上丘提取促培养大鼠视网膜神经细胞生长的研究

目的 观察上丘提取液（ＳＣＥ）能否促进培养大鼠视网膜神经细胞的存活和生长。方法 １２只生后２～３天ＳＤ大鼠视网膜组织经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液后,接种于覆有鼠尾胶原的９６孔增养板（７５ｕｌ／孔,约１×１０＾５细胞／孔）。分为１,３,５天培养组,每一培养时期又分为对照组和ＳＣＥ组。分别用ＭＴＴ微量自动比色法测量存活ＯＤ值。结果 培养在鼠尾胶原上的视网膜神经细胞生长良好。培养１,３天时,ＳＣＥ组细胞     

成年人视网膜神经细胞体外培养的实验研究

目的建立成年人视网膜神经细胞的体外培养体系,研究细胞体外生长特性和结构特点。设计实验性研究。研究对象体外培养的成年人视网膜神经细胞。方法以成年人视网膜为研究对象,进行体外细胞培养;取培养7～10天的细胞行免疫组织化学鉴定;取培养10天的细胞行扫描电镜超微形态学检查。主要指标细胞形态,结构。结果在适宜的条件下,成年人视网膜神经细胞可以在体外培养并表现特有的结构特点和生长特性,免疫组化鉴定显示大部分细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性,说明所培养细胞大部分为神经细胞。扫描电镜下观察贴壁伸展生长细胞主要为感光细胞、双极细胞、水平细胞等神经细胞和少量胶质细胞。结论在适宜的培养条件下,成年人视网膜神经细胞可以在体外进行培养并且表现出良好的生长活性。     

当归提取液对培养的成年人视网膜神经细胞活性的影响

 目的  研究当归提取液对体外培养的成年人视网膜神经细胞活性的影响。设计 实验研究。 研究对象 成年人视网膜神经细胞。方法 体外培养成年人视网膜神经细胞,加入倍比稀释浓度（1.25、2.50、5.00、10.00、 20.00、40.00、80.00 g/L）的当归提取液各50 μl,培养至24 h和72 h时,以MTT法检测细胞存活和生长情况;共聚焦显微镜测定细胞线粒体膜电位荧光强度值变化,记录培养液未加入当归提取液以及两次加入当归提取液（两次加药相隔94秒）后细胞线粒体膜电位荧光强度的变化,比较首次加药、再次加药及未加药间细胞荧光强度峰值。主要指标 细胞存活和生长情况,细胞线粒体膜电位峰值。结果 成年人视网膜神经细胞培养至24 h及72 h时MTT法检测显示,80.00 g/L当归提取液对成年人视网膜神经细胞保护作用分别相当于对照组的256%和261%。线粒体膜电位检测荧光强度的变化显示,首次加入当归提取液后荧光强度峰值（26.02±7.62）较加药前（4.95±0.02）增加了437%（P＜0.001）;再次加入当归提取液后荧光强度峰值（54.17±14.15）较加药前（4.95±0.02）增加了997%（P＜0.001）。表明当归提取液能够显著升高成年人视网膜神经细胞的膜电位并使其兴奋性呈波动性变化。 结论  当归提取液对成年人视网膜神经细胞有一定的保护作用,有望成为一种新的防治视网膜疾病的辅助治疗药物。     

大鼠小团样视网膜神经细胞培养的方法

目的:探讨视网膜神经细胞的体外培养方法。方法:取出生3d的SD大鼠视网膜组织,木瓜蛋白酶和胰蛋白酶依次消化并吹打制成含不同大小细胞团块的细胞悬液,放入50mL/LCO2,37℃的孵箱中培养。用倒置相差显微镜观察视网膜神经细胞的生长情况。结果:聚集成小团的视网膜神经细胞(<50个细胞)与完全分离成单个的神经细胞相比,贴壁和发出轴突的时间早,轴突长度长,细胞间的轴突联系增多,细胞存活时间亦延长。而较大团块状的细胞只可以见到轴突的伸出和伸长。结论:小团样的视网膜神经细胞培养有利于神经细胞的存活和细胞间的轴突联系,这可能得益于视网膜多种细胞间的联系在体外的持续保持。     

成人视网膜神经细胞的原代培养和初步鉴定

目的建立成人视网膜神经细胞培养系统，为深入研究视网膜细胞及观察药物作用提供基础。方法采用组织块培养法，以含100g·L^-1 FBS的IMDM作为细胞培养液，培养成人视网膜细胞，对培养7—10d的细胞进行初步细胞鉴定。结果体外培养成人视网膜细胞原代培养可达80d左右，早期培养的细胞中视网膜神经细胞占65％左右，其中可见多数带有外节段的感光细胞。结论这种培养方法提供的视网膜细胞早期主要以神经细胞为主，可用于视网膜神经细胞的药物作用研究。     

巨噬细胞调理液促进培养鼠视网膜神经细胞存活

目的 观察巨噬细胞调理液（ＭＣＭ）能否促进培养大鼠视网膜神经细胞的存活和生长,以探讨其损伤后的修复问题。方法 将生后２－３天Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠视网膜组织经胰蛋白酶消化后进行培养,并设对照组。用ＭＴＴ比色法测量存活细胞的ＯＤ值。结果 培养在鼠尾胶原上的ＲＮ生长良好,且部分细胞伸出突起。培养,１,３５天,ＭＣＭ促ＲＮ存活率分别为４０．７％,３９．９％和５１．２％。结论 巨噬细胞能分泌某些     

大鼠视网膜神经细胞的培养

建立视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓ,ＲＧＣｓ）的体外培养方法,为ＲＧＣｓ的体外实验研究奠定基础。方法采用胰酶消化将１６只生后２－３天的Ｓｐａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠视网膜制成细胞悬液后,接种于涂以鼠尾胶原的２４孔培养板,预先置入１ｃｍ＊１ｃｍ的载玻片。     

培养的大鼠视网膜神经细胞转基因研究

目的:探讨胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)基因转染培养的视网膜神经细胞的可能性及其表达情况。方法:培养的SD大鼠视网膜神经细胞应用脂质体法转染报道基因(pcDNA3-LacZ)和pcDNA3-GDNF,应用RT-PCR及SDS-PAGE电泳检测其表达情况。结果:pcDNA3-LacZ可转染到视网膜神经细胞。应用RT-PCR可在转染的培养细胞中检测到GDNF转录水平的表达,并可通过SDS-PAGE电泳观察到32KD的表达产物。结论:pcDNA3-LacZ可以作为视网膜神经细胞转基因成功与否的判别指标。pcDNA3-GDNF可转染培养的SD视网膜神经细胞,并可检测到其表达,为青光眼的视功能损害防治提供了一种新的可能。眼科学报1998;14:57—60。     

大鼠视网膜神经细胞体外培养

目的 建立视网膜神经层分散细胞的培养方法，以进一步对视网膜神经元细胞(尤其是视网膜神经节细胞)和神经胶质细胞进行体外实验研究。方法 取出生后1～3d的SD乳鼠的视网膜，用胰酶消化法制备分散细胞悬液后，接种于置有包被poly-D-lysine玻片的24孔培养板中培养，倒置相差显微镜观察细胞生长规律。培养第7d，用抗神经元特异性核(NeuN)抗体和抗神经丝(Neurofilament-200，NF-200)抗体分别标记视网膜神经元细胞和神经节细胞(RGCs)，并计算每10个高倍镜下的细胞数以及RGCs所占百分数。结果 体外培养的视网膜神经元细胞经历了贴壁、重聚、迁移和相互接触的过程，有突起样生长，其中RGCs占神经元的55％左右。结论 视网膜神经层分散细胞体外培养成功，并有较好的RGCs生长率，为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。     

银杏叶提取物对培养大鼠视网膜神经细胞的保护作用

目的 观察银杏叶提取物（EGb761）对大鼠视网膜神经细胞线粒体膜电位（MMP）的影响及其对抗谷氨酸兴奋性毒性对视网膜神经细胞的保护作用。方法培养视网膜神经细胞，用Rhodaminel23标记培养7d的视网膜神经细胞线粒体，分为正常对照组、EGb761组、符氨酸组以及EGb761＋谷氨酸组，共聚焦激光显微镜动态检测MMP的变化。结果与正常对照组比较谷氨酸组MMP下降；EGb761组MMP及EGb761＋谷氨酸组MMP升高，P〈0．01。结论EGb761可能通过升高视网膜神经细胞MMP的途径影响线粒体的功能；并且可对抗谷氨酸兴奋性毒性，保护视网膜神经细胞。     

经上丘逆行标记法视网膜神经节细胞定量的实验研究

目的　建立一种视网膜神经节细胞 (RGCs)定性及定量的研究方法 ,并了解大鼠RGCs密度分布情况。方法　暴露大鼠双上丘后将饱含 3 0 %辣根过氧化物酶 (HRP)溶液的明胶海绵片贴附于双上丘表面 ,大鼠存活 2 4h后 ,取出视网膜行HRP组织化学反应 ,计算机图像分析系统对RGCs进行分类及计数。结果　左右眼RGCs密度分别为 14 66±3 76/mm2 及 14 5 7± 40 4/mm2 ,左眼鼻、颞侧RGCs密度分别为 14 90± 3 71/mm2 及 14 4 2± 3 82 /mm2 ,右眼鼻、颞侧RGCs密度分别为 14 67± 410 /mm2 及 14 4 6± 40 0 /mm2 。结论　成功地建立了直接上丘HRP逆行标记RGCs定量计数法 ,正常大鼠双眼RGCs密度基本相同 ,颞侧及鼻侧RGCs密度基本相同。     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养与鉴定

目的建立猪视网膜色素上皮（RPE）细胞体外分离、纯化培养体系并进行鉴定,为研究RPE细胞的功能及治疗相关眼底疾病提供细胞来源。方法采用胰蛋白酶消化法获取猪RPE细胞进行原代及传代培养,倒置显微镜观察细胞生长过程及形态变化并计算生长数据,角蛋白和RPE65蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果用胰蛋白酶消化法分离培养的猪RPE细胞生长良好,表现为多边形和梭形两种形态,原代细胞胞浆内含有丰富的色素颗粒,传代细胞内色素颗粒较原代细胞少。免疫组织化学法证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。结论培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源,体外分离、纯化和培养猪RPE细胞的成功,为RPE细胞功能和相关视网膜疾病的深入研究提供了细胞来源。     

Cytotoxic effects of antiproliferative agents on human retinal glial cells in vitro

Purpose: Proliferative vitreoretinopathy (PVR) is characterizedby the formation of cellular membranes on the detached retina and also in the vitreous. Glial cellscan be found in epiretinal and subretinal membranes from eyes with PVR, proliferative diabeticretinopathy (PDR), idiopathic macular pucker, uveitis and other diseases affecting theretina. Proliferation and contraction of glial cells appears to play a role in the pathogenesisof PVR. This study is designed to inspect the effectiveness of harringtonine, as well as colchicine,daunomycin and fluorouracil, against cellular proliferation of cultured human retinal glial cellsthat might be involved in the retinal and/or vitreous proliferation. Methods: Cultures of human retinal glial cells were preparedusing the enzyme digesting method. Cells that had been in culture for 2–5 passages were usedin this study. Harringtonine (0.063 g/ml 2.0 g/ml), colchicines(0.5 g/ml 16.0 g/ml), daunomycin (0.1 g/ml 3.2 g/ml) and 5-fluorouracil(0.5 g/ml 16.0 g/ml) were added to cultures of human retinal glial cellsand the proliferation rates of the cells were measured by the MTT method. Results: Harringtonine at the dosage of 0.063 g/mlinduced suppression of cellular growth, but the changes were not statistically significant (p > 0.05).At a dosage ranging from 0.125 g/ml to 2.0 g/ml, harringtonine significantly suppressedcellular growth according to the test (p < 0.01). Likewise, other antiproliferativeagents inhibited cellular growth significantly at a dosage from 1.0 g/ml to 16.0 g/ml(colchicine), 0.2 g/ml to 3.2 g/ml (daunomycin) and 1.0 g/ml to 16.0 g/ml(5-fluorouracil), but not at 0.5 g/ml (colchicine), 0.1 g/ml (daunomycin) and0.5 g/ml (5-fluorouracil). The ID₅₀ were 0.33 g/ml (harringtonine), 3.11 g/ml (colchicine), 0.79 g/ml (daunomycin) and 5.23 g/ml (5-fluorouracil), respectively.Conclusions: Harringtonine was extremely effective ininhibiting human retinal glial cell proliferation, like other antiproliferative drugs such as colchicine,daunomycin and 5-fluorouracil. Harringtonine, therefore, may be a candidate for further studies regardingthe treatment of experimental PVR.     

蛇毒神经生长因子对体外培养鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的研究蛇毒神经生长因子（venom nerve growth factor，vNGF）对离体培养的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的存活和轴突再生的影响。方法采用新生大鼠视网膜神经细胞体外原代培养技术，加入不同浓度的vNGF，通过检测细胞的活力选择一个最佳浓度进行培养，行抗Thy-1．1免疫细胞化学染色，观察RGCs在体外的存活时间,比较实验组和对照组的RGCs个数、胞体直径和轴突长度。结果vNGF的最佳浓度是80μg.L，用该浓度作用于细胞，实验组与对照组细胞存活时间分别为13～14d和7～8d，轴突长度分别为（111.78±10.65）μm和（78.73±8.23）μm。阳性细胞个数分别为（224.23±3.83）个和（182.47±2.79）个。结论vNGF能促进体外视网膜神经细胞和RGCs的存活以及轴突的伸长，有视神经保护作用。     

人类视网膜色素上皮细胞体外培养的转分化

目的:研究人类视网膜色素上皮细胞(human retinal pig-ment epithelium,HRPE)体外培养的转分化现象。方法:倒置显微镜观察体外培养HRPE细胞形态变化;采用免疫细胞化学染色方法检测HRPE细胞角蛋白及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的变化。结果:HRPE细胞体外培养时形态由上皮细胞特征变化成为间质样细胞;细胞角蛋白表达与传代代数呈负相关(r=-0.831,P<0.001),α-SMA表达与传代代数呈正相关(r=0.456,P=0.002);角蛋白18表达高密度组较低密度组强(t=2.591,P=0.027);而α-SMA表达高密度组较低密度组弱(t=2.938,P=0.015)。结论:HRPE细胞体外培养转分化主要是体内外环境差异引起。     

视网膜神经节细胞多种培养方法的实验研究

目的探讨视网膜神经节细胞（ＲＧＣｓ）的多种培养方法。方法（１）在涂有鼠尾胶原的器皿上通过调整培养液培养：①乳鼠混合及纯化的ＲＧＣｓ；②单层星型胶质细胞上种植纯化的乳鼠ＲＧＣｓ；③引产胎儿混合ＲＧＣｓ。（２）检验鼠尾胶原及中脑顶盖提取液（Ｔｅ）对培养的乳鼠ＲＧＣｓ的影响。结果（１）混合培养的乳鼠及引产胎儿ＲＧＣｓ大多能存活２周以上；（２）纯化的乳鼠ＲＧＣｓ大多能存活４８ ｈ；（３）单层星型胶质细胞上种植的纯化乳鼠ＲＧＣｓ能存活４周以上；（４）鼠尾胶原及Ｔｅ对培养的乳鼠ＲＧＣｓ的贴壁及生长有明显的促进作用。结论通过调整培养液及改善微环境能用多种方法培养ＲＧＣｓ。     

新生Long Evans大视网膜小胶质细胞原代培养及鉴定

目的:建立稳定高产的新生Long Evans大鼠视网膜小胶质细胞(retinamicrogliacellRMG)体外培养、分离的方法。方法:取出生3d内的LongEvans新生大鼠视网膜神经上皮层进行混合细胞培养,10～12d后振荡分离,纯化培养得到小胶质细胞;小胶质细胞的特异性标记IB-4及CD11b进行组化及细胞免疫荧光鉴定,扫描电镜观察细胞表面突起。结果:得到纯度较高的小胶质细胞,IB-4组化及CD11b细胞免疫荧光鉴定纯度分别为94.5%和95.8%,扫描电镜观察细胞表面为棘状突起,明显与巨噬细胞的细胞表面区别。结论:本方法可以得到纯度高的视网膜小胶质细胞。     

巨噬细胞培养液对离体培养的大鼠视网膜神经节细胞的作用研究

目的研究巨噬细胞培养液对离体培养的视网膜神经节细胞(retinal ganglioncells,RGCs)存活和生长的作用,探讨损伤晶状体促进RGCs存活和轴突再生的作用物质,为视神经损伤和再生的基础研究提供理论依据。方法制备大鼠巨噬细胞培养液,分别用巨噬细胞培养液及DMEM对RGCs进行离体培养,观察RGCs在体外存活的时间,测量培养1d、3d和5d有突起的RGCs数目及最长突起长度,进行组间比较。结果(1)对照组离体培养的细胞于培养5～6d崩解死亡,而巨噬细胞培养液组细胞能存活6～8d;(2)培养1d、3d和5d,巨噬细胞培养液组有突起的RGCs数目分别为(59.74±2.04)个.mm-2、(96.78±4.11)个.mm-2和(99.26±3.04)个.mm-2,均明显多于同期对照组,差异非常显著(P<0.01);(3)培养1d和3d,巨噬细胞培养液组RGCs最长突起长度分别为(39.70±0.71)μm和(76.19±1.56)μm,较对照组延长,差异非常显著(P<0.01)。培养5d,RGCs最长突起长度与对照组比较差异显著(P<0.05)。结论巨噬细胞培养液可促进离体培养的RGCs存活和生长。