三氧化二砷对人脑SHG-44胶质瘤细胞作用的体外实验研究

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对人脑SHG-44胶质瘤细胞株的增殖抑制及诱导凋亡机制.方法 将不同浓度的As2O3与体外培养的SHG-44胶质瘤细胞相互作用后,采用MTT比色法检测As2O3对胶质瘤细胞的增殖抑制;倒置显微镜、荧光显微镜下观察吉姆萨及Hochest33258染色后细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测细胞凋亡及对SHG-44胶质瘤细胞周期影响.结果 MTT比色法检测到As2O3对SHG-44胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性和时间依赖性;倒置显微镜及荧光显微镜下可观察到给药组细胞生长密度低以及出现细胞凋亡的特征性改变;流式细胞仪检测到给药组细胞凋亡比率明显高于空白对照组(P＜0.05),并具有剂量依赖性及时间依赖性,同时将胶质瘤细胞阻滞在S期,抑制了细胞周期的进程.结论 As2O3对SHG-44胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用、可诱导SHG-44胶质瘤细胞的凋亡,并抑制细胞周期进程.     

脂质体介导CD基因转染SHG-44胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD重组表达质粒转染SHG-44胶质瘤细胞，体外观察5-氟胞嘧啶（5-FC）对转染CD基因的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；脂质体Lipofectamine 2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选培养获取抗性细胞克隆（即SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学检测SHG-44／CD细胞的CD基因蛋白水平表达；流式细胞仪、TUNEL实验及透射电子显微镜观察5-FC对表达CD基因的SHG-44／CD细胞凋亡的诱导作用。结果含CD基因的pCMVCD质粒成功转染进入SHG-44细胞，获取了含CD基因的SHG-44／CD细胞，免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。在含5-FC的培养液中培养，SHG-44／CD细胞出现典型的凋亡形态，TUNEL显示凋亡细胞比例极高；透射电镜可见凋亡改变；流式细胞术检测凋亡率达18．6％，凋亡率呈剂量依赖性。结论建立了SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞的CD／5-FC自杀基因系统。诱导SHG-44／CD胶质瘤细胞产生凋亡可能是脑胶质瘤CD基因疗法的重要机制。     

五味子甲素通过ATP结合盒转运子B1逆转胶质瘤干/祖细胞耐药性研究

目的探讨五味子甲素对胶质瘤干/祖细胞耐药性的影响及作用机制。方法自人胶质瘤细胞系SHG-44中分离培养胶质瘤干/祖细胞SHG-44s,予五味子甲素0、12.50、25.00和50.00μmol/L联合长春新碱400、800和1200 nmol/L,细胞活性检测试剂盒CCK-8细胞毒性实验检测SHG-44s细胞增殖活性,罗丹明123染色检测SHG-44s细胞泵出药物能力,实时聚合酶链反应(PCR)和Western blotting法检测SHG-44s细胞ATP结合盒转运子B1(ABCB1)基因转录和翻译能力。结果五味子甲素50μmol/L即可抑制SHG-44s细胞增殖活性(P=0.001,0.001,0.039),剔除这一浓度后无论长春新碱浓度为400、800或1200 nmol/L,联合应用五味子甲素均可抑制SHG-44s细胞增殖活性(长春新碱400 nmol/L组:P=0.007,0.001;长春新碱800 nmol/L组:P=0.001,0.000;长春新碱1200 nmol/L组:P=0.000,0.000)。倒置荧光显微镜观察,五味子甲素12.50μmol/L组和25.00μmol/L组SHG-44s细胞可见明显绿色荧光。流式细胞术显示,随着五味子甲素浓度的增加,SHG-44s细胞罗丹明123染色阳性细胞比例分别为10.40%、39.20%和45.20%。实时PCR法显示,五味子甲素12.50μmol/L组和25.00μmol/L组SHG-44s细胞ABCB1基因表达水平较0μmol/L组降低(P=0.027,0.006),尤以25.00μmol/L组显著(P=0.034)。Western blotting法显示,随着五味子甲素浓度的增加,SHG-44s细胞P-糖蛋白表达水平下降。结论五味子甲素通过抑制胶质瘤干/祖细胞表面已存在的ABCB1基因编码的P-糖蛋白泵出药物能力并降低ABCB1基因转录和翻译能力,逆转胶质瘤干/祖细胞耐药性。     

TNF-α基因与依托泊甙联合诱导胶质瘤凋亡的实验研究

目的在体外水平(invitro)建立对胶质瘤杀伤作用的TNF-α基因/VP16系统,研究该系统诱导胶质瘤凋亡的作用。方法用逆转录病毒载体将TNF-α基因转染人胶质瘤细胞株SHG-44,经生长抑制试验,比较转TNF-α基因前后SHG-44细胞对依托泊甙(Etioposide,VP16)的敏感性,并通过形态学及流式细胞仪检测VP16诱导转基因细胞凋亡的情况。结果生长抑制试验表明,转染TNF-α基因后的SHG-44细胞对VP16的敏感性是转基因前细胞的10倍(P＜0.01),IC50为0.8μg/mL。流式细胞检测表明,VP16对转TNF-α基因细胞有较强的诱导凋亡的能力。结论VP16对转TNF-α基因SHG-44细胞诱导凋亡的能力大大增加,表明TNF-α基因/VP16系统对胶质瘤的基因治疗有效。     

全反式维甲酸抑制MDM2基因在胶质瘤细胞SHG-44中的表达

目的 探讨全反式维甲酸对胶质瘤细胞SHG-44中MDM2基因表达的影响,为进一步研究脑胶质瘤的进展机制及基因治疗提供依据.方法 分别利用cDNA微阵列与Western blot技术分析在10μmol/L全反式维甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)处理前后的胶质瘤SHG-44细胞MDM2基因和蛋白的差异表达应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(Streptavidin-Peroxidase,SP)法检测Ⅱ级与Ⅳ级胶质瘤标本MDM2蛋白的表达.随机选择数个差异基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列的结果.结果 应用cDNA微阵列检测发现,MDM2基因在ATRA处理与未处理的SHG-44细胞之间表达量的比值为0.37,提示ATRA可抑制MDM2基因在SHG-44中的表达.该结果进一步得Northern杂交实验结果的支持.Western blot分析结果显示10μmol/L ATRA处理前后胶质瘤SHG-44细胞之间MDM2蛋白的相对表达量分别为21.40±0.58和14.02±0.35(t=24.728,P=0.000),提示MDM2蛋白在SHG-44中的表达受到ATRA抑制.Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤标本MDM2蛋白的阳性表达率分别为24.00%(6/25)和56.52%(13/23)(X2=5.298,P=0.021),MDM2蛋白的表达随胶质瘤恶性程度的增高而增加.结论 ATRA可抑制SHG-44胶质瘤细胞中MDM2基因的表达,MDM2基因的表达水平与胶质瘤的演进有关.     

胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染SHG-44胶质瘤细胞的实验表达研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的重组表达质粒（recombinant plasmid vector）pCMVCD转染SHG-44胶质瘤细胞，建立胶质瘤嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-FC）自杀基因治疗系统。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；改良Eagle培养基（DMEM）培养SHG-44胶质瘤细胞；脂质体lipofectamine2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选重组子；免疫细胞化学检测表达情况。结果测序证实pCMVCD质粒含有CD基因；脂质体成功介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，获取了抗性细胞克隆（定名SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。结论脂质体介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞的方法简单、高效；成功建立了胶质瘤CD／5-FC自杀基因治疗系统，为后续实验研究打下了基础。     

125I对体外培养的胶质瘤细胞C-myc、p53基因表达及细胞增殖的影响

目的探讨125I对体外培养的胶质瘤细胞SHG-44C-myc、p53基因表达及细胞增殖的影响。方法利用免疫组化技术检测经125粒子放射处理3d后,SHG-44细胞的C-myc蛋白表达与p53蛋白表达水平。结果经1粒、3粒125粒子放射处理3d后,SHG-44细胞C-myc蛋白表达明显减弱,而p53蛋白表达显著增强。二者呈负相关。结论125I可以通过影响C-myc基因与p53基因的表达抑制人脑恶性胶质瘤细胞株SHG-44增殖,从而抑制胶质瘤的生长。     

TNF-a/VP16系统对胶质瘤基因治疗的实验研究

目的在体外水平(in vitro)建立对胶质瘤有杀伤作用的TNF-α基因/Vp16系统,研究该系统的有效性及可行性.方法用逆转录病毒载体将TNF-α基因转染人胶质瘤细胞株SHG-44,经生长抑制试验,比较转TNF-α基因前后SHG-44细胞对Vp16的敏感性.结果生长抑制试验表明,转染TNF-α基因后的SHG-44细胞对Vp16的敏感性是转基因前细胞的10倍(P ＜0.01),IC50为0.8μg/ml;TNF-α基因/Vp16系统对胶质瘤的杀伤作用优于TNF-α细胞因子与Vp16的联合应用(P ＜0.05),并具有良好的旁观者效应.结论在in vitro水平,转TNF-α基因SHG-44细胞对Vp16的敏感性大大增加,小剂量Vp16即可达到杀伤肿瘤细胞的作用,表明TNF-α基因/Vp16系统可成为细胞因子基因联合化学药物治疗胶质瘤的有效方法.     

NAC调控HIF-1α抑制胶质瘤细胞生长的作用研究

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)通过抑制低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达,进而抑制SHG-44胶质瘤细胞生长的作用研究。方法对照组为常规培养的SHG-44胶质瘤细胞,NAC组为常规培养基础上加入N-乙酰半胱氨酸,两组培养48 h后实时荧光定量逆转录酶聚合酶联反应(RTPCR)检测HIF-1αmRNA的表达,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测SHG-44胶质瘤细胞增殖情况,流式细胞仪检测SHG-44胶质瘤细胞凋亡情况。结果 NAC组HIF-1αmRNA的表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。MTT检测SHG-44胶质瘤细胞增殖情况,NAC组明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。NAC组早期凋亡率、晚期凋亡及坏死率均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 N-乙酰半胱氨酸具有下调低氧诱导因子-1α表达,进而抑制SHG-44胶质瘤细胞生长,加速凋亡的作用。     

九节龙皂苷诱导胶质瘤SHG-44细胞凋亡及其机制研究

目的研究九节龙皂苷对胶质瘤SHG-44细胞潜在的治疗作用及其机制。方法用四甲基偶氨唑蓝（MTT）法检测不同剂量九节龙皂苷于不同时间（6、12、24、72h）对人胶质瘤SHG-d4细胞活性的影响和细胞流式术检测SGH-44细胞调亡情况;Western—blot检测caspase-3和Bcl-2在SHG-44细胞中的表达情况。结果流式细胞仪检测显示,随着九节龙皂苷浓度的增大和时间延长,SHG-44细胞的凋亡率明显上升,Western—blot结果提示九节龙皂苷下调了凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达并激活了凋亡蛋白caspase-3,九节龙皂苷明显抑制SHG-44细胞的生长与增殖。结论九节龙皂苷引起胶质瘤细胞大量凋亡,具有显著的抗肿瘤作用,通过调控caspase-3和Bcl-2诱导胶质瘤SHG-44细胞凋亡。     

Growth and radiosensitivity of irradiated human glioma cell progeny

BACKGROUND： Progenitors of the immortalized human glioma cell line, SHG-44, are significantly less sensitive to irradiation. Two hypotheses regarding the mechanism of this effect exist： several studies have suggested that there is a subgroup with different radiosensitivities in identical cell group, and the progenitors of irradiate is a adaptive response subgroup, so its radiosensitivity is descend. A second hypothesis suggests that irradiated glioma progeny have a stronger ability to repair DNA damage. This would suggest that when progeny are continuously irradiated, resistance to irradiation-induced DNA increases, and radiosensitivity decreases. OBJECTIVE： To investigate radiosensitivity and growth features after irradiation to progeny of the human glioma cell line SHG-44. DESIGN, TIME AND SETTING： A randomized, controlled experiment, which was performed at the Department of Radiology Laboratory, the First Hospital Affiliated to Soochow University, between September 2004 and January 2006. MATERIALS： The glioma cell line SHG-44 was provided by the Institute of Neuroscience, First Affiliated Hospital of Suzhou University. Propidium iodide reagent was provided by Coulter Corporation. A linear accelerator, KD-2 type, was provided by Siemens, Germany. The flow cytometer EPICS-XL was provided by Coulter Corporation. METHODS： Brain glioma SHG-44 cells were divided into four groups： SHG-44, SHG-44-2, SHG-44-6, and SHG-44-10 . The SHG-44-2, SHG-44-6, and SHG-44-10 cells were vertically irradiated with varying doses of 2, 6 and 10 Gy by a linear accelerator （6 MVX）. The cells were passaged for 15 generations and cultured in RPMI-1640 culture media. MAIN OUTCOME MEASURES： Community re-double time, mean lethal dose （D0）, extrapolation number （N）, fraction surviving fraction irradiated by 2 Gy dose （SF2）, quasi-threshold dose （Dq）, and cell cycle. RESULTS： The Population doubling time （PDT） of SHG-44-2, SHG-44-6, and SHG-44-10 cell groups was not significant （P = 0.052）. Compare     

~(125)I诱导大鼠脑内胶质瘤凋亡实验研究

目的研究125I诱导人脑胶质瘤细胞系SHG-44体内外凋亡的可能性及其机制。方法体外培养SHG-44细胞,采用流式细胞仪法检测125I诱导SHG-44细胞凋亡及对细胞周期影响,采用立体定向的方法建立大鼠脑内人胶质瘤模型,1周后经MRI检测后,于肿瘤区接种125I,2周后复查MRI检测肿瘤大小,3周后处死大鼠,取对照组及肿瘤周边组织及肿瘤组织行Bcl-2、p53免疫组织化学染色。结果SHG-44细胞接种1周,MRI示脑内形成实体瘤;125I可抑制肿瘤生长,诱导细胞凋亡,延长荷瘤鼠生长周期,抑制Bcl-2基因表达,促进p53蛋白表达。结论125I具有体内、外抑制SHG-44细胞增殖,诱导凋亡的作用;其诱导凋亡机制可能与抑制Bcl-2蛋白表达,促进p53蛋白表达有关。     

替莫唑胺缓释剂胶质瘤间质内化疗的实验研究

目的观察肿瘤间质内应用替莫唑胺缓释剂(P-TMZ)对人脑胶质瘤的抑瘤效应。方法先以MTT法测定P-TMZ对SHG-44胶质瘤细胞的抑瘤效应,加药96h后检测不同药物浓度在570nm处的OD值,计算其IC50;再将SHG-44细胞接种于NC系裸小鼠右腋皮下,待肿瘤生长至体积约100mm3时,将荷瘤鼠随机分为P-TMZ组、替莫唑胺(temozolomide,TMZ)组、卡莫斯汀(BCNU)组和不载药微球(P-0)组,然后将P-TMZ(500mg/kg)、TMZ(50mg/kg)、BCNU(40mg/kg)和P-0(500mg/kg)以DMEM培养液混悬至终体积150μl,经皮多点穿刺缓慢注入相应组肿瘤间质内,每周测量皮下肿瘤大小2次。结果P-TMZ、TMZ和BCNU对SHG-44胶质瘤细胞的体外抑瘤效果明显,三者的IC50均<10μg/ml;与P-0组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01)。在体内抑瘤实验中,P-TMZ、BCNU、TMZ抑瘤率均明显高于P-0(P<0.01)。P-TMZ和BCNU的抑瘤效应优于TMZ组(P<0.05)。结论P-TMZ保留了TMZ的抑瘤活性,兼具高稳定性和长时程药物作用时间等药代...     

^125I诱导大鼠脑内胶质瘤凋亡实验研究

目的 研究^125I诱导人脑胶质瘤细胞系SHG-44体内外凋亡的可能性及其机制。方法 体外培养SHG-44细胞，采用流式细胞仪法检测^125I诱导SHG-44细胞凋亡及对细胞周期影响，采用立体定向的方法建立大鼠脑内人胶质瘤模型．1周后经MRI检测后．于肿瘤区接种^125I，2周后复查MRI检测肿瘤大小，3周后处死大鼠，取对照组及肿瘤周边组织及肿瘤组织行Bcl-2、p53免疫组织化学染色。结果 SHG-44细胞接种1周，MRI示脑内形成实体瘤；^125I可抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡。延长荷瘤鼠生长周期。抑制Bcl-2基因表达，促进p53蛋白表达。结论^125I具有体内、外抑制SHG-44细胞增殖，诱导凋亡的作用：其诱导凋亡机制可能与抑制Bcl-2蛋白表达，促进p53蛋白表达有关。     

胶质瘤细胞系A172、U251、U87和SHG-44中HER2的表达及意义

目的 探讨人表皮生长因子受体2(HER2)在人神经胶质瘤细胞系A172、U251、U87和SHG-44中的表达情况.方法 采用Western blot 和流式细胞术(FCM)于蛋白质水平检测HER2在四种人胶质瘤细胞系中的表达.结果 Western blot检测出HER2在人胶质瘤细胞系A172中的表达量最高,U251次之,U87和SHG-44表达量较低.FCM检测结果显示HER2在A172、U251、U87和SHG-44中的阳性率分别为36.5%、21.5%、3.3%和3.5%.结论 人胶质瘤细胞系A172和U251中HER2的表达量较高,这两种细胞系可作为良好的细胞模型来研究HER2分子在胶质瘤中的作用机制以及以HER2为靶点的生物治疗等.     

过表达TBX2对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨TBX2表达对胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响。方法 采用RT-qPCR和免疫印迹法检测53例胶质瘤组织和瘤旁组织TBX2mRNA和蛋白表达水平。体外培养胶质瘤细胞（U251、U87和SHG-44）和正常星型胶质细胞（HA1800）,采用RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平。构建TBX2过表达或低表达U251细胞株,分别采用WST-1法检测胶质瘤细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 胶质瘤组织TBX2 mRNA和蛋白表达水平明显高于瘤旁组织（P<0.05）,而且,高级别胶质瘤TBX2表达水平显著高于低级别胶质瘤（P<0.05）。相比于人正常星型胶质细胞系HA1800,胶质瘤细胞系U251、U87、SHG-44细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）;而且,U251细胞TBX2表达水平显著高于U87和SHG-44细胞（P<0.05）,因此使用U251细胞进行后续实验。过表达TBX2显著增加U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）,低表达TBX2显著抑制U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）。结论 胶质瘤TBX2呈高表达,与胶质瘤增殖、侵袭能力有关。