人精子超低温冻贮技术的研究(二)——不同的冷平衡、复温方法和冻贮时间对精子存活率的影响

材料和方法基本材料和方法同研究(一),各项实验不同之处在结果栏中注明。实验结果一、四种不同的冷平衡方法对精子存活率的影响实验用11份精液标本,保护剂配方同研究(一)所述。安瓿法冻贮。每份精液液化后等分为四份,按保护剂添加方法不同,实验分为四组,甲组:对照组,实验方法同研究(一)。乙组:于甲组添加保护剂的同时,先将液化的精液分装入安瓿内1ml,用1ml 注射器取等量保护剂,连同精液安瓿同时放     

T-G型CPM及速缓冻贮法对人精子的影响

Ｔ Ｇ型冷冻保护剂 (ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ ,ＣＰＭ )是一种新型无卵黄复合型ＣＰＭ ,我们采用Ｔ Ｇ型ＣＰＭ ,以速缓冻法冻贮 45份人精液近 1年 ,探讨Ｔ Ｇ型ＣＰＭ及其保护下速缓冻法对人精子结构和功能的影响。材料与方法　已育健康男子精液45份。 10份精液不加ＣＰＭ ,35份加Ｔ Ｇ型ＣＰＭ ,均以速缓冻法分别进行冻贮。每份精液冷冻前后行精液常规对比分析、精尾低渗肿胀试验、精子穿卵试验、精子染色体分析及精子超微结构观察。缓冻法ＣＰＭ 4℃预冷 ,与精液 1∶1混匀 ,4℃ 2 0ｍｉｎ后 ,置液氮蒸气距液面2ｃ…     

精子冻存技术及上游法精子处理技术对精子DNA完整性的影响

目的通过对冷冻前后及精子处理前后精子DNA完整性的比较,探讨冷冻技术、冷冻时间及上游法精子处理技术对精子DNA完整性的影响。方法（1）精液常规检测正常的患者30例,手淫法取精,精液液化混匀后分4份,分别用于精子染色质扩散（SCD）实验检测精子DNA完整性、上游法处理精液、以及两组冻存实验（不加保护剂直接冻存的为冻存1组;添加蛋黄葡萄糖保护剂冻存的为冻存2组）;（2）上游法处理后的精液一部分用于检测精子动力和形态,一部分用于精子DNA完整性检测;（3）冻存1组分别于冻存第7天和第90天解冻,SCD实验检测精子DNA完整性;（4）冻存2组分别于第7天和第90天解冻,0．1ml用于精子DNA完整性检测,剩余精液应用上游法处理,检测上游处理前后精子DNA的完整性。结果（1）冻存1组中,冻存90d后解冻的精子DNA损伤率[（25．6土7．3）％]显著高于冻存7d者[（22．4±7．4）％]（P〈0．05）,且均显著高于新鲜精液的精子DNA损伤率[（20．6±7．3）％]（P〈O．05）;冻存2组中,冻存90d后精子DNA损伤率显著高于冻存7d者[（25．9±7．2）％VS．（23．6土7．8）％]（P〈O．05）,且均显著高于新鲜精液（P〈0．05）;而冻存7d和90d后,两个冻存组间比较,精子DNA损伤率均无显著差异（P〉0．05）。（2）新鲜精液经上游法处理后,精子DNA损伤率由处理前的（20．6±7．3）％降为（6．4±2．5）％（P〈O．05）;冻存2组中精液冻存7d和90d后复苏上游法处理后,精子DNA损伤率较未经上游法处理者均显著降低[分别为（9．38±2．8）％VS．（23．6±7．8）％和（9．7±2．6）％VS．（25．9±7．2）％]（P％0．05）。结论冻存对精子DNA有损伤,冻存时间对于精子DNA完整性有影响。不添加保护剂直接冻存和添加保护剂对精子DNA完整性的影响无显著差异。不论是新鲜精液还是冻存复苏精液,上游法处理并不会增加精子DNA的损伤,且有利于筛选出具有更好DNA完整性的精子。     

含雌激素的冷冻保护剂对少弱精子玻璃化冻存效果的研究

目的 比较添加雌激素的冷冻保护剂对少弱精子的冻存效果.方法 将40例少弱精子患者的精液标本分别采用甘油、甘油-卵黄-柠檬酸钠（GYC）、甘油＋雌激素（甘油＋ E2）、甘油-卵黄-柠檬酸钠＋雌激素（GYC＋ E2）四种冷冻保护剂（CPM）冷冻,比较冻融前后精子活率、活力（a＋b级）、正常精子形态百分率、精尾低渗肿胀率（HOSR）.结果 四种CPM对少弱精子的冷冻效果存在差别,精子活率、活力、正常形态百分率、精子尾部低渗肿胀率在冻后都有不同程度下降（P〈0.05）,但甘油＋E2、GYC＋ E2 能显著提高冻存后精子的活率及活力（a＋b级）.结论玻璃化冻存对精子存在损伤,含雌激素的冷冻保护剂可以提高低质量精液的冻存效果.     

冻储时间对冷冻精子复苏率的影响

目的 :探讨冻储时间对冷冻精子复苏率的影响 ,以期找到最佳复苏时间。　方法 :取 88份正常供精者标本进行精液常规分析 ,精液用程序降温仪通过三步降温法冻存后置 - 196℃液氮中冻储 ,88份冻存标本随机分成 5组 ,分别于冻存后的 1d(Ⅰ组 ,n =14 )、7d(Ⅱ组 ,n =2 4 )、30d(Ⅲ组 ,n =19)、180d(Ⅳ组 ,n =18)、30 0d(Ⅴ组 ,n =12 )取出 ,37℃水浴复苏 ,再次进行精液常规分析。计算冷冻复苏率。　结果 :5组间的复苏率差异均无显著性 (P均 >0 .0 5 ) ,冻储时间与复苏率之间无相关性 (r=- 0 .0 5 ,P >0 .0 5 )。　结论 :程序降温仪冻存精液标本置 - 196℃液氮后 2 4h即可复苏分析 ,便于人类精子库耐冻实验批量筛查     

深低温冷冻保存气管的实验研究

二甲基亚砜或合用二甲基亚砜和蔗糖是目前常用的冷冻保护剂 ,也是最常用于气管冻储的冷冻保护剂[1] 。海藻糖是近年来发现并开始应用的一种非穿透性冷冻保护剂。我们将二甲基亚砜和海藻糖合用作为气管的冷冻保护剂 ,探讨其是否优于其他冷冻保护剂。一、方法1.材料 :冷冻保护液浓度见表 1;实验分组 :将新鲜犬气管碎片分为实验组和对照组。实验组按冷冻保护剂不同又分为Ａ、Ｂ和Ｃ 3小组 ,每小组 6 4块碎片(表 1)。以新鲜未冷冻 32块碎片作为对照组。2 气管标本的冻存和复温 :实验组标本盛放于装有冷冻保护液的液氮保存管中 ,先于 4℃冰箱中…     

浙江省人类精子库供精者精液参数及精子耐冻性变化分析

目的 了解供精者捐精过程中精液参数、精子耐冻性变化以及为人类精子库实验室质量控制提供部分依据;方法 13261份精液样本均来自2006年9月至2010年12月浙江省人类精子库的1513例合格的供精者,年龄20～42周岁,职业以学生为主,对所有精液标本进行精液常规分析;达到冷冻标准的精液标本进行冷冻及冷冻复苏后精液常规分析.结果 1513例供精者中,每次捐精均合格的为343例,占22.7%;每次捐精(至少连续3次)均不合格的为68例,占4.5%;捐赠精液至少一次不合格的为1102例,占72.8%.捐赠的13261份精液中,有10158份冷冻复苏后达到外供标准,占76.6%;不合格的捐赠精液为3103份,占23.4%,其中,未达到冷冻标准的为1565份,占所有捐赠精液的11.8%;冷冻复苏后未达到外供标准(不耐冻精液)为1538份,占所有捐赠精液的11.6%.结论 人类精子库供精者每次捐赠的精液不仅精液参数变化较大,其耐冻性变化也很大;所捐赠的精液不合格比例较高.     

含甘油冷冻保护液和冷冻复苏过程对人精子运动状态的影响

目的: 观察添加含甘油冷冻保护剂和冷冻复苏过程对精子运动能力的影响。　方法: 采用计算机辅助的精液分析技术对 18份人精液的精子运动状态进行检测,对比分析加入含甘油冷冻保护剂前后与冷冻复苏后的结果。　结果: 加入高渗透压的冷冻保护剂后,精液中快速直线运动精子的比例增加(P<0. 05),同时精子运动曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)和平均路径速度(VAP)值均增加(P均 <0. 005),但前向运动精子和精子活率并无改变;冷冻前和复苏后比较,精子的各项运动速度和各级运动精子的比例均明显下降 (P均≤0. 01),精子头侧摆幅度(ALH)减小,摆动性(WOB)、直线性(LIN)、以及前向性 (STR)差异均无显著性 (P>0. 05)。复苏后精子运动模式特征的差异仅表现在与处理前相比较时。　结论: 在添加甘油的高渗透压的冷冻保护剂后,精子的运动速度更快,a级精子增多。冻融过程的损伤削弱精子的运动能力甚至使部分精子丧失运动能力导致精子活率全面下降。不同的冷冻复苏环节对精子运动的影响有所不同。     

冷冻保护剂与精液比例对冷冻复苏后精子活动力的影响

目的:比较冷冻保护剂与精浆的不同比例对人类精子冷冻复苏后活动力的影响。方法:将57例志愿者的精液标本分别采用冷冻保护剂∶精液=1∶1和冷冻保护剂∶精液=1∶3的体积比进行冷冻,比较精子复苏后的前向活动率和总活动率。结果:冷冻前的前向运动精子百分率和总活动率分别为(58.60±5.57)%和(66.17±5.24)%。采用冷冻保护剂∶精液=1∶1比例进行冷冻复苏后的前向运动精子百分率和总活动率分别为(40.53±8.97)%和(51.23±9.30)%;采用冷冻保护剂∶精液=1∶3比例进行冷冻复苏后的前向运动精子百分率和总活动率分别为(44.70±8.67)%和(51.50±7.40)%。冷冻前后精子的前向运动百分率和总活动率差异有显著性(P<0.05)。两种不同比例的保护剂相比冷冻后前向运动精子百分率差异有显著性(P<0.05),而总活动率差异没有统计学意义。结论:冷冻对精子活动力损伤明显,冷冻保护剂∶精液=1∶3比例较冷冻保护剂∶精液=1∶1比例可提高冷冻后前向运动精子百分率。     

冷冻复温后低温保护剂和精子激活剂对精子功能影响的研究

本文对冷冻复温后精子的功能进行了研究观察，发现精液保护剂（甘油－卵黄－枸橼酸钠）对冷冻复温后精子的存活有明显的保护作用，而单纯应用卵黄或甘油溶液却对精子功能存在不利的影响。体外处理精子时应用ＡＴＰ、肌苷对精子的功能无任何的改善。两种浓度的苯甲酸钠咖啡因（１２ｍＭ和４ｍＭ）对冷冻复温后精子在不同时间内的存活和ＣＭ穿透力均有明显的提高作用     

人精子超低温冻贮技术的研究(一)——不同的冻贮方法、冷平衡时间对精子存活率的影响

关于精液冻贮技术虽国外已做了大量的研究,但一些研究结果不无矛盾。为了寻找适合我国使用的简便、有效的精液冻贮方法,我库从1984年12月开始,以液氮为致冷源,用自行研制的精液冷冻设备,对人精子超低温冻贮技术进行了一系列比较性研究。从1985年2月至1986年2月,共做冻精人工授精118例,181周期。确知怀孕和已生育者33例,周期成功率为18.23%(另文报道)。现将精子冻贮技术的实验研究结果报道如下。     

不同冻存方法对组织工程骨生物活性的影响

目的:了解不同冻存方法对组织工程骨生物活性的影响.方法:以骨髓基质干细胞(marrow stroaal cells,MSCs)复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨,实验分为A组:组织工程骨用添加冻存保护剂的保存液保存;B组:组织工程骨用不添加冻存保护剂的保存液保存;C组:组织工程骨未行低温保存;D组:单纯MSCs培养.A组和B组的组织工程骨于-196℃的液氮中冻存3个月,3个月后复温冻存的组织工程骨.用倒置相差显微镜和扫描电镜观察MSCs的粘附和分布情况、检测细胞活力和碱性磷酸酶(alkaline phosphata se,ALP)活性、流式细胞仪分析细胞周期.结果:MSCs在材料表面和孔隙内均可粘附和分布,粘附于材料的细胞活力大小依次为:C组＞A组＞B组(P＜0.01,P＜0.05),粘附于材料的细胞ALP活性大小依次为:C组＞A组＞B组(P＜0.01).各组细胞周期未见明显变化,未见异倍体细胞.结论:选择适宜的冻存保护剂对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用.     

复温方法及保护剂对人冷冻精液复温后精子存活率的影响

作者对冷冻精液的四种复温方法及两种保护剂分别进行了202例和194例次的对比观察。结果表明:冷冻的复温效果受复温方法影响.快复温比慢复温效果好,37℃水浴和48℃水浴复温效果明显优于室温(22℃)空气中和孵箱(37℃)内放置(P<0.001),并结合观察结果,对快速复温及效果良好的机制进行了讨论。甘油和甘油-卵黄-柠檬酸钠复合剂两种冻精复温后,精子存活率十分接近(P>0.05).表明两种保护剂对精子的保护效能大致相同.     

冷冻精子受精能力的综合评价

目的：观察不同冷冻期冷冻精子的受精能力。方法：应用精液常规分析（ＳＦＡ）、精子尾部低渗肿胀试验（ＨＯＳ）、去透明带地鼠卵穿透试验（ＨＯＰ）及冷冻精液人工授精（ＡＩＤ）对冷冻前后及不同冻存期的精液标本进行综合性检测。结果：１０份正常精液标本的冷冻精子活动率、ＨＯＳ值、ＨＯＰ值均明显低于冷冻前（Ｐ＜０．００１），而不同冻存期的精液行ＡＩＤ术后的总妊娠率与新鲜精液ＡＩＤ术的总妊娠率比较，则基本相同。结论：精子细胞膜虽在冷冻复温过程中受到一定的损伤，使精子活动率和受精能力下降。但是，精液的长期冻存及精子细胞膜部分改变并不完全影响精子的受精能力。     

捐精志愿者精液冷冻保存前后细菌培养的初步研究

目的:通过比较捐精志愿者精液冷冻保存前(冻前)和冷冻保存后(冻后)的细菌培养情况,分析导致精液冷冻过程中细菌污染的因素.方法:按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)用精子冻存液将精液样本按1∶1(v/v)的比例进行稀释.实验前对取精杯、精子冻存液和哥伦比亚血琼脂培养基进行细菌培养,均无菌生长.对3112例...     

冷冻精子受精能力的综合评价

目的：观察不同冷冻期冷冻精子的受精能力。方法：应用精液常规分析（ＳＦＡ）、精子尾部低涌肿胀试验（ＨＯＳ）、去透明带地鼠卵穿透试验（ＨＯＳ）及冷冻人工授精（ＡＩＤ）对冷冻前后及不同冻存期的精液标本进行综合性检测。结果：１０份正常精液标本的冷冻精子活动率，ＨＯＳ值，ＨＯＰ值均明显低于冷冻前（Ｐ〈０．００１），而不同冻存期的精液行ＡＩＤ术后的总妊娠率与新鲜精液ＡＩＤ术的总妊娠率比较，则基本相同。结论：精     

脂肪颗粒组织在不同冻存条件下低温保护剂的筛选

目的:寻求不同温度下脂肪组织冻存时的适宜低温保护剂。方法:在-16℃(普通家用冻箱)、-80℃(深低温冰箱)及-196℃(液氮)条件下,加入不同的低温保护剂,冷冻脂肪组织,24h后测定肌酸激酶活力,并与贮存前酶活力做比较。结果:液氮组以15%二甲基亚砜,6%丙二醇为低温保护剂时脂肪组织活力最高,达贮存前的76%,深低温冰箱组以15%二甲基亚砜组活力最高,达66%,而普通冰箱组最高也仅为46%。结论:低温保护剂能明显保持冷冻脂肪组织活力,不同冻存条件下其最适宜的低温保护剂各异。     

不同精浆浓度对精子冷冻复苏后活动能力的影响

为了评价冷冻保护剂中不同的精浆浓度是否影响精子冷冻复苏后的活动能力，作者对已育和不育男子的精液标本分别以含精浆浓度为０％，２５％，５０％，７５％和１００％的冷冻保护剂处理，并对复苏后精子的活动能力和存活时间进行比较。结果显示：健康组中含５０％和７５％精浆保护剂的解冻精子活动率显著高于其他组，不育组中７５％精浆保护剂高于其他组；结果提示：一定的精浆浓度对精子的冷冻复苏有帮助；对某些不育患者的异常精液作冷冻处理时，利用供者精浆置换原精液的精浆可能收到相对较好的复苏效果。     

甘油-卵黄-柠檬酸钠型冷冻保护剂未经冷冻对人精子运动学参数的影响

目的 研究甘油-卵黄-柠檬酸钠(glycerol-egg yolk-sodium citrate,GYC)型冷冻保护剂对人精子运动学参数的影响.方法 供精者精液标本183例,按照世界卫生组织推荐的方法和仪器行精液常规分析和计算机辅助精子分析(computer-aided sperm analysis,CASA);加入GYC型冷冻保护液后再次行CASA获得精子运动学参数.结果 加入GYC型冷冻保护剂后,供精者精子各项运动学参数与加入冷冻保护剂前的运动学参数均有显著的正相关(P<0.05);加入冷冻保护剂后,除BCF外,供精者精子各项参数的改变均有统计学意义(P<0.05).结论 GYC型冷冻保护剂对人精子的运动学参数有影响;人精子冷冻保护剂的配方仍需改良.     

冷冻前平衡处理对人精子冻融后相关参数的影响

目的:研究冻前平衡处理对冷冻精子复苏率的影响,优化一步熏蒸法,以寻找人类精子冷冻的最优方法。方法:使用50例自愿供精者的正常精液标本,同1例供精者的精液一式3份,分别采用不平衡直接冷冻法、室温平衡10 min后冷冻与4℃平衡10 min后冷冻的方法进行处理。复苏后用计算机辅助精液分析(CASA)系统分析3组标本冷冻前后精子运动参数的变化,并检测各组标本精子的畸形率和存活率。结果:4℃平衡组的前向运动精子复苏率[(61.88±16.94)%]显著高于未平衡组[(48.61±16.44)%]和室温平衡组[(49.41±13.77)%](P<0.05),而室温平衡组与未平衡组前向运动精子复苏率则无显著性差异。3组标本经冷冻复苏后其精子畸形率和存活率无显著性差异。结论:冻前4℃平衡10 min的冷冻前处理方法操作简单,实验条件易控,对提高精子复苏率有重要意义。