基因芯片法筛选膝骨关节炎滑膜相关差异表达基因

目的应用基因芯片技术筛选骨关节炎(OA)滑膜组织和正常滑膜组织的差异表达基因。方法体外分离OA与正常滑膜组织,经原代培养生长至四代的成纤维样滑膜细胞(FLS)用于实验。分别提取OA和正常FLS总RNA,反转录成cDNA,并以两种荧光Cy5和Cy3标记后作为探针,与覆盖21 073条人类基因的Agilent Human 1A表达谱芯片进行杂交,扫描芯片荧光信号图像后用基因图像分析软件进行数字化处理和分析。结果共筛选出显著表达的差异基因1403条,其中668种基因表达水平上调,735种基因表达水平下调。结论 OA发病是多基因共同作用的结果,OA与正常FLS差异表达的1403种基因可能参与了OA的发生和发展。对这些基因的进一步研究有望加深认识OA发病机制,找到新的疾病相关关键分子。     

应用双向电泳技术初步建立人精子头部蛋白质图谱

目的 :利用人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳 (2 DE)技术建立正常人精子头部蛋白质图谱。　方法 :先用固相pH梯度 SDS电泳技术 (IPG DALT)对全精子和精子头部蛋白质抽提物进行蛋白质分离 ,然后用图像分析软件比较精子头部蛋白质图像与精子蛋白质图像的蛋白质斑点组成差异。其中 ,全精子蛋白质的抽提比较了硫脲 /尿素 /盐酸胍和Kit/盐酸胍两种抽提方法。　结果 :硫脲 /尿素 /盐酸胍法与Kit/盐酸胍法所得的全精子 2 DE图像蛋白质斑点分别为 80 2个和 797个 ,其中相同的有 4 92个 ,将两种方法获得的图像整合而得到的全精子蛋白质图像有1 1 0 7个蛋白质斑点 ;精子头部图像蛋白质斑点有 4 2 8个 ,经匹配 ,全部来源于全精子蛋白质图像。　结论 :综合采用两种蛋白质提取方法初步建立了精子头部蛋白质图谱。     

环状RNA0001495/微小RNA-527/Robo1轴对膀胱癌细胞增殖和转移的影响

目的探讨环状RNA(circRNA)₀001495/微小RNA(miR)-527/Robo1轴对膀胱癌细胞增殖和转移的影响。方法人膀胱癌细胞系T24培养至对数生长期, 分为circRNA对照组和circRNA₀001495 KD组, 采用对照circRNA短发卡RNA(shRNA)和circRNA₀001495 shRNA慢病毒感染T24细胞, 建立稳转细胞系。分别采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色分析两组细胞增殖能力;采用划痕实验和Transwell实验分析两组细胞迁移和侵袭能力。生物信息学和双荧光素酶报告基因分析circRNA₀001495的靶基因;采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析circRNA₀001495靶基因miR-527表达水平;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析miR-527的靶蛋白。组间计量数据比较采用t检验。结果对照组细胞circRNA₀001495表达水平(1.02±0.0...     

Decorin对人僵直膝关节滑膜囊成纤维样滑膜细胞增殖及蛋白合成的抑制作用

[目的]探讨重组核心蛋白多糖(decorin)对培养的人僵直膝关节滑膜成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的增殖和Ⅰ型胶原蛋白及mRNA合成的影响,为Decorin治疗人膝关节僵直提供理论依据。[方法]分离培养人僵直膝关节滑膜FLS,分别加入不同质量浓度(10μg/ml,0.1μg/ml)的Decorin;培养24、48、72h后用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定FLS的增殖速度;用流式细胞仪检测FLS的周期和凋亡;用RTPCR法检测FLS合成Ⅰ型前胶原蛋白(PcⅠ)mRNA的含量,westem Blot检测Ⅰ型胶原蛋白的合成量,并与对照组比较。[结果]10μg/ml的Decorin可有效抑制滑膜FLS的增殖(P0.05),明显增加FLS处于G0/G1期的百分比(P0.05),并通过下调PcⅠmRNA的表达,在转录水平上抑制PcⅠ的合成;实验组和对照组均未检测到终末期凋亡细胞。[结论]Decorin可抑制人僵直膝关节滑膜FLS的增殖及PcⅠmRNA的表达和Ⅰ型胶原蛋白合成,在防治膝关节僵直中起一定的作用。     

重组Furin蛋白对类风湿关节炎滑膜细胞生物学行为的影响

[目的]探讨重组弗林蛋白(Furin)对于类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜细胞增殖、迁移、侵袭和细胞因子分泌的影响。[方法]从类风湿关节炎患者关节内提取RA滑膜组织后培养原代滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synovial cells,FLS);将重组Furin蛋白按照不同浓度(250 ng/ml,500 ng/ml)加入RA滑膜细胞培养基中诱导培养并采用MTT、细胞划痕、Transwell、ELISA等方法检测重组蛋白处理对细胞增殖、迁移、侵袭和炎性因子分泌等生物学特性的影响。[结果]与空白对照组比,加入重组Furin蛋白处理24 h、48 h,对类风湿滑膜细胞增殖活动没有明显影响(P>0.05)。处理24 h后与空白对照组比,迁入划痕伤口内细胞数无显著区别(P>0.05),滑膜细胞穿透基底膜细胞数明显减少(P<0.05),且与剂量浓度呈正相关。培养液上清中IL-1α和IL-17含量升高(P<0.05),而各组间IL-1β和TNF-α含量差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]重组Furin蛋白诱导可抑制类风湿关节炎滑膜细胞侵袭能力同时可促进其分泌IL-1α和IL-17。     

人脾脏巨噬细胞总RNA的提取和产率研究

目的　探讨提取人脾脏巨噬细胞总RNA的方法并测算其产率。方法　收集 5例门静脉高压症脾亢患者的手术切除脾脏 ,经贴壁培养法分离纯化出巨噬细胞 (Mφ)后 ,采用TRIzol试剂一步法提取 5例脾脏Mφ样本的总RNA。分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的产量和质量。最后计算出每 10 8个Mφ总RNA的产率。 结果　 5例样本Mφ总RNA的A2 60nm与A2 80nm比值平均为 1.83± 0 .13 ,提示总RNA纯度较高 ,电泳结果提示总RNA无降解。每 10 8个Mφ平均可抽提 (4 1.5 8± 2 3 .13 ) μg总RNA。 结论　采用TRIzol试剂一步法提取脾脏Mφ总RNA是可行的 ,收获的人脾脏Mφ总RNA纯度高、完整性好、量较多 ,可满足后续实验要求。     

小干扰RNA干扰大鼠神经元Nogo受体mRNA表达的实验研究

目的观察大鼠Nogo受体(NgR)特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在原代神经元干扰其mRNA表达的效果。方法体外培养大鼠原代皮层和海马细胞,应用阳离子脂质体转染试剂转染4对化学合成的大鼠NgR特异性siRNA,72h后提取细胞总RNA,实时荧光定量RT-PCR检测NgR mRNA表达情况。结果4对siRNA均能够下调靶基因NgR的mRNA表达水平,siNgR199、siNgR562、siNgR772和siNgR964等干扰后,NgR mRNA的表达分别为对照siRNA干扰组的6.5%、62.4%、15.2%和6.86%,与对照siRNA干扰组比较有统计学意义(P<0.05)。结论化学合成的NgR特异性siRNA能够有效的干扰大鼠原代皮层和海马细胞内NgR基因mRNA的表达水平。     

老年性骨关节炎与类风湿关节炎滑膜细胞转化特性的比较研究

目的与骨关节炎比较,探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)胞外信号活化蛋白激酶(ERK)的活化状态和P53蛋白的异常表达。方法原代培养RA FLS和OA FLS,应用western blot检测二者ERK活化状态的差异;应用抗P53抗体(DO-1和PAb240)与抗PCNA抗体对RA和OA的滑膜组织和细胞进行免疫组织化学染色;并进一步应用western blots确定RA FLS P53的异常表达。结果与OA相比,RA滑膜衬里层P53蛋白表达增多,主要为与抗突变型P53抗体阳性反应细胞积聚,并进一步证实RA衬里层成纤维样滑膜细胞P53表达异常;而且RA FLS在低血清和非贴壁情况下ERK活化状态均明显高于骨关节炎。结论类风湿关节炎衬里层成纤维样滑膜细胞P53蛋白异常表达,而且ERK处于持续活化状态,这为RAFLS的转化特性提供了新的佐证。     

环状RNA 0001846对骨关节炎生物学功能的影响及其机制

目的探讨环状RNA 0001846(circ₀001846)调控滑膜巨噬细胞极化在骨关节炎中的生物学功能及其机制。方法收集常州市第二人民医院2021年12月至2022年9月行全膝关节置换术骨关节炎患者及遭受膝关节创伤且无骨关节炎患者的滑膜组织各10例, 将10例骨关节炎滑膜组织作为研究组, 10例非关节炎滑膜组织作为对照组。使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定环状RNA(circRNA)及巨噬细胞标志物在滑膜组织的mRNA表达水平;使用THP-1细胞上清液孵育软骨细胞, 通过细胞计数试剂盒(CCK-8)与流式细胞术测定软骨细胞活力、软骨细胞凋亡率;蛋白质印迹法(Western blot)检测软骨细胞凋亡相关蛋白表达水平。组间比较采用t检验。结果实验组患者滑膜组织中M1巨噬细胞标志物表达高于对照组[诱导型一氧化氮合酶(iNOS):2.67±0.34比0.98±0.10, t=15.140, P<0.01;肿瘤坏死因子-α(TNF-α):2.51±0.31比1.02±0.22, t=12.422, P<0.01和白细胞介素(IL)-1β:4.27...     

乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文库构建

目的构建乳鼠成骨细胞的酵母双杂交cDNA文库。方法用TRIzol法提取乳鼠成骨细胞总RNA,按照SMART cDNA Library Construction Kit ( CLONTECH)说明书反转录合成双链cDNA.Spin Column去除短片段,然后用同源重组的方法将双链 cDNA和PGADT7~rec载体共转化到酵母细胞Y187中,建立文库并计算文库滴度。结果提取的总RNA的A 260/A 280为 1.99,琼脂糖凝胶电泳示28SrRNA、18SrRNA2条带,且28S与18S带亮度比值约为2。酵母文库库容为1. 68 x 107,重组率为 100%。插人片段PCR检测提示大小分布为1. 5 -4. 0 kb,平均长度约为3. 0 kb。结论乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文 库构建成功。     

一种高效同时提取微量组织中总RNA、DNA和蛋白的技术方法的改进

目的 改进传统Trizol法,以至能从微量组织样品中提取高质量RNA并同时提取基因组DNA和总蛋白.方法 用改良后的Trizol法提取小鼠肝脏组织总RNA、基因组DNA以及总蛋白,并与传统Trizol法提取总RNA、商业化试剂盒提取基因组DNA和RIPA裂解Buffer提取总蛋白的方法进行比较.结果 改良Trizol法提取小鼠肝组织RNA的得率为3.64μg/mg,传统Trizol法为1.95μg/mg,平均D260/280比值为2.1和2.01;改良Trizol法能够得到比传统Trizol法更完整的RNA,琼脂糖电泳图谱中28S/18S的比值更接近2∶1.改良Trizol法与商业试剂盒相比,提取所得的基因组DNA尽管在得率上有较明显差距,分别为0.49μg/mg和1.78μg/mg,但仍保持较好的纯度.改良Trizol法提取所得蛋白的平均得率为RIPA Buffer裂解法的50％~60％,经过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色法验证,并无明显蛋白丢失.结论 改良Trizol法可以同时提取组织的总DNA、RNA与总蛋白,相比传统Trizol法提取总RNA更高效、质量更优;相比商业化试剂盒提取基因组DNA更快捷、更经济;相比RIPA Buffer裂解法提取总蛋白在小分子蛋白的保留中更好.     

转化生长因子-β1在脑血管畸形中的表达

转化生长因子 β(TGF β)具有细胞生长与分化、细胞黏连与细胞外基质的形成、修复损伤、免疫调节以及胚胎发育等多种生物学功能[1,2 ] 。小鼠体内实验显示TGF β能快速诱导血管形成,在体外实验中也观察到促进胶原蛋白的形成[3 ] 。我们采用TGF β1RNA狭缝杂交观察TGF β1在脑血管畸形(AVMs)中的作用。一、材料和方法1.标本来源:取自我院和华山医院神经外科(陈衔成教授提供部分标本)手术切除14例脑AVMs及其周围脑组织标本和8例正常脑血管和脑组织标本液氮速冻,-70℃保存。2 .总RNA提取、RNA电泳:用Trizol试剂提取总RNA电泳…     

类风湿关节炎与骨性关节炎成纤维样滑膜细胞蛋白酪氨酸磷酸化状态的比较

目的 比较类风湿关节炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ,ＲＡ）与骨性关节炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ,ＯＡ）成纤维样滑膜细胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ,ＦＬＳ）蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异。方法滑膜细胞原代培养,流式细胞仪鉴定滑膜细胞型别,提取蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单向电泳和ＩＣＥ－ＰＡＧＥ双向电泳分离后,应用抗蛋白酪氨酸磷酸化抗体进行ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测。结果 滑膜细胞原代培养至第三代时,ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ阳性细胞比例小于１％,ＲＡ ＦＬＳ蛋白酪氨酸磷酸化程度是ＯＡ ＦＬＳ的４～６倍。结论 滑膜细胞原代培养至第三代时即可以获得型别均一的ＦＬＳ,ＲＡ ＦＬＳ酪氨酸磷酸化程度较ＯＡ ＦＬＳ明显增     

人精子RNA的提取及含量分析

目的建立可靠的提取人精子RNA的方法,分析其含量并用于检测基因mRNA。方法9例正常精液标本液化后,经Percoll纯化,用体细胞裂解液(含0.1%十二烷基硫酸钠和0.5%Triton X-100的水溶液)于0℃处理15 min去除精子以外的细胞。用RNeasy Kit提取精子RNA,微量核酸测定仪测定RNA量。RNA用于逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测β-Actin、精子特异性阳离子通道2(CatSper2)、鱼精蛋白2(Protamine-2)mRNA,同时,检测c-Kit、CD4、上皮细胞钙粘蛋白(E-Cad-herin)mRNA,分别排除生精细胞、白细胞和上皮细胞的污染。结果体细胞裂解液于0℃处理15 min能去除精子以外的细胞,使精子RNA提取量提高(2.2~4.9倍)。9例正常精液标本RNA量为(233.5±75.3)ng/106精子。所有标本RNA用RT-PCR,均成功扩增β-Actin、CatSper2、Protamine-2,但扩增c-Kit、CD4、E-Cadherin未见目的条带。结论人精子中含微量RNA,本提取方法能提取人精子中微量RNA,且避免其他细胞污染,可供人精子RNA研究和临床检测选用。     

钙结合蛋白S100A11对人静脉畸形组织和人脐静脉内皮细胞增殖、血管生成和局部侵袭能力的影响

目的观察对钙结合蛋白S100A11在人静脉畸形组织和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中生物学特性的研究, 探讨其对静脉畸形组织和HUVEC的增殖、血管生成、局部侵袭等生物学能力的影响。方法将静脉组织研磨后提取总RNA, 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测人静脉畸形组织和对照正常血管组织标本中S100A11的相对表达量。将HUVEC细胞随机分为实验组和对照组, 即si-S100A11组和si-NC组, 利用RNA干扰技术沉默si-S100A11组编码S100A11蛋白mRNA。通过RT-qPCR分别检测两组细胞的转染效率;细胞计数试剂盒(CCK-8)检测两组细胞的增殖活性;Transwell检测两组细胞的局部侵袭能力;Matrigel血管生成实验检测沉默后细胞的成管数目。两组间比较采用两样本独立t检验。结果 RT-qPCR结果表明, 静脉畸形组织(VMs组)与正常血管组织(NC组)中S100A11的表达量分别为14.97±16.30和1.01±0.01, 差异有统计学意义(t=-3.63, P<0.01);RNA干扰后的si-S100A11组和si-NC组S100A11...     

大鼠移植小肠冷保存/再灌注后基因表达谱的变化

目的　研究冷保存 /再灌注后大鼠移植小肠基因表达谱的变化 ,以探讨移植物损伤的机制。方法　建立改良式大鼠异位节段小肠移植和正常对照模型。抽提对照组正常小肠和移植肠冷保存 /再灌注 1h后总RNA并纯化mRNA将两组等量抽提纯化的小肠mRNA逆转录合成cDNA荧光探针 ,与cDNA芯片杂交。严格洗片后扫描芯片荧光信号图像 ,分析比较两组中差异表达基因。结果　在 40 96条基因中 ,两组间存在差异表达的基因共 82条 ,新发现基因 18条 ,表达序列标识 (EST ) 3 3条 ,已报道基因 3 1条。该 3 1条差异表达基因与移植物冷保存 /再灌注损伤存在相关性。结论　移植小肠冷保存 /再灌注损伤与中性多形核白细胞和微血管内皮细胞异常黏附、移植物细胞能量和葡萄糖、蛋白质代谢障碍等因素有关     

髋骨性关节炎滑膜组织中钙结合蛋白（S100A12）的表达及意义

目的观察髋骨性关节炎患者血液及滑膜组织中钙结合蛋白S100A12的表达,以探讨它在髋骨性关节炎致病过程中的作用,为揭示髋关节骨性关节炎发病机制提供理论和实验依据。方法收集行髋关节置换的27例髋骨性关节炎患者(OA组)与35例股骨颈骨折患者(对照组);对OA组患者的髋关节X片分析,根据Kellgren-Lawrence(K-L)分级标准对患者进行分级;对两组患者静脉采血,术中取滑膜组织,采用ELISA法定量和免疫组化技术检测S100A12的表达,并采用IPP软件半定量分析免疫组化S100A12的表达量。结果 OA组的血清中S100A12水平(94.20±49.85)ng/m L显著高于对照组含量(25.32±16.87)ng/m L,有统计学差异(P0.01);滑膜组织OA组与对照组S100A12含量分别为(3.73±1.97)ng/mg总蛋白和(1.67±1.21)ng/mg总蛋白(P0.01),差异有统计学意义;免疫组化分析S100A12阳性反应在滑膜微血管内中性粒细胞胞浆中,以及部分滑膜细胞的胞浆内。OA组平均光密度MOD(0.21±0.06)较对照组MOD(0.13±0.05)有显著性差异(P0.01);OA组K-L分级4级患者的血清中S100A12水平(104.81±46.68)ng/m L显著高于3级血清含量(86.85±52.46)ng/m L,有统计学差异(P0.01)。4级患者滑膜组织含量(4.62±1.95)ng/mg总蛋白显著高于3级患者水平(3.13±1.82)ng/mg总蛋白(P0.01)。结论 S100A12在髋骨关节炎患者的滑膜组织表达量显著增加;S100A12的表达与患者髋骨关节炎严重程度相关;S100A12的检测有助于骨性关节炎的诊断,为临床治疗提供参考。     

hsacirc0025853在低温减轻神经母细胞瘤细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤中的作用

目的评价hsa_circ₀025853在低温减轻神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)氧糖剥夺-复糖复氧损伤中的作用。方法体外培养SK-N-SH细胞至对数生长期, 采用随机数字表法分为4组(n=20):对照组(C组)、氧糖剥夺-复糖复氧组(OGD/R组)、低温组(H组)、hsa_circ₀025853干扰RNA(siRNA)+低温组(S+H组)。C组细胞在正常条件下培养;OGD/R组氧糖剥夺3 h后复糖复氧24 h;H组氧糖剥夺3 h后, 在32 ℃低温下复糖复氧24 h。S+H组在氧糖剥夺-复糖复氧模型制备前48 h转染siRNA序列, 余同H组。于复糖复氧24 h时, 采用CCK-8法检测细胞活力, 流式细胞术检测细胞凋亡率, qRT-PCR法检测线粒体动力相关蛋白1(Drp1) mRNA、hsa_circ₀025853表达, Western blot法检测Drp1表达水平。结果与C组比较, 其余3组细胞活力降低, 细胞凋亡率升高, hsa_c     

Menin在胃癌细胞中的表达

我们选取5株不同分化程度的人胃癌细胞,检测Menin的表达,现报道如下. 一、材料与方法 1.材料和细胞培养:Trizol、逆转录(RT)试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒、荧光二抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗、Menin和甘油醛-3-磷酸脱氢酶( GAPDH)抗体购自美国Santa公司.人胃癌细胞AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-28和人胃黏膜上皮细胞GES-1均为本实验室保存,细胞常规培养并进行后续实验. 2.RT-PCR检测:采用Trizol试剂,按说明书提取细胞总RNA,应用鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶将总RNA逆转录成cDNA并进行扩增和琼脂糖凝胶电泳分离,用Tanon-2500凝胶成像进行检测.     

正常生育男性成熟精子mRNA的种类和特征

目的:剖析具有正常生育能力男性成熟精子mRNA的种类和丰度。方法:健康并育有后代的成年男性10例,禁欲1周后取精液,上游法优化精子,Trizol试剂提取精子总RNA。混合所有总RNA进行基因表达系列分析(SAGE)。结果:所建SAGE文库共获877个克隆,测序得到21 052个标签,出现两次以上的独特性标签有2 712种。经与SAGEm ap数据库比对,19.7%的独特性标签没有基因匹配,代表新基因;其余能匹配的基因中,67%具有蛋白质结合或核酸结合能力,41%具有催化活性,13%与信号转导有关,与细胞运输、精子结构、转录调节相关者分别达到10%左右。结论:人成熟精子中存在数量庞大、种类繁多的mRNA。