抗CD20单链抗体融合显性抗原肽的原核表达和其抑瘤活性研究

目的:人工设计并表达美罗华(C2B8)单链可变区抗体与李斯特菌溶细胞素O(Listeriolysin O,LLO)显性抗原表位构成的重组融合蛋白(Sc Fv-p LLO),初步分析其抗淋巴瘤细胞活性。方法:查询数据库获得美罗华(C2B8)单抗VH和VL基因序列,构建抗CD20单链抗体(Sc Fv)基因序列,选取LLO的2个CD4+T细胞表位,构建单链抗体融合抗原表位的重组蛋白基因序列,克隆至原核表达载体,经诱导表达纯化,流式细胞术和免疫共沉淀分析其与淋巴瘤细胞结合能力,细胞增殖实验测定其对淋巴瘤细胞生长的影响,凋亡实验分析其诱导淋巴瘤细胞凋亡的能力,淋巴细胞增殖实验分析其免疫原性。结果:成功诱导表达重组蛋白Sc Fv-p LLO。Sc Fv-p LLO可不同程度地靶向结合不同淋巴瘤细胞系,并明显抑制Raji细胞生长和诱导其凋亡。Sc Fv-p LLO可刺激免疫小鼠脾细胞增殖。结论:重组蛋白Sc Fv-p LLO保留了Sc Fv的功能,可靶向结合和抑制CD20阳性淋巴瘤细胞的生长,同时可激活机体免疫应答,为进一步研究其模拟瘤细胞表面抗原和作为瘤细胞疫苗佐剂的功能奠定基础。     

抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的: 研制抗李斯特菌溶血素(LLO)的单克隆抗体(mAb).方法: 通过诱导重组大肠杆菌BL21(pGEX-6p-1-hly), 以SDS-PAGE分离菌体蛋白, 切割目的蛋白LLO-GST条带, 研磨粉碎后免疫BALB/c小鼠, 取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合.利用亲和层析法纯化目的蛋白, 作为检测抗原进行杂交瘤细胞的筛选.采用间接ELISA法测定腹水效价, Dot-ELISA、 Western blot分析mAb的特异性.结果: 获得3株稳定分泌抗LLO mAb的杂交瘤细胞株3B6、 4D1、 5D10, 其Ig亚类均为IgG1.3B6、 4D1、 5D10腹水的ELISA效价分别为1:2×105、 1:2×105、 1∶1×105.Western blot试验中, 3株mAb均能与融合蛋白LLO-GST发生反应出现特异性条带, 而与纯化蛋白GST不反应.在Dot-ELISA试验中, 3株mAb均能与表达LLO的细菌发生特异性反应.结果表明, mAb 3B6、 4D1、 5D10是针对LLO的特异性mAb.结论: 成功地制备了抗LLO的mAb, 为进一步研究LLO的生物学特性、产单核细胞李斯特菌的致病机制, 以及建立产单核细胞李斯特菌(LM)快速检测技术奠定了基础.     

减毒单增李斯特菌疫苗递呈研究进展

<正>单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种革兰氏阳性兼性厌氧胞内寄生条件致病菌。该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障,引起人和动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症~([1])。且具有独有的胞内逃逸存活和胞间传送等特性,因此是研究胞内寄生的模式细菌。目前研究发现Lm的毒力主要由六个毒力因子编码基因(prfA-plcAhly-mpl-actA-plcB)组成。plcA和plcB分别编码磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)和卵磷脂酶(PCPLC),有助于Lm逃离吞噬小体;actA与基于Lm肌     

单增李斯特菌感染抑制HepG2细胞RhoA表达并促进其凋亡

目的探讨单增李斯特菌(Lm)调控Hep G2细胞的凋亡能力以及对Rho家族Rho A蛋白表达的影响。方法常规方法培养Hep G2细胞,分别以感染复数(MOI)=10和MOI=100接种Lm菌EGD株,共培养1 h和20 h后收集培养物。异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率,反转录PCR检测Hep G2细胞Rho A和caspase 3编码基因表达,分光光度法检测Hep G2细胞活化的caspase 3水平,Western blot法检测Hep G2细胞Rho A蛋白表达。结果 Lm的侵袭可促进Hep G2细胞凋亡,下调Hep G2细胞Rho A编码基因和蛋白表达,并上调caspase 3编码基因表达。结论 Lm感染促进宿主细胞凋亡,抑制宿主细胞Rho A表达。     

李斯特菌溶血素通过激活PI3K / Akt 信号通路促进呼吸道上皮细胞炎症反应及MUC5AC 表达

目的:初步探讨李斯特菌溶血素(LLO)刺激呼吸道上皮细胞株(16-HEB)产生炎性反应及促进MUC5AC表达的分子机制,为阐明李斯特菌的致病机制提供理论依据。方法:采用不同浓度的LLO(15、30、45μg/ml)刺激16-HEB细胞株24 h后,qRT-PCR和ELISA法分别检测细胞中MUC5AC的mRNA转录水平与蛋白浓度变化,以及炎性因子IL-6与IL-1β的含量及mRNA转录水平; Western blot检测不同浓度LLO刺激后细胞中p-Akt、Akt的表达情况及相对含量; PI3K抑制剂LY294002预处理后检测p-Akt、Akt的表达情况,随后用LLO刺激16-HEB细胞株,并进一步检测细胞中MUC5AC与炎性因子的表达转录情况。结果:随着LLO刺激浓度的增加,细胞中MUC5AC的转录水平与浓度逐渐上升,且均显著高于对照组(P0. 05),炎性因子IL-6与IL-1β的含量与转录水平也显著增加(P 0. 05); Western blot结果显示LLO能够激活p-Akt的表达(P0. 05),而使用抑制剂LY294002处理后则会显著降低细胞中p-Akt的表达(P0. 05);抑制剂处理后细胞中MUC5AC与炎性因子的表达与转录水平均出现降低,且显著低于LLO刺激组(P0. 05)。结论:LLO能够激活PI3K/Akt信号通路进而诱导16-HEB细胞产生炎性因子IL-6、IL-1β,并促进细胞中MUC5AC的表达。     

敲低lincRNA-COX2抑制单核细胞增生李斯特菌感染相关的巨噬细胞的凋亡和M1型极化

目的 探讨长链基因间非编码RNA环加氧酶2(lincRNA-COX2)在单核细胞增生李斯特菌(Lm)感染所致RAW264.7细胞凋亡和细胞极化中的作用。方法 体外培养RAW264.7细胞，分为未感染对照组、 Lm感染组、小干扰RNA阴性对照(si-NC)组、 si-NC联合Lm组、 lincRNA-COX2小干扰RNA(si-lincRNA-COX2)组、 si-lincRNA-COX2联合Lm组。Lm感染复数(MOI)=10感染RAW264.7细胞，细菌感染6 h后收集细胞，倒置荧光显微镜和实时定量PCR检测siRNA转染抑制效率，Western blot法检测细胞中裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、 caspase-3、 B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、 Bcl2相关X蛋白(BAX)、精氨酸酶1(Arg1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白水平。结果 Lm感染RAW264.7细胞后，c-caspase-3/caspase-3、 BAX/Bcl2比值、 iNOS蛋白水平较对照组显著上调，而Arg1水平较对照组下调。敲低lincRNA-COX2可抑制Lm感染引起的RAW2...     

一种具有抗HIV和其它病毒作用的生物制剂CV-N

蓝藻菌病毒素-N(Cyanovirin-N,CV-N)是近年来在蓝藻菌中发现的一种新的具有抗HIV病毒活性的蛋白质,它可以和HIV病毒的外壳糖蛋白gp120和gp41发生特异性的结合作用,不可逆的使病毒失去感染细胞的能力。本文主要针对CV-N的生物学性质及其应用前景进行了介绍。     

李斯特菌上调约氏疟原虫感染鼠疟模型的Th1应答效应

目的探讨李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y 17XL)感染小鼠的免疫应答调节机制。方法小鼠腹腔注射感染疟原虫2 d后尾静脉分别接种Lm及热灭活李斯特菌(heat-killed Lm,HKLm),对照组单独感染疟原虫,统计小鼠虫血症及生存率。感染后处死小鼠,流式细胞术检测脾细胞内细胞因子IFN-γ,Real-time PCR检测细胞因子IL-4、IL-10、IL-12p40、IFN-γ分泌水平,Griess反应检测脾细胞上清中一氧化氮(NO)含量。结果与对照组相比,Lm接种组的虫血症水平明显降低,P.y 17XL感染后5 d,CD4+、CD8+T细胞分泌的IFN-γ水平明显升高,巨噬细胞活化,NO产生增加。P.y17XL感染后3 d(Lm接种后1 d),Lm接种组比HKLm接种组IFN-γ水平升高显著,HKLm接种组虫血症水平与对照组基本一致。结论本研究表明Lm通过增强P.y 17XL感染小鼠的Th1应答对疟疾感染起到一定的免疫保护作用,并且这种保护作用与感染早期诱导IFN-γ分泌有关。这对于进一步以Lm为疫苗载体或佐剂研制抗疟新药具有重要的科学指导意义。     

携耶尔森菌HPI大肠埃希菌的致泻性调查

ＨＰＩ(ｈｉｇｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｓｌａｎｄ)为高致病力群耶尔森菌 (包括鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌生物群 1Ｂ)中发现的一种毒力岛 ,介导铁载体耶尔森杆菌素 (ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｙｅｒｓｉｎｉａｂａｃｔｉｎ)的生物合成和摄取 ,为菌株致小鼠死亡所必需。近年来国内外学者在许多大肠埃希菌分离菌株中先后也发现了此ＨＰＩ〔1,2〕,然而 ,目前尚不明了大肠埃希菌中检出的ＨＰＩ是否与菌株的致病性有关。我们对分离自杭州各类人群的大肠埃希菌菌株 ,应用菌落原位杂交技术和ＰＣＲ技术检测ＨＰＩ的…     

免疫细胞吞噬体成熟的蛋白质组学研究

吞噬过程是最重要的天然免疫防护机制之一。从吞噬体产生到成为具有杀死并降解被吞噬物的吞噬溶酶体的过程称为吞噬体的成熟。该成熟过程涉及蛋白质组的一系列动态变化,因此蛋白质组学已经成为吞噬体成熟研究的重要工具。目前,人们多以乳胶颗粒为吞噬物,研究吞噬体成熟过程中不同阶段吞噬体蛋白质组成的变化,对吞噬体成熟机制有了进一步的认识。而深入优化包含菌的吞噬体提取方法,研究病原体诱发的吞噬体成熟过程,将有望揭示吞噬体成熟过程中病原体与宿主细胞相互作用的细节,阐明某些病原体颠覆吞噬体成熟过程的机制。     

成人中枢神经系统李斯特菌感染患者的临床特征

目的分析成人中枢神经系统李斯特菌感染的临床特点、治疗和转归,提高对中枢神经系统李斯特菌病的认识。方法回顾性分析北京协和医院1999年至2018年收治的成人中枢神经系统李斯特菌病患者的临床特征。结果共纳入34例成人中枢神经系统李斯特菌感染患者,女性占68%,平均年龄为(43±15)岁;32例(94%)患者有基础疾病;临床表现主要为发热(100%),意识改变(71%);实验室检查发现外周血白细胞和中性粒细胞计数均升高,淋巴细胞计数减少;C反应蛋白升高(85%); 9例(26%)患者临床转归不佳,2例死亡,7例病重转院/出院。结论成人中枢神经系统李斯特菌病多累及原有免疫低下疾病患者,临床预后不良转归概率高,当免疫功能低下患者出现中枢神经系统感染症状时,应考虑到李斯特菌病,抗菌素经验用药应覆盖李斯特菌。     

苏云金芽孢杆菌4AJ1细菌素对单增李斯特菌的活性研究

细菌素(bacteriocin)是细菌在代谢过程中由核糖体合成基因编码的一类具有生物活性的多肽或蛋白质类物质.与抗生素相比,细菌素具有靶向性强、安全和不容易产生耐药性等优点.近年来,研究发现苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)可产生不同大小的具有抑菌作用的细菌素[1].本研究旨在寻找安全、高效、具备应用潜力的新型细菌素,探讨苏云金芽孢杆菌4AJ1细菌素对单核细胞增多性李斯特菌的抑菌活力[2].为新型抗李斯特菌的药物研发提供基础资料.     

名词解释

0123 肌动蛋白调制素(Acumcntin) 从免肺泡巨噬细胞分离的蛋白质,在结构和功能上与人粒细胞存在的一种蛋白质相似。分子量65,000,是一种肌动蛋白抑扬调节蛋白,其作用不依赖钙离子。 0124 双型酶(ambiquitous enzymes) 系指既能以可溶形式,又能以膜结合形式而被分离的那些酶。 0125 双血红素b双铜蛋白(bis〔(heme b)copper〕protein)系从牛红细胞分离得到的一种蛋白质,分子量     

单核细胞增生李斯特菌与志贺菌双重实时PCR检测技术的建立

目的 建立一种快速、特异、灵敏、准确定量的单核细胞增生(单增)李斯特菌(Listeriamonocytogenes)与志贺菌(Shigella)同步检测方法.方法 分别根据单增李斯特菌溶血素O基因hly与志贺菌侵袭性质粒抗原H基因ipaH设计合成引物和探针.构建重组质粒pGEM-T-hly与pGEM-T-ipaH,并以EcoR I单酶切使环状重组质粒线性化作为标准品.优化反应体系,分析特异性.双重荧光定量PCR对人工污染的脱脂灭菌乳进行检测.结果 成功构建了重组质粒标准品,并运用5'、3'端分别标记FAM、TAMRA的hly基因探针和5'、3'端分别标记HEX、TAMRA的ipaH基因探针成功建立了单增李斯特菌与志贺菌同步荧光定量PCR检测方法.结论 建立的方法有较强的特异性,线性范围好(105～101copies/μl,R2≥0.998),灵敏度为10 copies/PCR,同步检测人工污染脱脂灭菌乳的灵敏度为102CFU/ml.     

一种具有抗HIV和其它病毒作用的生物制剂CV-N

蓝藻菌病毒素-N（Cyanovirin-N,CV-N）是近年来在蓝藻菌中发现的一种新的具有抗HIV病毒活性的蛋白质,它可以和HIV病毒的外壳糖蛋白gp120和gp41发生特异性的结合作用,不可逆的使病毒失去感染细胞的能力.本文主要针对CV-N的生物学性质及其应用前景进行了介绍.     

锌离子依赖金属蛋白酶1(Zmp1)抑制小鼠RAW264.7细胞增殖以及吞噬体-溶酶体的融合

目的观察卡介苗(BCG)的锌离子依赖金属蛋白酶1(Zmp1)对RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖以及吞噬体-溶酶体融合的影响。方法在大肠杆菌BL21(DE3)中克隆表达Zmp1,用金属螯合磁珠纯化;用纯化的Zmp1处理RAW264.7细胞,采用CCK-8法检测(0、24、48、72、96)h的细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期分布;用减毒沙门菌感染RAW264.7细胞诱导吞噬体形成后,用Zmp1处理细胞,在吞噬体内的减毒沙门菌和溶酶体的溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)分别用相应Alexa Fluor~350抗沙门菌抗体(蓝色荧光)和Cy5抗LAMP1抗体(红色荧光)标记,通过荧光显微镜观察RAW264.7细胞内两种荧光,将其重合分析吞噬体与溶酶体融合情况。结果用Zmp1蛋白处理细胞48 h后,细胞增殖活性明显降低;处理48 h后,细胞周期中G1期细胞比例下降,S期比例增高;采用双荧光标记感染沙门菌的RAW264.7细胞,Zmp1处理后显示紫色荧光的吞噬溶酶体融合减少。结论 Zmp1抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞增殖,抑制吞噬体-溶酶体融合。     

TNF-α激活RhoA/ROCK信号通路增加单核细胞增生性李斯特菌感染内皮细胞的通透性

目的探讨大鼠肉瘤同源基因A/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(RhoA/ROCK)信号通路在肿瘤坏死因子α(TNF-α)促进单核细胞增生性李斯特(Lm)感染致内皮细胞通透性升高的调控作用。方法培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为未感染细胞对照组、 TNF-α处理组(100 ng/mL TNF-α处理2 h)、 Lm感染组(以MOI=10的Lm感染2 h,加入庆大霉素杀菌0.5 h)、 TNF-α处理的Lm感染组(Lm感染组细胞加入100 ng/mL TNF-α处理2 h)、 Y-27632联合TNF-α处理的Lm感染组(细胞用50μmol/L ROCK抑制剂Y-27632处理30 min,再如上进行Lm感染和TNF-α刺激)。Western blot法检测HUVEC的RhoA、闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)、 ROCK蛋白水平,检测辣根过氧化物酶(HRP)渗漏量分析HUVEC通透性变化,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鬼笔环肽染色检测纤维型肌动蛋白(F-actin)细胞骨架的改变。结果 TNF-α可降低Lm感染的内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、 occludin的表达,促进其通透性升高、细胞骨架重排,并上调RhoA和ROCK的表达。ROCK抑制剂Y-27632可明显抑制TNF-α所致的HUVEC细胞骨架重排及通透性增高的作用。结论 TNF-α促进感染Lm的血管内皮细胞通透性增高可能通过RhoA/Rock信号通路调控。     

人白细胞间素2作为肿瘤、免疫缺陷及传染病辅助治疗的可能应用

本文应用高度纯化的白细胞间素2(IL-2)进行动物实验与临床的体内和体外研究.通过动物体外实验表明低剂量的人IL-2(<10U/ml)能特异性地增强抗原刺激细胞毒T淋巴细胞(CTL),高剂量的IL-2(>25U/ml)能产生非特异的杀伤细胞〔Grimm等命名为淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞〕.无论半纯化或高度纯化的人、大鼠和小鼠的IL-2制剂都具有诱导LAK细胞的活性.已观察到LAK细胞能溶解可移植和自发的乳腺癌细胞.许多报告证     

卡介菌多糖核酸和地塞米松对口腔扁平苔藓TH1/TH2细胞因子的调节作用

口腔扁平苔藓 (orallichenplanus ,OLP)是T淋巴细胞介导的免疫反应 ,其主要病理变化为固有层大量的T淋巴细胞呈带状浸润〔1〕 。卡介菌多糖核酸(BacillusCalmette Guerinpolysaccharidenucleicacid ,BCGPSN)是从卡介菌中经热酚法提取的一种具有免疫调节功能的免疫调节剂 ,对慢性支气管炎、哮喘等疾病有较好的疗效。本研究拟通过观察BCGPSN和地塞米松对OLP患者外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcells ,PBMC)IFN γ和IL 4的调节作用 ,探讨OLP患者的TH1 TH2免疫应答模式及BCGPSN和糖皮质激素对OLP患者TH1 TH2…     

PCR与微孔板杂交结合检测单核细胞增多性李斯特氏菌

ＰＣＲ与微孔板杂交结合检测单核细胞增多性李斯特氏菌姜永强雷祚荣李瑾马颖单核细胞增多性李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，简称单增李氏菌）引起食源性李斯特氏菌病爆发。常规从食品中分离和鉴定单增李氏菌的方法费工、费时。在应用ＰＣＲ方法...