缺氧对血管内皮生长因子启动子-胸苷激酶系统杀伤肝癌细胞系的增强作用

目的：探讨缺氧对腺病毒介导的血管内皮生长因子启动子－胸苷激酶系统（AdVEGF-tk)对肝癌细胞系HepG2选择性杀伤活性的增强作用。方法：采用AdEasy system构建重组腺病毒载体AdVEGF-tk和AdVEGF-GFP,在293细胞中包装,扩增后,分别感染L02（正常肝细胞系）和HepG2,A VEGF-GFP感染细胞经正常培养24h后,在荧光显微镜下观察其荧光蛋白表达情况;AdVEGF-tk感染细胞在缺氧或不缺氧条件下培养,并给予不同浓度的丙氧鸟苷（GCV）处理,用MTT法检测感染细胞的增殖情况,结果：AdVEGF-GFP感染的L02细胞仅见稀散的荧光,而AdVEGF-GFP感染的HepG2细胞则出现大量荧光,感染AdVEGF-tk后,当感染指数（MOI）为100目GCV浓度为10ug/ml时,L02细胞在不缺氧条件下对GCV几乎不敏感,但在缺氧条件下,70％以上的细胞被杀死,而HepG2细胞即便在不缺氧培养条件下也有60％以上的细胞被杀死,缺氧则使80％以上细胞被杀死,结论：缺氧可加强腺病毒介导的AdVEGF-tk系统对体外培养肝癌细胞的选择性杀伤作用。     

华蟾素对MG-63骨肉瘤细胞杀伤作用的实验研究

目的探讨华蟾素（cinobufagin）对人骨肉瘤细胞株MG-63的促凋亡作用。方法采用MTT比色法、透射电镜观察、原位末端标记tunnel法、流式细胞仪检测等方法,观察和检测华蟾素对MG-63的促凋亡作用。结果华蟾素对MG-63骨肉瘤促凋亡作用明显,且呈现时间和浓度依赖性。华蟾素将MG-63细胞阻断在S期,可诱导骨肉瘤细胞凋亡。与甲氨蝶呤对照组相比,不同浓度下华蟾素对MG-63细胞促凋亡作用更显著。结论华蟾素对MG-63骨肉瘤促凋亡明显。华蟾素可用于骨肉瘤治疗。     

乏氧条件启动HRE调控HSV-TK/GCV效应链对人肺腺癌A549细胞杀伤作用的观察

目的：观察由缺氧反应元件（HRE）调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷（HSV-TK／GCV）系统对乏氧环境中的人肺腺癌细胞系A549细胞的杀伤作用。方法：将HRE调控HSV-TK和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）双基因共表达的真核载体pHRE-TK通过脂质体导入A549细胞，分别在乏氧（O2浓度为3％）和常氧（O2浓度为21％）环境中培养，荧光显微镜观察重组载体转染A549细胞后报告基因EGFP表达变化，并进行荧光光密度（FOD）分析；再予以GCV处理5d后，用MTT法检测GCV对培养细胞的杀伤效果。设立分别仅含有HRE、HSV-TK以及两者均无的3个荧光表达载体（pHRE、pTK、pEGFP）为对照组。结果：在乏氧环境中，由HRE调控的重组载体pHRETK和pHRE转染A549细胞后，其FOD值高于无HRE调控的载体pTK和pEGFP转染组P〈0．01；而在常氧环境中各组细胞之间FOD值差异无统计学意义，P〉0．05。携带HSV-TK基因的重组载体pHRE-TK和pTK转染A549细胞后，细胞对GCV的敏感性均高于无HSV-TK基因的pHRE组细胞，P〈0．01；敏感性随GCV浓度增加而增大。在乏氧环境中培养的pHRE-TK组细胞对GCV的敏感性高于pTK组（P〈0．01），亦高于在常氧环境中培养的pHRE-TK组细胞，P〈0．01；而在常氧环境中，pHRE-TK组与pTK组细胞对GCV的敏感性差异无统计学意义，P〉0．05。结论：在乏氧的A549细胞内，HRE使报告基因EG—FP表达增强；HRE能增强HSV-TK／GCV系统对乏氧环境中的A549细胞的杀伤效率。     

DC与CIK共培养对骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨树突状细胞(dendritic cells,DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)共培养对人骨肉瘤细胞的杀伤效应.方法 从健康志愿者中分离外周血单个核细胞,制备DC和CIK,并以5:1比例混合培养.采用CCK-8法和流式细胞术检测DC-CIK共培养...     

缺氧对骨肉瘤SaOS-2细胞系HIF-1α和VEGF表达的影响

目的：观察缺氧条件下骨肉瘤SaOS-2细胞系缺氧诱导因子HIF-1α和血管生长因子VEGF表达的变化。方法：建立骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型，观察缺氧培养不同时相(8、16、24h)HIF-1α和VEGF的表达。半定量RT—PCR方法检测HIF-1α和VEGF mRNA的转录水平，免疫组化(SP法)和免疫印迹(Western blot)检测HIF-1α蛋白表达情况，免疫组化和ELISA法检测细胞和培养上清液中VEGF蛋白表达。结果：缺氧处理后，HIF-1α mRNA转录水平没有明显改变，蛋白表达随缺氧时间延长而升高。VEGF mRNA以及蛋白的表达在缺氧条件下均显著增强。结论：骨肉瘤细胞系SaOS-2在缺氧条件下．缺氧诱导因子HIF-1α和血管牛长因子VEGF蛋白表达上调。     

华蟾素和顺铂对骨肉瘤MG-63细胞联合杀伤作用的研究

目的：探讨比较华蟾素（ cinobufagin ）协同顺铂（ cisplatin ）对人骨肉瘤细胞株 MG-63的杀伤作用。方法体外培养骨肉瘤细胞株 MG-63细胞,取对数生长期细胞进行实验;采用 MTT 比色法测定MG-63细胞的生长抑制作用并计算细胞抑制率;流式细胞仪检测骨肉瘤细胞的凋亡率和细胞周期,观察细胞凋亡率的变化情况和药物对细胞周期的抑制作用;原位末端标记法（ TUNEL ）观察骨肉瘤细胞的凋亡情况并检测细胞凋亡率;相差显微镜观察骨肉瘤细胞生长状况及形态学上的改变。结果华蟾素和顺铂均对骨肉瘤细胞有生长抑制作用,华蟾素组、顺铂组及华蟾素＋顺铂组在药物浓度不同时对骨肉瘤细胞的生长抑制作用各不相同,在药物浓度低于80μg/ml时,各实验组药物对细胞的生长抑制作用随药物浓度的增加而上升;当药物浓度达到80μg/ml时,华蟾素组和顺铂组药物对骨肉瘤细胞的生长抑制作用不再增加,但华蟾素＋顺铂组药物对细胞的生长抑制作用在药物浓度达到160μg/ml时,抑制作用仍强于其浓度为80μg/ml时。各实验组在药物浓度相同时华蟾素＋顺铂对骨肉瘤细胞的生长抑制作用明显强于单独应用华蟾素或者顺铂。结论华蟾素＋顺铂对骨肉瘤 MG-63细胞的联合杀伤作用明显强于单独应用顺铂或者华蟾素;在抑制骨肉瘤 MG-63细胞生长方面,华蟾素协同顺铂对细胞的杀伤作用效果显著,并且具有时间和浓度依赖性。     

多种细胞因子诱导的杀伤细胞体外扩增及对骨肉瘤细胞杀伤活性的研究

目的探讨不同人群来源的多种细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine—induced killer cells,CIK）细胞增殖及细胞毒活性的作用,为CIK细胞在骨肉瘤中的过继免疫治疗提供实验依据。方法通过向健康人及骨肉瘤患者各10名男性的外周血单核细胞（PBMC）中加入IL-2、IFN-γ、IL-1及抗CD3McAb,诱导出CIK细胞,用光镜、倒置显微镜观察细胞形态,细胞记数板法计数细胞,四甲基偶氮哇盐（MAW）法检测收获细胞对相应骨肉瘤细胞的细胞毒作用。结果二组均能成功诱导出CIK细胞,其中健康人组体外增殖能力、细胞毒作用均优于骨肉瘤患者组,各组CIK细胞随效靶浓度比的递增其杀瘤活性相应增加（P〈0．05）,二组CIK细胞对骨肉瘤细胞48h杀伤率明显高于24h（P〈0．05）。结论CIK细胞的体外增殖力及对骨肉瘤细胞的杀伤活性与机体状态有关,CIK细胞对骨肉瘤细胞杀伤活性存在量效及时效关系。     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HepG2细胞杀伤作用的实验研究

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对肝癌细胞体外杀伤作用.方法:以pGL3-hT-ERT/tk为基础,构建pGL3-hTERT/lue、pGL3-basie/tk、pGL3-control/tk等真核表达载体,分别将其用脂质体法转染HepG2肝癌细胞和正常肝细胞L02,荧光显微镜观察转染效果,给予前药GCV,用原位末端标记(TUNEL)法、流式细胞仪检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用,Western blot检测细胞周期素Cyclin D1、CDK2、p21蛋白表达.结果:hTERT启动子调控的HSV-tk/GCV系统对肝癌细胞有明显的杀伤作用,使41.85%的细胞凋亡;而对正常细胞作用不明显,Western也显示Cyclin D1、CDK2蛋白表达下降而p21升高.结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副反应等问题.     

缺氧/辐射双敏感性启动子调控HSV-TK表达对肺癌移植瘤的作用

背景与目的放射-基因治疗是近年来国际上肿瘤治疗的新策略,由于实体瘤常处于缺氧状态而对放射敏感性低,放射-基因治疗尚未达理想疗效。本研究拟构建缺氧/辐射双敏感性启动子,增强缺氧条件下放射诱导的HSV-TK表达水平,提高肺癌放射-基因治疗效果。方法利用基因重组构建HRE-Egr启动子及其调控的HSV-TK表达载体;脂质体介导重组质粒转染肺癌A549细胞,分为对照组、放射组(6Gy)、缺氧组(1%氧浓度)和放射合并缺氧组,Northernblot法检测转染细胞中HSV-TK表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测放射、缺氧和GCV处理后的细胞存活率。建立BALB/c裸鼠肺癌移植瘤模型,检测放射合并质粒转染后移植瘤体积变化并计算抑瘤率。结果对照组细胞仅可检测到HyTK的低水平表达(21U),放射组和缺氧组HyTK基因表达水平均显著升高(分别为227U和94U),放射合并缺氧组(769U)显著高于放射组。在缺氧条件下,放射合并GCV处理后细胞存活率为(7.2±1.8)%,显著低于常氧组的(32.7±4.6)%。放射联合GCV可明显抑制HRE-Egr启动子转染肺癌移植瘤,抑瘤率达91.2%。结论HRE-Egr启动子具有辐射/缺氧双重敏感性,并使放射后的HSV-TK表达水平在缺氧下得到显著增强。放射联合HRE-Egr启动子可显著抑制肺癌移植瘤的生长。     

尼莫地平增强HyTK/ACV自杀基因对脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 :探讨尼莫地平增强阿昔洛韦 (ACV)介导的转HyTK基因治疗诱导脑胶质瘤细胞的死亡方式及旁观者效应机制。方法 :构建含HyTK基因的逆转录病毒载体LNSHyTK ,并转染人脑胶质瘤BT32 5和SCW细胞。单用ACV和联合尼莫地平应用体外试验观察对BT32 5 tk和SCW tk的杀伤效果。同时应用转基因前和转基因后瘤细胞共培养观察其旁观者效应。结果 :低浓度尼莫地平联合ACV作用下转tk基因细胞的凋亡率明显高于单独使用ACV ,并明显提高旁观者效应。结论 :尼莫地平能增强HyTK ACV自杀基因对脑胶质瘤细胞的杀伤作用 ,为钙拮抗剂应用于转tk基因治疗提供了实验依据。     

健康人和骨肉瘤病人来源的LAK细胞体外抗瘤作用

采用５１Ｃｒ释放试验对健康人和骨肉瘤病人外周血单个核细胞（ＰＢＭ）在重组白细胞介素－２（ｒＩＬ－２）条件下，ＬＡＫ细胞的诱导形成及对４种传代瘤细胞的体外杀伤活性进行探讨。实验结果表明：２种来源ＬＡＫ细胞对Ｋ５６２（人慢性髓样红白血病细胞系）、ＳＭＭＣ７７２１（人肝癌细胞系）、ＬＡＸ（人肺腺癌细胞系）的杀伤活性均在５５％以上（按效靶比例５０：１），而对ＯＳ细胞（人骨肉瘤细胞系）的活性普遍低下，杀伤率低于３５％。结果证实：１）健康人和骨肉瘤病人的ＰＢＭ均能在ｒＩＬ－２条件下诱导形成具有广谱抗瘤活性的ＬＡＫ细胞群，二者的杀伤格局和效力相近。２）骨肉瘤细胞本身对ＬＡＫ细胞的杀伤作用存在强烈抗性。     

白花丹素对骨肉瘤细胞系U2OS的作用及其机制

目的研究白花丹素对骨肉瘤细胞系U2OS的作用,并初步探讨其作用机制。方法用CCK-8法检测白花丹素对骨肉瘤细胞的促凋亡作用;用HOECHST 33342染色研究白花丹素对骨肉瘤细胞作用后的形态学变化;用Western blot法检测白花丹素作用后骨肉瘤细胞MDM2和p53蛋白表达情况。结果CCK-8结果显示白花丹素对骨肉瘤细胞有明显的抑制作用,而且呈浓度依赖性;HOECHST 33342染色结果显示白花丹素对骨肉瘤U2OS 细胞的抑制作用主要是通过促进凋亡来实现;Western blot结果显示白花丹素能够改变p53/MDM2基因表达比例。结论白花丹素通过细胞凋亡途径抑制骨肉瘤细胞系U2OS细胞的生长。     

RV/HSV_1-tk/GCV基因治疗系统对卵巢癌细胞体外作用

［目的］观察逆转录病毒载体／单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因／羟甲基无环鸟苷（ＲＶ／ＨＳＶ１－ｔｋ／ＧＣＶ）基因治疗系统对卵巢癌细胞的体外作用及其“旁观者效应”,并探索提高携有ＨＳＶ１－ｔｋ基因的假型逆转录病毒对卵巢癌细胞的感染率的有效途径。［方法］①以ＶＰＣ／ＨＳＶ１－ｔｋｃ细胞培养液的滤过液重复多次感染Ａ０细胞,然后一组以Ｇ４１８筛选阳性克隆,另一组以ＧＣＶ作杀伤试验。②按不同比例分别将ＡＯ／ＨＳＶ１－ｔｋｃ及ＶＰＣ／ＨＳＶ１－ｔｋｃ与ＡＯ细胞混合培养后加入ＧＣＶ, ５天后消化计数。［结果］①随着ＲＶ感染次数增多,所获得的Ｇ４１８筛选阳性克隆数也明显增多,同时,ＧＣＶ对ＡＯ细胞的杀伤效应也有所提高。②在 ＡＯ细胞群体中如 ＨＳＶ１－ｔｋｃ阳性细胞占 ８０％,则 ＧＣＶ对细胞群体的抑制率可达９５．２％。③当 ＡＯ与 ＶＰＣ／ＨＳＶ１－ｔｋｃ以１：４混合培养时, ＧＣＶ对细胞的生长抑制率为９６．６２％。［结论］ ＧＣＶ杀伤ＡＯ／ＨＳＶ１－ｔｋｃ细胞时对ＡＯ细胞具有一定的“旁观者效应”;重复ＲＶ感染及与ＶＰＣ／ＨＳＶ１－ｔｈｃ细胞混合培养可以明显提高ＲＶ／ＨＳＶ１－ｔｋｃ／ＧＣＶ系统对卵巢癌细胞的作用效果。     

微小RNA-101对人骨肉瘤细胞自噬和侵袭性的影响

目的 探讨微小RNA-101（microRNA-101,miR-101）的表达对人骨肉瘤细胞自噬和侵袭性的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测骨肉瘤组织和人骨肉瘤细胞系MG-63细胞以及成骨细胞miR-101的相对表达,蛋白免疫印迹(Western blot)检测两种细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3B的表达;经脂质体转染将miR-101模拟物和miR-101阴性对照转染MG-63细胞,并设立空白对照,通过qRT-PCR、Western blot和侵袭实验（Transwell）检测以上三组细胞miR-101的表达、Beclin1和LC3B的表达以及三组细胞侵袭能力的变化。结果 与癌旁骨组织和正常骨组织或成骨细胞相比,miR-101在骨肉瘤组织和MG-63细胞中表达明显下降（P<0.01）;模拟物转染组miR-101的表达较空白对照组上调了255%,但该组自噬相关蛋白的表达较空白组却显著降低（P<0.01）;Transwell侵袭实验显示,模拟物转染组细胞迁移数目较阴性对照组和空白对照组分别减少了60%和67.67%（P<0.01）。结论 miR-101在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞中呈现低表达,可能与骨肉瘤的发生发展相关。miR-101抑制骨肉瘤细胞侵袭,其机制可能是通过抑制细胞自噬而发挥作用。     

蛋白酶体抑制剂联合TRAIL杀伤骨肉瘤细胞的研究

目的观察蛋白酶体抑制剂与肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)对骨肉瘤细胞株MG-63的杀伤作用。方法骨肉瘤细胞株MG-63分别经蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO和(或)TRAIL作用24h,采用MTT法检测细胞毒性作用,流式细胞仪定量分析凋亡细胞所占比例,并镜下观察细胞形态学改变。结果0.5μmol/L的Z-LLL-CHO与500ng/ml的TRAIL合用于MG-63细胞24h后,细胞存活率为61.6%±1.3%,明显高于单用Z-LLL-CHO(0.5μmol/L)时的96.6%±0.2%及单用TRAIL(500ng/ml)时的89.5%±0.7%(P<0.01)。流式细胞术、电镜及荧光显微镜观察证实,协同性杀伤作用主要通过诱导细胞凋亡实现。结论蛋白酶体抑制剂能增强TRAIL杀伤骨肉瘤细胞和诱导骨肉瘤细胞的凋亡。     

LPS对骨肉瘤细胞迁移、侵袭及TLR4/HOTAIR通路的影响

目的探讨脂多糖(LPS)对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响及其潜在的作用机制。方法将人MG-63骨肉瘤细胞随机分为2组:对照组和LPS组。LPS组细胞用10 g/ml的LPS干预24 h,对照组用生理盐水干预。ELISA检测干预后培养基中促炎因子的水平,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western Blot检测相关蛋白的表达。结果与对照组相比,LPS组培养基中促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6的释放水平均显著增高(P<0.05),LPS组迁移细胞数和侵袭细胞数均显著增高(P<0.05),LPS组中E-cadherin的表达显著降低(P<0.05),而N-cadherin、α-SMA、波形蛋白、TLR4和HOTAIR的表达均显著增高(P<0.05)。结论LPS诱导的肿瘤微环境可促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,其机制与TLR4/HOTAIR途径介导的EMT过程的发生有密切关系。     

新城疫病毒对癌细胞的杀伤作用

 目的　探讨新城疫病毒NDV对癌细胞的直接杀伤作用。方法　将NDV与各组细胞的混悬液一起加入细胞培养板中三孔法,同时设不加NDV的对照孔,经8、16、24、36和48小时五个时相观测细胞生长情况和病毒复制情况。结果　成纤维细胞和对照组细胞生长良好,而实验孔的各组癌细胞逐渐减少,出现融合、裂解。48小时癌细胞组的上清液病毒效价较高而成纤维细胞的上清液病毒效价为0。结论　NDV对癌细胞有较强的亲和力,可在癌细胞内大量复制,具有直接杀伤癌细胞的作用,而对正常细胞无明显的杀伤作用。     

Zometa对骨肉瘤细胞中MMP-9、TIMP-1及COX-2表达的影响

目的 探讨唑来膦酸(Zometa)对骨肉瘤细胞中MMP-9、TIMP-1及COX-2表达情况的影响.方法 应用细胞增殖实验、细胞凋亡实验、细胞迁移和侵袭实验,研究Zometa对骨肉瘤细胞U2OS的影响;应用WB和qRT-PCR,研究Zometa对骨肉瘤细胞内COX-2、MMP-9和TIMP1蛋白和mRNA表达的影响.结果 Zometa抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进骨肉瘤细胞凋亡,且这些影响都存在剂量依赖性;经不同浓度Zometa处理后,骨肉瘤细胞内COX-2、MMP-9 蛋白和mRNA表达水平随浓度的增加而逐渐降低,TIMP-1 蛋白mRNA表达水平随浓度的增加而逐渐升高,且都存在剂量依赖性.结论 Zometa通过调节COX-2、MMP-9和TIMP1在细胞内的表达来影响骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,可作为治疗恶性骨肿瘤的药物,且对患者预后情况的改善有一定的价值.     

异体树突状细胞融合瘤苗抗骨肉瘤的免疫效应实验

目的探讨大鼠异体树突状细胞融合瘤苗诱导的抗骨肉瘤免疫学效应。方法采用Wistar大鼠骨髓来源的DCs与SD大鼠来源的骨肉瘤细胞UMR106通过电穿孔的方法进行融合。经分离纯化后,分别与SD、Wistar大鼠骨髓来源的T淋巴细胞作共同培养,刺激其增殖。采用流式细胞仪对其CD8+,CD4+细胞比例进行检测。MTT法测定细胞毒T淋巴杀瘤活性。结果T淋巴细胞和异体融合瘤苗经过共同培养,T细胞得以显著增殖。异体瘤苗诱导的UMR106特异性CTLs杀瘤效果显著,该效应是由MHC-Ⅰ限制的CD8+细胞发挥作用。结论异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗具有显著的刺激T淋巴细胞增殖和诱导特异性CTLs的潜能,为以树突状细胞为基础的免疫治疗领域提供了新的策略,有望在临床骨肉瘤患者中获得广阔的应用前景。