作用与肿瘤细胞的hCGβ表达水平有一定的相关性；Hela细胞与免疫血清孵育后细胞死亡明显增多，但其中凋亡细胞为3.42%，与对照血清孵育细胞的凋亡（1.88%）比较无明显差异。结论：ehCGβ肿瘤基因疫苗诱生的抗hCGβ抗体以不依赖补体方式抑制ehCGβ+肿瘤细胞的增殖。     

重组白介素-12治疗小鼠Lewis肺癌的实验研究

背景与目的:白介素-12(interleukin-12,IL-12)是具有抗瘤活性的细胞因子,本研究建立稳定表达小鼠IL-12(murineinterleukin-12,mIL-12)的小鼠Lewis肺癌(Lewislungcarcinoma,LLC)细胞系LLC/mIL-12,评估mIL-12重组质粒及LLC/mIL-12瘤苗治疗小鼠Lewis肺癌移植瘤的疗效。方法:脂质体转染LLC获得LLC/mIL-12瘤苗。于C57BL/6小鼠皮下接种LLC细胞2×106个,成瘤后将小鼠随机分成4组(n=10),第1、4、7天瘤内注射质粒或瘤苗,第14天处死小鼠,观察肿瘤生长曲线、脾细胞中CTL细胞和NK细胞活性以及肿瘤浸润淋巴细胞。结果:LLC/mIL-12瘤苗组和pcDNA3.1( )-mIL-12质粒组肿瘤体积显著缩小,mIL-12能增强NK细胞和CTL细胞活性,两者均以LLC/mIL-12治疗组更显著,LLC/mIL-12和pcDNA3.1( )-mIL-12治疗组有大量CD4 、CD8 淋巴细胞浸润。结论:mIL-12基因能增强NK细胞和CTL活性,LLC/mIL-12及pcDNA3.1( )-mIL-12均能产生抗瘤免疫反应,且前者作用更强。     

卵巢癌抗独特型微抗体疫苗诱导BALB/c小鼠体内抗肿瘤免疫应答的实验研究

背景与目的：6B11抗独特型微抗体由模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体(6B11ScFv)融合人IgG1铰链区和CH3区所构成,它具有6811ScFv和人1gGFc的双重免疫学活性。本研究观察6811抗独特型微抗体在BALB／c小鼠体内诱导抗肿瘤免疫反应情况,探讨其作为卵巢癌疫苗的可能性。方法：用卵巢癌6B11抗独特型微抗体免疫BALB／c小鼠。采用间接ELISA、竞争抑制实验和流式细胞术检测免疫鼠血清。结果：6B11抗独特型微抗体免疫小鼠后,在不用佐剂的情况下可诱导小鼠产生较高的Ab3,末次免疫后30天仍持续在较高的水平。分别在末次免疫后4天、14天、24天和30天可刺激小鼠脾脏淋巴细胞CD4^ T细胞和CD8^ T细胞明显升高。结论：6811抗独特型微抗体可诱导机体产生特异体液免疫和细胞免疫反应,这为抗独特型微抗体疫苗的临床应用提供了一定的实验依据。     

树突状细胞与肿瘤细胞融合后诱导T细胞介导的抗肿瘤效应

目的：研究树突状细胞（DC）与肿瘤细胞（SP2／0）融合作为肿瘤疫苗免疫小鼠后抑制肿瘤生长的作用及其机理。方法：BALB／C小鼠DC与SP2／0细胞体外融合,形成的杂交瘤分2次免疫接种同基因小鼠皮下,然后用SP2／0细胞攻击免疫的小鼠,观察肿瘤的生长情况及免疫小鼠脾细胞特异性CTL功能。结果：DC－SP2／0杂交瘤接种小鼠能产生明显的抗肿瘤效应,其拮抗SP2／0细胞攻击的能力明显强于用灭活的死SP2／0细胞与DC混合,和单用死SP2／0细胞免疫的小鼠及用生理盐水的对照组小鼠。DC－SP2／0杂交瘤免疫接种小鼠的脾细胞特异性CTL杀伤活性强于其它各组小鼠。结论：DC与肿瘤细胞融合后作为肿瘤疫苗接种可在体内产生明显的抗肿瘤免疫,其机理主要是特异性CTL的作用。     

Anti-Tumor Efficacy of Gene Vaccine Expressing PSMA

OBJECTIVE To observe anti-tumor effects of PVAX-PSMA gene vaccine.METHODS The PSMA gene was inserted into a mammalian expression vector, PVAX-1, to construct the DNA vaccine candidate, and was then used to vaccinate C57BL/6 mice. Animals vaccinated with PVAX-1 and NaCl were used as controls.Anti-PSMA antibody was detected in sera of the animals. The proliferation and cytotoxicity of the spleen cells were observed. The immunized mice were inoculated with RM-1 cells. The mice were inoculated with RM-1 cells, and then the mice were immunized. The anti-tumor efficacy of the gene vaccine was evaluated by the ratio of tumor formation, tumor volume, tumor mass before and after gene vaccination and evaluated by survival rate of the immunized mice.RESULTS High level of anti-PSMA antibody was induced in the PVAX-PSMA group. The splenocytes from PVAX-PSMA group were stimulated to produce strong proliferation responses and significant cytotoxic T-cells (CTL) activity. After the mice were immunized with PVAX-PSMA gene, tumor occurrence was decreased, and the growth velocity of tumor was markedly reduced, resulting in prolonged tumor-free time (P < 0.05).CONCLUSION PVAX-PSMA gene vaccine has significant antitumor effects and provides an experimental basis for primary prevention and immunotherapy of prostate cancer.     

Effects of hMIP-1beta gene modification on in vivo tumorigenicity and vaccine efficacy of tumor cells

OBJECTIVE To explore the effects of human macrophage inflammatory protein-1 beta (hMIP-1beta) modification on the in vivo tumorigenicity and vaccine efficacy of tumor cells. METHODS: Murine colorectal adenocarcinoma CT26 cells were transfected with a recombinant adenovirus carring the hMIP-1beta gene (AdhMIP-1beta). The efficacy of gene transfection was tested by X-gal staining. The hMIP-1beta level in the supernatant of hMIP-1beta gene-modified CT26 cells was assayed by ELISA, and the chemotactic activity for CD4+ T cells, CD8+ T cells, NK cells and immature dendritic cells (imDCs) were assayed by a transwell chamber. The changes of growth characteristics and in vivo tumorigenicity of hMIP-1beta gene-modified CT26 cells were also assessed. BALB/c mice were immunized with hMIP-1beta gene-modified CT26 tumor vaccine and the antitumor effect was evaluated. RESULTS: hMIP-1beta gene could be transfected into CT26 cells by AdhMIP-1beta with an efficiency over 95%. The level of hMIP-1beta in the culture supernatant of hMIP-1beta gene-modified CT26 cells was 980 pg/ml and the supernatant displayed ramarkable chemotactic activity to CD4+ T cells, CD8+ T cells, NK cells and imDCs compared with LacZ gene-modified CT26 cells and control. When the hMIP-1beta gene-modifited CT26 cells were subcutaneously inoculated in BALB/c mice, the tumorigencity was delayed and suppressed, and overt necrosis and lymphocyte infiltration were observed in the tumor tissue, but not in those inoculated with LacZ gene-modified CT26 cells or parental CT26 cells. The mice immunized with hMIP-1beta gene-modified CT26 tumor vaccine could induce tumor specific CTL activity and nonspecific NK activity, and exhibited resistance to later challenge with wild-type CT26 cells. CONCLUSION: hMIP-1beta gene-modified CT26 cells exhibit decreased tumorigenicity, and hMIP-1beta gene-modified tumor vaccine may induce a powerful specific and nonspecific antitumor response. The data suggested that hMIP-1beta gene-modified tumor vaccine may play a potent role in prevention of metastasis and recurrence of malignant tumors.     

Induction of antigen specific cellular immunity by vaccination with peptides from MN/CA IX in renal cell carcinoma

We investigated the induction of the specific immunity for renal cell carcinomas (RCC) using MN/CA IX, a tumor-associated antigen frequently expressed in RCC. We have generated 9-mer peptide derived from MN/CA IX and examined the antigenicity as a vaccine to induce specific immunity for RCC. To use mouse syngeneic system, we transfected human MN/CA9 cDNA into RenCa and BALB-3T3 cells originally from BALB/c mouse, and established MN/CA IX expressing mouse cell lines, i.e., MN-RenCa and MN-3T3. The immunization of BALB/c mouse with MN-RenCa cells resulted in the induction of cytotoxic T lymphocytes (CTL) against MN/CA IX expressing cells and the CTL clone was established from bulked CTL. This CTL clone specifically lyzed MN-3T3 cells, but not parental cells. To identify the targeted epitope binding to H-2Kd antigen, three 9-mer peptides (A, B, C-peptide) of human MN/CA IX compatible with the H-2Kd as well as HLA-A24 binding motif was synthesized. The cloned CTL targeted the B-peptide pulsed BALB-3T3 cells as well as MN-3T3 cells. Furthermore, spleen cells from BALB/c mouse immunized with B-peptide reacted against MN-RenCa cells. These results suggest that the peptides derived from MN/CA IX containing HLA-A24 binding motif may be useful as a potent tumor vaccine for the treatment of human RCC, and in mouse models.     

基因枪介导的neu基因DNA疫苗抗肿瘤作用的实验研究

目的 探讨DNA疫苗pWRG-neu的皮内免疫,对高表达neu基因的小鼠移植瘤生长和转移的抑制作用。方法 向小鼠黑色素瘤B16F10细胞系转染pcDNA-neu,用有限稀释法筛选一株高表达neu基因的细胞株B16F10-neu。在基因枪介导下,向C57BL／6小鼠导入DNA疫苗pWRG-neu,通过观察免疫动物的生存期,评价DNA疫苗的抗肿瘤作用。分离免疫动物脾细胞,经自体淋巴细胞混合培养实验,分析DNA疫苗体内免疫后机体的CTL应答。结果 筛选到一株高表达neu基因的B16F10-neu细胞株,转基因过程和外源基因的表达没有改变细胞系的增殖特性。用基因枪轰击,进行DNA疫苗pWRG-neu皮内免疫,对小鼠黑色素瘤B16F10-neu进行预防、治疗和抗转移的实验研究,结果表明,DNA疫苗的免疫能够明显推迟移植瘤的生长,延长小鼠生存期,获得明显的抗肿瘤效果。DNA疫苗免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞CTL活性。结论 基因枪介导的DNA疫苗pWRG-neu经皮内免疫,能够有效的诱导机体的细胞免疫应答,预防和治疗小鼠移植瘤的发生,并有一定的预防肿瘤肺转移的作用。