BRCA1及BRCA1△11b在P19细胞及人胚胎干细胞分化过程中的选择性剪接

目的:检测BRCA1及其剪接异构体BRCA1△11b在P19及人胚胎干细胞分化过程中的表达.方法:全反式维甲酸诱导P19细胞的分化,提取不同时间点RNA,运用RT-PCR,Real-time PCR分别检测P19细胞及人胚胎干细胞分化过程中BRCA1及其剪接异构体BRCA1△11b的表达.结果:未分化P19细胞在全反式维甲酸诱导下聚集形成拟胚体.在P19细胞拟胚体形成过程中,BRCA1△11b表达水平迅速降低,而BRCA1的表达则随P19细胞分化发生相反的变化,BRCA1表达水平迅速升高.在人胚胎细胞分化过程中,BRCA1基因同样发生选择性剪接的转换,由未分化时BRCA1△11b为主要剪接产物转换为拟胚体形成时BRCA1表达占优势.结论:BRCA1及其选择性剪接异构体BRCA1△11b在P19细胞及人胚胎干细胞分化过程中均发生选择性剪接的转换,BRCA1基因的选择性剪接可能在胚胎干细胞的分化过程中发挥重要作用.     

活细胞RNA成像技术及其在生物医学中应用研究进展

RNA可与各种核酸及蛋白质相互作用,在多种生理和病理过程中发挥重要的调控作用,其生物学过程高度动态。追踪活细胞中的RNA动态对理解基因表达的时空调控以及RNA的调控功能至关重要。基于荧光蛋白的RNA标记系统包括MS2/MCP系统、PP7/PCP系统、boxB/λN22和CRISPR-Cas系统等,其中MS2/MCP系统目前应用最为广泛,其具有结合稳定、信噪比高等优点,局限性是RNA成像的实现需要对靶RNA进行基因编辑,这可能导致靶RNA特性的潜在改变。近期开发的CRISPR-dCas13系统不需要对RNA进行改造,但其局限性在于CRISPR RNA效率的不确定性,且信噪比较低。基于荧光染料的RNA标记系统包括分子信标和荧光基团-适体对,其中分子信标具有高特异性和较高信噪比,而荧光基团–适体对Pepper系统和Mango系统在RNA成像的信噪比上更具有优势,但也需要对靶RNA进行基因编辑。活细胞RNA成像技术可应用于观察并研究RNA转录、剪接、转运、翻译（特指信使RNA）和亚细胞定位,有助于研究细胞分化等生物学过程以及细胞适应外界环境时的转录调控机制,有利于理解RNA行为异常导致的各种疾...     

胃癌中异常表达剪接因子的生物信息学分析及功能

目的采用生物信息学方法分析胃癌中有表达差异的剪接因子,研究异常表达的富含丝氨酸苏氨酸蛋白家族中的剪接因子10(SRSF10)对胃癌细胞表型的影响。方法通过癌症基因组图谱数据库(TCGA)下载胃癌以及癌旁组织的RNA-seq数据,对其采用生物信息学方法进行分析,最终得到胃癌中差异表达的剪接因子。从中挑选出SRSF10研究其对胃癌发生发展的影响,利用RNA干扰技术构建SRSF10敲低的胃癌细胞,同时采用MTS、Transwell以及细胞划痕方法研究敲低SRSF10后对胃癌细胞表型的影响。结果胃癌中差异表达的剪接因子有48个,其中表达上调35个,表达下调13个。挑选表达上调的剪接因子SRSF10进行进一步研究,发现SRSF10敲低后的胃癌细胞与正常胃癌细胞相比增殖减慢,迁移能力降低,划痕愈合能力下降。结论胃癌患者中存在较多有表达差异的剪接因子,可能在胃癌发生发展中起到重要作用。剪接因子SRSF10在胃癌发生发展中可能发挥重要的作用。     

环状RNA的生物学功能及其在不同分子分型乳腺癌中的研究进展

环状RNA(circRNA)是反向剪接形成的闭合circRNA分子,其特性与线性RNA不同,在生命活动和与其相关疾病的调控中发挥重要作用.circRNA的特有功能使其在调节乳腺癌细胞的生物学功能(包括增殖、迁移、侵袭)方面显示出巨大潜力,其表达水平与不同分子分型乳腺癌细胞的生物学行为、乳腺癌患者的临床预后密切相关.探讨...     

NCAM L1小基因模型的建立及其剪接模式研究

目的:建立可用于前体mRNA可变剪接分析的NCAM L1小基因模型.方法:以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得NCAM L1小基因片段,并将其克隆至真核表达载体中,构建小基因的质粒.在此基础上,用NCAM L1小基因模型转染HeLa、COS-1、PFSK及R28细胞,并用RT-PCR进行被剪接的小基因产物的半定量检测.结果:NCAM L1小基因在4种细胞中的剪接模式不同,在PFSK以及Hela细胞中,存在2种剪接亚型,而在COS-1以及R28细胞中只有一种剪接亚型存在.结论:所构建的NCAM L1小基因可用于细胞水平的基因剪接分析.     

上调环状RNA_8199表达对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:探讨上调环状RNA_8199表达对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响.方法:RT-PCR检测ESCC细胞系KYSE520中环状RNA_8199的表达;Sanger测序对环状RNA_8199反向剪接位点的PCR产物进行验证;将KYSE520细胞中提取的RNA分为RNase R处理组与对照组,R...     

不同剪切形式的小鼠Era对L-929细胞的影响

目的: 构建两种完全可调控诱导不同剪接形式小鼠era的真核表达载体,检测不同剪接形式的鼠Era蛋白对细胞生长状态的影响.方法: 构建两种不同剪接形式鼠era的完全可调控诱导表达载体,分别与受体表达载体pERV3稳定共转染鼠成纤维细胞系L-929.用PonA进行诱导表达后,以Western Blotting检测Era蛋白表达水平,以MTT法测定细胞生长曲线,以流式细胞仪检测细胞周期.结果: 成功获得稳定的可完全诱导表达两种不同剪接形式鼠Era蛋白的细胞系;经过PonA诱导后,过表达两种剪接形式Era蛋白的L-929细胞,生长速度加快,G2/M期细胞数量明显减少.结论: 两种剪接形式鼠Era蛋白在真核细胞周期中发挥重要作用.     

人肝癌细胞辅酶Ⅱ-依赖性视黄醇脱氢/还原酶选择性剪接新亚型的鉴定和分析

目的：鉴定人肝癌细胞HepG2中辅酶Ⅱ-依赖性视黄醇脱氢/还原酶（NRDR）的选择性剪接新亚型DHRS4L1A1,并检测其在不同细胞中的表达情况。方法：采用快速cDNA末端扩增方法,从HepG2中克隆选择性剪接亚型的cDNA序列;通过查找开放阅读框架,预测并分析剪接新亚型的蛋白质序列和功能;用半定量RT-PCR法检测8种不同细胞株中新剪接亚型的相对表达量。结果：DHRS4L1A1全长1 117 bp,为NRDR选择性剪接新亚型;该亚型在卵巢癌细胞SKOV3中的表达量显著高于其他细胞。结论：DHRS4L1A1表达的蛋白属于SDR家族,该亚型可能参与生殖系统相关酶类的代谢。     

环状RNA与神经系统疾病的关系研究进展

环状RNA(circRNA)是一类通过反向剪接方式形成的特殊非编码RNA,在生物体内广泛存在,具有高度保守性,且较相应线性RNA稳定,可发挥基因表达调控、细胞通讯及蛋白翻译等多种重要生物学功能。circRNA具有组织器官特异性并在神经系统富集,其可能通过竞争性结合微RNA,影响轴突生长、神经元迁移,与RNA结合蛋白相互作用等机制,参与脑的发育及变性疾病、肌肉疾病、脑血管疾病等神经系统疾病的发生发展,故circRNA在神经系统疾病的诊断和治疗方面具有广阔的前景。     

中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因剪接变异体的克隆及其在人类细胞中的表达

目的克隆中国近交系版纳微型猪(Chinese Banna Minipig Inbred Line,BMI)的α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)基因并分离其剪接变异体,构建其真核表达载体并观察BMIα1,3-GT基因在人肺腺癌A549细胞中的表达和功能。方法提取BMI肝组织总RNA,RT-PCR扩增全长的α1,3-GTcDNA,并克隆到pMD18-T载体,挑选15个阳性克隆进行测序,获得GT1、GT2两种基因剪接变异体。将GT1、GT2克隆到pEGFP-N1上构建其真核表达载体,分别命名为pN-GT1、pN-GT2。将pN-GT1、pN-GT2分别转染人肺腺癌A549细胞,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GT mRNA的表达,倒置荧光显微镜和流式细胞术观察转染细胞上α-半乳糖基(α-Gal)的表达,流式细胞术检测人血清中IgM抗体和补体C3与转染细胞上α-Gal的结合。结果在BMI中发现了碱基长度为1116bp和1080bp的两个α1,3-GT基因剪接变异体,后者缺失了外显子5。pN-GT1或pN-GT2转染的A549细胞中,均检测到了α1,3-GT mRNA和α-Gal的表达,转染细胞膜上也检测到IgM和C3的沉积,且两种转染细胞中α-Gal的表达及IgM和C3的沉积没有差异(P>0.05)。结论成功克隆了BMI的α1,3-GT基因,并发现两种α1,3-GT基因剪接变异体。两种基因剪接变异体转染的细胞中,均检测到α1,3-GT mRNA的表达且α1,3-GT能催化合成具有生物学效应的α-Gal,这为BMI用于异种移植中涉及α1,3-GT基因操作的研究提供了基因背景资料。     

ILF2在肿瘤细胞中的功能和机制研究进展

ILF2编码的蛋白质是白细胞介素2基因的T细胞表达所需的转录因子,ILF2在人体组织中普遍表达,并与其结合配偶体NF90一起参与DNA和RNA代谢过程中的多个通路,包括DNA修复和复制,转录,翻译,mRNA剪接,miRNA加工成熟等。ILF2在肿瘤发生发展中具有重要的功能,已有报道在多种肿瘤中具有促癌功能。文章对ILF2在人类肿瘤中的研究进行综述。     

CD2相关蛋白剪接异构体启动子区及其缺失体的构建和活性分析

目的:构建CD2相关蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)剪接异构体启动子区及其缺失体,转染HEK293及HeLa细胞,评价其启动子活性?方法:取稳定生长的HeLa细胞,常规方法提取总RNA,逆转录为cDNA并以此为模板,PCR扩增CD2AP剪接异构体之一CD2AP002转录起始位点上游2 200 bp的启动子区域片段,亚克隆这些片段至pGL-3基本载体上的多个克隆位点,构建含CD2AP002启动子的重组质粒?CD2AP002质粒构建成功后,以此质粒为模板重复上述步骤构建一系列CD2AP002启动子5′侧翼区缺失体?重组质粒及其缺失体转染人胚肾HEK293细胞及人宫颈癌HeLa细胞,双荧光素酶报告基因检测各片段的活性?结果:酶切?核酸序列分析证实,成功构建含CD2AP002启动子的重组质粒及其缺失体?经双荧光素酶活性检测证实不同片段大小的5′侧翼区序列缺失体均具有与片段长度相应的活性?结论:成功构建出在HEK293及HeLa细胞中具有活性的重组质粒及其缺失体?     

非编码RNA对冠心病发生发展影响的研究进展

非编码RNA(ncRNA)与冠心病的发生、发展关系密切。尤其是在心血管平滑肌细胞的增殖、细胞凋亡、脂质代谢以及相关炎症反应方面,微RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)都参与冠心病发生过程,并且这3种ncRNA还能相互协作共同影响冠心病的发生与发展。例如miR-21参与冠心病的炎症反应,而过表达lncRNA MEG3能够抑制miR-21的表达进而促进过氧化物酶活化、脂肪分化、血管生成,参与冠心病患者疾病的发生。同时circRNA可以充当miRNA海绵吸附体来调节基因表达或直接调控基因的剪接和转录。     

蛋白激酶A催化亚基差异性地调节tau外显子10的可变剪接

tau外显子10的可变剪接使得tau变异体含有3个或4个微管结合片段,分别称为3R-tau和4R-tau。正常人脑表达等量的3R-tau和4R-tau,它们的表达失衡可引起神经纤维退行性疾病。本文利用迷你tau基因,通过过表达和RNA沉默技术,研究了PKA的催化亚基（PKA-Cα）和（PKA-Cβ）对tau外显子10可变剪接的调节,发现PKA-Cα促进tau外显子10的编码,PKA-Cβ抑制外显子10的编码。这2种催化亚基在细胞内的定位也不尽相同,在HeLa细胞中PKA-Cα的定位以细胞核为主,而PKA-Cβ则以细胞浆为主。在阿尔茨海默病（AD）患者脑中PKA的活性和表达均下降,通过引起tau外显子10的可变剪接的失调,使得3R-tau和4R-tau的表达失衡,加速神经纤维退行性病变。     

RBM4a基因表达与功能研究进展

RNA结合基序4（RNA?binding motif 4,RBM4）是一个参与不同细胞生物学过程的RNA结合蛋白（RNA?binding protein,RBP）,其结构包含两个RNA识别基序和一个CCHC型锌指结构。RBM4表达于多种组织,参与前体mRNA的选择性剪接、翻译控制和RNA沉默等转录后基因调控过程。RBM4具有多种生物学功能,包括维持胚胎和性腺发育、控制昼夜节律及介导细胞分化等。RBM4的表达异常可导致多种疾病的发生,特别是与肿瘤的关系密切,但具体分子机制尚需进一步研究。文章就RBM4的相关研究进展作一综述。     

环状RNA在皮肤肿瘤中的研究进展

环状RNA(circRNA)是mRNA在剪接过程中5'端与3'端剪接到一起而形成的非编码RNA。circRNA的高度稳定性、高丰度和组织特异性赋予circRNA的许多潜在功能,近年来研究发现circRNA对基因转录及转录后水平有重要意义,此外已发现circRNA与多种癌症的发生有关。皮肤基底细胞癌中,显著异常表达的circRNA潜在靶向与癌症相关的miRNA,如hsa-miR-19b-1。皮肤鳞癌中circRNA的miRNA响应元件已有23个与之对应的且与皮肤鳞癌相关的miRNAs。目前发现肿瘤中存在许多异常表达的circRNA,对于circRNA-miRNA的研究,可以为癌症的基因靶向治疗提供新思路。     

环状RNA与神经、肌肉功能及相关疾病的研究进展

晚期声带麻痹喉肌功能损伤是咽喉外科亟待解决的难题.环状RNA(circRNA)是通过非经典剪接方式形成的一种内源性环形非编码RNA,它可能通过miRNA海绵、可变剪接调节因子等方式在多种疾病的发生、发展中起重要作用,是潜在的疾病早期诊断生物标志物或干预治疗的新靶点.随着研究的不断深入,circRNA与神经、肌肉功能及相...     

一个新的NPCEDRG基因mRNA剪接变异体的克隆及鉴定

目的:克隆并鉴定NPCEDRG基因mRNA剪接变异体.方法:利用5’-RACE、3’-RACE在CNE2细胞中对NPCEDRG基因mRNA剪接变异体进行扩增,T/A克隆入pMD20载体,所获得的阳性重组子经测序证实.结果:成功克隆得到一种新的NPCEDRG基因的mRNA剪接变异体V2,其TSS位于-23 nt处,其CD...     

RBM4a基因研究进展

RNA结合基序4（RNA-binding motif 4,RBM4）是一个参与不同细胞生物学过程的RNA结合蛋白（RNA-binding protein,RBP）,其结构包含两个RNA识别基序和一个CCHC型锌指结构。RBM4表达于多种组织,参与前体mRNA的选择性剪接、翻译控制和RNA沉默等转录后基因调控过程。RBM4具有多种生物学功能,包括维持胚胎和性腺发育、控制昼夜节律及介导细胞分化等。RBM4的表达异常可导致多种疾病的发生,特别是与肿瘤的关系密切,但具体分子机制尚需进一步研究。本文将就RBM4的相关研究进展作一综述。     

IGF2BP2调控食管癌细胞增殖和凋亡相关基因可变剪接的机制研究

目的 探讨胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2(IGF2BP2)通过调控基因表达和可变剪接在食管癌发生、发展中的作用机制。方法 在人食管癌细胞系ECA109中对IGF2BP2进行过表达,并进行转录组测序,通过分析IGF2BP2所调控的差异表达基因和可变剪接基因,探讨IGF2BP2在食管癌中的作用机制。结果 IGF2BP2过表达后引起158个基因显著差异表达,其中上调基因81个,下调基因77个(FC≥2 or≤0.5,P<0.01),基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书分析发现IGF2BP2通过调控差异表达基因的方式影响食管癌的发生、发展,可能并不显著。IGF2BP2过表达可变剪接水平发生显著变化的基因,在GO分析中富集到糖基磷脂酰肌醇锚定生物合成过程,主要富集的信号通路是细胞增殖和细胞凋亡等。在细胞增殖中具有丰富意义的可变剪接基因发现,IGF2BP2过表达后21个(ADAMTSL4、TRIO、PLEKHG2等)在细胞增殖方面可变剪接的基因。在细胞凋亡中具有丰富意义的可变剪接基因发现了23个(细胞周期蛋白依赖性激酶11B、制瘤素M的细胞因子受体、MRE11A等)在IGF2B...