人脐血树突状细胞体外扩增的研究

目的 探讨人脐血来源的树突状细胞(dendritic cells，DC)的体外培养、增殖情况。方法 采用密度梯度离心法获得界面细胞，贴壁培养2小时，获得单个核细胞，体外以重组hGM-CSF(50ng/m1) hIL-4(10n g/ml) hTNF-α(50ng／m1)诱导培养2周。在DC发育过程中，在光镜下观察其生长情况，流武细胞仪检测DC表型。结果 体外培养的DC在第四天由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞，随着培养时间的延长。此类细胞数量增多。第八天为形态不规则的毛刺状，为典型树突状细胞形态。流式细胞仪显示体外培养成熟的De高表达共刺激分子CD80、黏附分子CD54、MHC Ⅱ类分子HLA-DR。结论 人脐血经hGM-CSF hIL-4 hTNF-α体外培养，能诱导出DC,本研究为DC的深入研究与临床应用奠定了基础。     

四种细胞因子组合从小鼠骨髓细胞体外诱导优势不成熟CD8a+DC

 【目的】探索从小鼠骨髓细胞体外诱导大量优势不成熟CD8a+DC（DC2）的新方法。方法：取小鼠骨髓细胞，采用GM-CSF 5ng/ml，IL-4 20ng/ml，Flt3L 25ng/ml，SCF 100ng/ml四种细胞因子组合，37℃，5％CO2体外培养诱导。第3、7、16天流式细胞术4色荧光标记法分析细胞表型，细胞计数分析总细胞产量，采用电镜、免疫荧光及相差摄影观察细胞形态。【结果】小鼠骨髓细胞经GM-CSF+ IL-4+Flt3L+SCF 诱导第3天在CD11c+的DC细胞群中可产生97.09％的CD8a+优势DC2细胞（占总细胞的34.6％），其中CD8a+MHCⅡ-的不成熟DC占61.77％；随培养时间延长比例下降，但培养第16天时CD8a+的不成熟DC仍占优势。总细胞计数分析显示随培养时间延长，细胞总数下降。电镜、免疫荧光及相差摄影等形态学检查显示所诱导的DC呈现典型树突状形态特征。【结论】GM-CSF+ IL-4+ Flt3L+SCF可以体外快速诱导小鼠骨髓细胞产生大量优势不成熟CD8a+ DC，是体外制备不成熟DC2的一种较好的新方法。     

狼疮鼠骨髓树突状细胞的分离培养和免疫学特性

目的对狼疮鼠骨髓树突状细胞进行分离、培养并分析其免疫学特性,为进一步研究和应用狼疮鼠骨髓来源树突状细胞(DC)奠定基础。方法分离、纯化6周龄雄性BXSB狼疮鼠骨髓单核细胞,以含10%胎牛血清、2ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/ml重组小鼠白细胞介素-4的RPMI-1640培养基培养,以脂多糖(LPS,1μg/ml)刺激24h体外诱导BXSB狼疮鼠骨髓细胞分化为DC,倒置显微镜动态观察细胞形态学变化,流式细胞仪分析细胞表面分子,混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞增殖能力。结果经体外诱导培养第2～8天可见大量细胞集落形成,培养的DC具有典型树突状形态,同时DC可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可稳定获得BXSB狼疮鼠骨髓来源DC。     

CIK与树突细胞联合对肾癌细胞的杀伤研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突状细胞（Dc）共同培养后CIK细胞的增殖活性、表型变化及对肾癌细胞株769一P的杀伤作用。方法采集健康人的外周血单个核细胞（PBMC）,置37℃、5％C02培养箱2h,收集非粘附细胞诱导分化成CIK,粘附细胞诱导为DC,在培养7d后DC与CIK按1：40的比例混合培养,分别在3d、6d收集细胞同时以单纯CIK细胞为对照,运用LDH释放法检测对769一P细胞的杀伤活性。结果Dc—CIK共同培养后增殖速度明显快于单纯的CIK细胞,培养第10天时单纯CIK的CD3CD8、CD;cD未双阳性率分别为（50．4±1．8）％、（20．1±5．2）％,共培养3dDC—CIK的CD;CD8＋、CD36＋未的阳性率分别为（67．2±5．2）％、（37．9±4．1）％,6dDC-CIK的CD3＋CD8、CD3CD56的阳性率分别为（75．2±3．1）％、（48．3±2．9）％,表达差异具有统计学意义（P〈0．05）。在1：5—1：40靶效比范围内DC—CIK对肾癌细胞的杀伤活性高于单纯CIK细胞,且随效靶比增强杀伤活性增强（P〈0．05）。结论DC—CIK的增殖活性和细胞毒活性均高于单纯CIK细胞。     

利福平对兔脂肪干细胞增殖、成骨及黏附支架的影响

目的探讨利福平（rifampicin,RFP）对兔脂肪干细胞（rabbitadipose-derivedstemcells,rADSCs）增殖、成骨及黏附支架的影响,为后期RFP缓释系统与rADSCs的复合奠定实验基础。方法分离培养rADSCs,检测细胞周期及表面抗原CD44,成骨、成脂诱导后分别行茜素红及油红O染色。用利福平生长液干预rADSCs,按浓度分为0、10、20及30μg／ml4组,分别绘制细胞生长曲线、检测细胞凋亡率及碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）含量。制备同种异体脱钙骨支架,并复合各组rADSCs,计算细胞黏附率,扫描电子显微镜观察复合情况。结果rADSCs呈长梭形生长,G0／G1期占78．3％±4．2％,表面抗原CD44阳性表达。成骨诱导后茜素红染色及成脂诱导后油红O染色均为阳性。生长曲线示30μg／ml组第4-11天增殖能力较其他3组弱（P〈0．01）,细胞凋亡示30μg／ml组凋亡率高于其他3组（P〈0．01）,ALP检测示成骨诱导后第14天30μg／ml组ALP含量较其他3组少（P〈0．01）,细胞黏附率示30μg／ml组较其他3组低（P〈0．01）。扫描电镜观察30μg／ml组黏附的细胞数量少,形态松散。结论不影响rADSCs增殖、成骨及黏附支架的RFP临界浓度约为20μg／ml。     

外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定

目的：以实体瘤患外周造血干细胞（PBSC）为来源，建立体外诱导扩增树突状细胞（DC）的方法，工进行表型鉴定及功能检测。方法：以血细胞分离机分离经动员的外周造血干细胞，加入rhGM-CSF,rhIL-4和nrhTfNF-α培养7－9d成为树突状细胞，进行细胞形态学、表型及刺激T细胞增殖能力分析。结果：PBSC经诱导培养后，倒置显微镜和电镜显示典型的树突状细胞形态和超微结构；流式细胞术分析显示细胞表面抗原高表达，其中CD1a 38.28%,CD11c 66.77%,共刺激分子CD80和CD86分别为51．05％，67．58％，MHCⅡ类分子HLA－DR为72．09％，为典型的DC表型特征，同种混合淋巴细胞反应结果显示DC具有高效的刺激T淋巴细胞活化增殖的能力。结论：实体瘤患PBSC可成功诱导为具有典型形态特征及功能的树突状细胞。     

四种细胞因子组合从小鼠骨髓细胞体外诱导优势不成熟CD8a＋DC

【目的】探索从小鼠骨髓细胞体外诱导大量优势不成熟CD8a＋DC（DC2）的新方法。【方法】取小鼠骨髓细胞，采用GM—CSF5ng／mL，IL-420ng／mL，Fh3L25ng／mL，SCF100ng／mL4种细胞因子组合，37℃，5％CO2体外培养诱导。第3、7、16天流式细胞术4色荧光标记法分析细胞表型，细胞计数分析总细胞产量，采用电镜、免疫荧光及相差摄影观察细胞形态。【结果】小鼠骨髓细胞经GM—CSF＋IL-4＋Flt3L＋SCF诱导第3天在CDllc＋的DC细胞群中可产生97．09％的CD8a＋优势DC2细胞（占总细胞的34．6％），其中CD8a＋MHCⅡ-的不成熟DC占61．77％：随培养时间延长比例下降．但培养第16天时CD8a＋的不成熟DC仍占优势。总细胞计数分析显示随培养时间延长，细胞总数下降。电镜、免疫荧光及相差摄影等形态学检查显示所诱导的DC呈现典型树突状形态特征。【结论】GM—CSF＋IL-4＋Fh3L＋SCF可以体外快速诱导小鼠骨髓细胞产生大量优势不成熟CD8a＋DC．是体外制备不成熟DC2的一种较好的新方法。     

bFGF对体外培养新生牛RPE细胞非特异性吞噬功能的影响

为探讨碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对视网膜色素上皮 (RPE)细胞吞噬功能的影响。方法 :采用新生牛RPE细胞培养 ,并行免疫组化鉴定。对培养的RPE细胞于 0h、2 4h、48h 3个时间点分别给予0ng/ml、1ng/ml、4ng/ml、16ng/ml的bFGF后 ,加入鸡红细胞悬液 ,孵育 1h ,经清洗固定后于光镜下观察、计数 ,以判断RPE细胞吞噬功能。结果 :应用bFGF后 ,RPE细胞吞噬率及吞噬指数均明显增加 ,在一定范围内呈浓度及时间依赖性。结论 :bFGF对牛RPE细胞的非特异性吞噬功能有促进作用。     

人外周血中树突状细胞的诱导及鉴定

目的：从健康人外周血诱导高纯度树突状细胞（dendritic cell,DC)方法：用贴壁法从健康人外周血获取单核细胞，对传统的诱导方法加以改进，经GM－CSF（100ng/ml)和IL－4（500U/ml)持续诱导7天，在此期间不再补充新的细胞因子，新鲜培养基和促成熟因子，以获取高纯度DC，结果：经上述方法处理后，从健康人外周血中诱导出了大量高纯度DC，其能高表达HLA－I，Ⅱ类分子，共刺激分子和粘附分子，显示出成熟DC的特征，这些DC能强烈诱导同种体淋巴细胞的增殖，其内吞能力在第3天达最高，之后明显下降，结论：本研究所建立的从外周血获取大量成熟DC的方法经济，简便，为DC的深入研究和临床应用奠定了基础。     

钙离子载体和Poly(I:C)诱导人外周血来源的树突状细胞成熟的研究

目的:探讨从健康人外周血中体外诱导培养出成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法.方法:用密度梯度离心法分离人外周单个核细胞(PBMC),再用贴壁法获取单核细胞后加入GM-CSF和IL-4,培养5天后分5组:第1组为对照组,仅含有上述细胞因子;第2组,加入多聚次黄嘌呤胞嘧啶核苷酸[Poly(I:C)];第3组,加入钙离子载体(A23187);第4组,加入Poly(I:C)和CI;第5组,加入TNF-α.显微镜下观察培养细胞形态,流式细胞术检测DC表型,体外同种混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC刺激T细胞的增殖活性.结果:第四组细胞具有典型的树突状细胞的特征,且高表达CD83、CD80、CD86和CD40分子,具有更强的刺激T细胞增殖能力.结论:经过组合细胞因子诱导能够培养出PBMC来源的DC,且经CI和Poly(I:C)进一步诱导后获得更成熟和功能更强DC.     

人外周血树突状细胞的体外培养扩增

目的：P在体外从人外周血中培养坟拉树突状细胞。方法：从正常人外周血分离PBMC,经两次孵育粘附,弃去悬浮细胞后加细胞因子（GM-CSF,IL-4）和培养液进行培养,并对培养过程进行观察鉴定。结果：培养1周后即可培养出典型的树突状细胞,经FITC-CD1a单抗标记a表达率为65%,并能刺激同种淋巴细胞增殖反应,结论：利用GM-CSF和IL-4可以从人外周血中扩增出大量DC,可为后续研究做准备。     

健康志愿者与肝癌患者体外诱导DC表型的检测

目的比较健康人和肝癌（HCC）患者外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）细胞表型。方法贴壁法分离健康志愿者和肝癌患者外周血单核细胞;分次加入IL-4与GM—CSF共同诱导培养6天;给予单核细胞调控培养基（MCM）诱导成熟2天。在倒置相差显微镜观察成熟DC形态;流氏细胞术（FCM）检测成熟DC细胞表型。结果肝癌患者外周血单核细胞能够在体外发育为成熟DC,其特征性Marker与健康志愿者DC相比,在细胞表达率上没有明显的差异,但每个细胞的平均表达量上却明显降低。结论肝癌患者PBMC来源的DC细胞可以具有成熟的细胞形态和表型,适用于基于DC的免疫治疗。     

黏蛋白1(MUC1)致敏的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤实验研究

目的 研究以CpG作为免疫佐剂,应用黏蛋白1（MUC1）致敏树突状细胞（DC）制备疫苗在体外诱导的特异性抗肿瘤作用。方法 健康人外周血采用密度梯度离心法,分离外周血单核细胞（PBMC）,应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子体外培养诱导DC,观察细胞形态,并通过流式细胞术检测成熟DC细胞标志物CD80、CD86。再应用CpG作为免疫佐剂,MUC1作为抗原致敏DC制备疫苗,致敏的DC与T细胞混合培养,观察其诱导T淋巴细胞增殖能力。诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）与肿瘤靶细胞以5：1、10：1、20：1的效靶比共孵育,MTT法检测CTL杀伤活性。结果 DC表型检测结果为CD80+细胞占70.4％,CD86⁺细胞占72.0％,呈现成熟DC表型。MUC1致敏的DC疫苗与淋巴细胞混合培养显示,DC疫苗具有刺激T细胞增殖活化的作用,其中DC+CpG+MUC1组明显高于MUC1+DC或CpG+DC组,差异有统计学意义（P<0.01）。DC疫苗诱导产生的特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用较单独T细胞组或DC组明显增强,差异有统计学意义（P<0.01）。并随着效靶比增大,其杀伤作用呈逐渐增强。结论 经CpG和MUC1致敏的DC疫苗在体外可诱导产生特异性抗肿瘤免疫效应。     

Generation of dendritic cells from healthy human peripheral blood]

OBJECTIVE: To get high quality and sufficient numbers of mature dendritic cells (DC) from healthy human peripheral blood. METHODS: Cultured plastic-adherent monocytes were isolated from healthy human peripheral blood by use of granulocyte-monocyte clony-stimulating factor and Interleukin-4 for 7 days without fed with fresh medium and cytokine. RESULTS: A large number of DCs with high purity were generated. These DCs expressed HLA-I, II molecules, Costimulating molecules and adherent molecules highly, showing the characteristics of mature DC. These DCs could stimulate proliferation of allogenic T lymphocytes and had active endocytosis ability which peaked at the third day in culture but decreased afterwards. CONCLUSION: These results provide evidence that CD monocytes isolated from peripheral blood monocytes exhibit dendritic cells characteristics and may facilitate further studies of DC and its clinical application.     

肺结核患者外周血树突状细胞和T辅助细胞水平的变化及其临床意义

目的探讨肺结核患者外周血树突状细胞（DC）与T辅助（Th）细胞水平的变化及其临床意义。方法利用流式细胞仪对73例初治肺结核患者、30名健康人外周血DCs亚群（DC1和DC2）与Th细胞亚群（Th1和Th2）按疾病分组进行检测。结果浸润性肺结核、结核性胸膜炎、粟粒型肺结核患者外周血中DC1、Th1含量均明显低于健康对照组,Th2含量均明显高于健康对照组（P〈0.05或〈0.01）。DC2含量在这3个病程中有下降趋势,前两者无显著差异（P〉0.05）,而粟粒型肺结核明显低于健康对照组（P〈0.05）。粟粒型肺结核与浸润性肺结核患者外周血中Th1、Th2含量有明显差异（P〈0.05）。糖尿病并发肺结核患者Th1含量明显低于肺结核组（P〈0.05）,Th2含量明显高于肺结核组（P〈0.05）。15例重度肺结核患者经抗结核化疗与微卡治疗3个月后,DC1、DC2、Th1水平较治疗前明显升高（P〈0.05）,而Th2水平较治疗前明显降低（P〈0.01）。结论浸润性肺结核、结核性胸膜炎、粟粒型肺结核患者存在着不同程度的免疫功能抑制,DC1、DC2表达水平调控着Th0向Th1、Th2分化,Th1、Th2的分化也间接地负反馈调节DC1、DC2表达,维持这种平衡对疾病的转归有重要意义。     

角蛋白19致敏的DC/CTL对MCF-7体外抑瘤作用的实验研究

目的 探讨体外经角蛋白19(K19)致敏的树突状细胞(DC)诱导的细胞毒T细胞(CTL)对MCF-7细胞株的抑瘤作用。方法 经抗原多肽K19体外致敏外周血来源的DC诱导特异性CTL,流式细胞仪检测DC表面标志及细胞因子分泌,³H-TdR掺入法检测DC诱导CTL增殖,⁵¹Cr释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性。结果 外周血单个核细胞经体外扩增培养出可见树突状形状的DC,流式细胞仪检测细胞表面CD83、CD40、CD80及CD86高表达,混合淋巴细胞反应观察经K19致敏的DC刺激的自体淋巴细胞增殖明显较对照组高(P<0.01)。在同一效靶比时,K19致敏的DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤率与对照组比较差异有显著性(P<0.01),且随着效靶比增加,杀伤作用增强(P<0.01)。结论 DC在体外经K19抗原致敏后,可诱导产生对MCF-7细胞有特异性杀伤作用的效应细胞杀伤MCF-7细胞,且随效靶比增加,杀伤力增强。     

角蛋白19致敏的DC/CTL对MCF-7体外抑瘤作用的实验研究

目的探讨体外经角蛋白19（K19）致敏的树突状细胞（DC）诱导的细胞毒T细胞（CTL）对MCF-7细胞株的抑瘤作用.方法经抗原多肽K19体外致敏外周血来源的DC诱导特异性CTL,流式细胞仪检测DC表面标志及细胞因子分泌,3H-TdR掺入法检测DC诱导CTL增殖,51Cr释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性.结果外周血单个核细胞经体外扩增培养出可见树突状形状的DC,流式细胞仪检测细胞表面CD83、CD40、CD80及CD86高表达,混合淋巴细胞反应观察经K19致敏的DC刺激的自体淋巴细胞增殖明显较对照组高（P＜0.01）.在同一效靶比时,K19致敏的DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤率与对照组比较差异有显著性（P＜0.01）,且随着效靶比增加,杀伤作用增强（P＜0.01）.结论DC在体外经K19抗原致敏后,可诱导产生对MCF-7细胞有特异性杀伤作用的效应细胞杀伤MCF-7细胞,且随效靶比增加,杀伤力增强.     

鼻咽癌可溶性抗原负载DC诱导CTL杀伤鼻咽癌细胞的体外研究

目的：用负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的树突状细胞(dendritic cells，DC)诱导自身淋巴细胞，使之活化为鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)特异性细胞毒性T细胞(cvtotoxic T lymphocyte，CTL)，观察其对鼻咽癌细胞的体外特异性杀伤作用。方法：用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导健康成人外周血单核细胞，使其分化为高纯度DC。用鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原负载成熟DC，流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征，MLR检测负载前后DC对同种异体T淋巴细胞增殖的能力。在白细胞介素-2(IL-2)的作用下，用负载鼻咽癌细胞可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞成NPC特异性CTL，通过杀伤活性实验观察它对鼻咽癌细胞(CNE)的特异性杀伤效应。结果：人外周血单核细胞体外在GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导下获得具典型表型特征的成熟DC。负载CNE可溶性抗原对成熟DC表面共刺激分子及特异性表面标志无影响，仍有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力，所诱导的CTL对鼻咽癌细胞(CNE)有明显的特异性杀伤作用。结论：负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用，对NPC的临床治疗有潜在的应用价值。     

单用A23187诱导外周血单个核细胞成树突状细胞及其介导耐药肿瘤细胞杀伤的实验研究

目的探索一种快速、高效的由外周血单个核细胞（PBMC）获取树突细胞（DC）的方法,并探索该种来源Dc对耐药肿瘤细胞的杀伤作用。方法通过单用A23187或联合细胞因子（QM—CSF、IL-4及TNF-a）将PBMO诱导分化为DC,观察细胞形态;流式细胞术检测诱导之DC表面分子表达;MTT法检测DC刺激异基因淋巴细胞增殖及其介导靶细胞的杀伤能力。结果上述两种细胞因子组合均能诱导PBMC向成熟DC分化,均高表达CD1a、-CD80、HLADR、CD83和0D86;A23187组诱导72h获得DC数量高于细胞因子组的诱导率,也高于细胞因子组诱导7d的诱导率（P值均〈005）;两组所获DC在对异基因淋巴细胞增殖及介导T细胞对耐药肿瘤细胞的苯伤无显著差异（P值均〉0.05）。结论单用A23187可快速（72h以内）诱导PBMC向成熟DC转化,且能介导杀伤耐药肿瘤细胞;与联合细胞因子相比,该方法是一种快速而高效的获取DCs的方法。     

凉血活血汤调节寻常型银屑病外周血树突状细胞相关免疫功能的试验研究

目的探讨凉血活血汤在体外对进行期寻常型银屑病患者外周血树突状细胞(DC)的干预作用。方法采用体外培养患者DC,经复方中药作用后,流式细胞仪分析检测细胞表型的变化,MTT法观察DC诱导淋巴细胞增殖的变化,ELISA法观察DC分泌细胞因子的改变。结果患者的DC经凉血活血汤作用后,CD83的表达均明显上调,CD86的表达及刺激混合淋巴细胞增殖的能力均有一定的抑制;使Th1型细胞因子产生显著性降低,而Th2型细胞因子产生增加。结论凉血活血汤对寻常型银屑病患者的DC的抗原递呈能力起到一定的调节作用,对Th1型细胞因子的分泌起强烈抑制作用,对Th2型细胞因子的分泌起促进作用。