一种快速聚合酶链式反应方法的探究和法医学应用

目的 优化和建立一套快速聚合酶链式反应(PCR)扩增体系和程序,缩短扩增时间,提高短串联重复序列分型的速率和办案效率.方法 运用AmpFLSTR(R) Identifiler(R) Plus试剂盒和7种快速扩增酶进行筛选和优化,最后对筛选出的酶优化其扩增体系和扩增程序,并对几种常规检材中提取的DNA进行扩增和检测,然后对其分型结果进行验证和讨论.结果 最终优化的扩增程序由常规的3h左右缩短至24 min,DNA检验结果与常规方法一致.结论 应用优化后的快速PCR扩增体系可以成功准确扩增DNA样本,显著提高DNA分型速率.     

正交设计优化半夏相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系

目的 采用正交设计优化半夏SRAP - PCR的反应体系.方法 以半夏基因组DNA为模板,应用L16 (45)正交表,研究了Taq酶、Mg2+、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种SRAP反应组分浓度变化对扩增结果的影响.结果 优化反应体系为:25μL反应体系中含有buffer2.5μL、Taq酶1.0U、Mg2+2...     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

正交设计优化HBV基因分型PCR反应体系的研究

目的:探索HBV基因分型PCR反应体系的优化方法。方法:利用正交设计,从Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物、Mg~(2+)5种因素,对HBV基因分型PCR反应体系进行优化分析。结果:各因素的不同组合对PCR结果有显著影响,本实验仅用16次试验就得到了可很好进行PCR扩增的几种不同的条件组合。结论:正交设计是一种切实可行、快速、经济的PCR反应体系优化方法。     

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2＋浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2＋浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

复合聚合酶链反应检测绿脓杆菌、肺炎支原体及白色念珠菌的效果评价

目的：探讨复合聚合酶链反应（PCR）方法检测绿脓杆菌（PA ）、白色念珠菌（CA）和肺炎支原体（MP）DNA的效果。方法：选择PA外膜蛋白基因(OprI)、MP 45 000蛋白基因、CA 5SrRNA区特异的非转录区设计合成3对引物,探索用复合PCR方法检测3种病原体的反应体系和反应条件;针对设计合成的每1对引物,对3种支原体、4种细菌及2种真菌的DNA 进行PCR检测,观察引物的特异性;分别用PA、MP和CA标准菌株提取的DNA为模板,检测该反应对每一种病原体DNA的敏感性。结果：通过上述3对引物及一定的反应体系和反应条件所建立的复合PCR体系可以同时检测PA、CA及MP的DNA,分别出现275、684和144 bp的特异性扩增带,表明3对引物均具有较高的特异性,检测灵敏度PA可达1pg DNA,CA可达10pg DNA,MP可达100 fg DNA。结论：通过复合PCR方法可以同时检测出PA-DNA、CA-DNA和MP-DNA,具有快速、特异、敏感、简便及经济等优点。     

谷胱甘肽S转移酶M1基因缺失与喉癌易患性的相关性研究

目的 :建立聚合酶链反应 (PCR)方法检测谷胱甘肽 S转移酶 (GST) M1基因 ,并探讨 GST M1基因缺失 (无效基因型 )与喉癌易患性的相关性。方法 :观察组选择确诊的喉癌 4 2例 ,正常对照组 10 8例 ;取被检者外周静脉血白细胞 ,抽提制备脱氧核糖核苷酸 (DNA) ;选择优化后的 PCR反应体系和循环参数扩增 GSTM1,扩增后的基因产物用 2 %琼脂糖凝胶电泳 ,紫外线灯下观察并记录结果。结果 :(1)成功建立聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳技术检测 GSTM1基因的方法。(2 )喉癌组 GST M1基因缺失率 (71.4 % )明显高于正常对照组 (48.1% )显示两组之间差异存在显著性 (χ2 =6 .6 1,P<0 .0 5 )。结论 :(1)聚合酶链反应是一种简单敏感 ,准确可靠的分析 GST M1基因多态性的方法。 (2 )该地区 GST M1基因缺失与喉癌的易患性相关联     

近交系剑尾鱼的STR遗传检测技术

目的 建立近交系实验用鱼DNA检测方法,用于遗传质量控制.方法 以RR-B、RW-H、BY-F三个近交系剑尾鱼的基因组DNA为主要研究对象,并以非选育剑尾鱼作对照,采用STR (short tandem repeat) 引物扩增方法检测不同品系在DNA上的异同.设计10对STR引物,优化PCR电泳条件,使用相同的实验条件进行重复,以得到可靠的扩增条带,筛选出特异性引物.结果 有4对引物可扩增出稳定条带,1对引物(AY204223)的PCR扩增条带在非选育群中表现多态性,在RR-B与BY-F系表型一致,与RW-H表型不同.这些STR位点能够区分剑尾鱼三个近交系品系.结论 STR检测技术可望用于近交系剑尾鱼的遗传质量监测.     

金银花nrDNA ITS区聚合酶链反应条件的研究

目的:金银花nrDNA ITS区序列G C含量为68%,用常规的PCR方法扩增效果差.本研究通过改变扩增程序及使用改性剂的方法显著提高了金银花nrDNA ITS区的扩增效率.方法:分别从金银花叶及药材中提取总DNA,通过优化扩增条件,对nrDNA ITS区进行扩增,并比较了两种优化方法的差别及适应性.方法1:提高变性温度至97℃;方法2:添加混合改性剂(DMSO 4%-甘油10%).结果:与方法1相比,方法2可降低变性温度5 ℃,升高退火温度9 ℃,降低镁离子浓度至0.5 mmol/L,降低Taq DNA聚合酶用量至0.1 U(30 μl体系),PCR产物量显著提高,且可消除植物DNA粗提物中杂质的干扰.结论:通过提高退火温度及添加改性剂可克服高G C含量金银花nrDNA ITS区序列扩增的困难,该方法的建立有助于解决植物来源DNA模板的PCR扩增问题.     

中金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究药大质量观及实践

目的 建立金钗石斛Dendrobium nobile相关序列扩增多态性 (SRAP) 反应体系,为金钗石斛分子生物学研究提供技术支持。方法 运用 L25(56) 正交设计对影响金钗石斛 SRAP 反应的5个因素：模板 DNA、Mg2+、dNTPs、Taq 酶、引物在5个水平上进行优化试验,对 PCR 结果进行极差分析。结果 金钗石斛 SRAP 反应最佳体系为：25 μL PCR 体系中含有 20 ng 模板 DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs, 1 U Taq 酶,0.6 μmol/L 引物。各因素对 SRAP 反应的影响依次为：〖WTBX〗Taq 酶＞Mg2+＞dNTPs＞模板 DNA＞引物。结论 所建立的金钗石斛 SRAP 反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点,可用于金钗石斛分子生物学的研究。