bFGF反义寡核苷酸对大鼠肺成纤维细胞增殖信号通路的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义寡核苷酸(AODN)对大鼠肺成纤维细胞增殖、转化信号通路的影响。方法:分离成年大鼠肺成纤维细胞,分为4组:对照组(未转染肺成纤维细胞);TGF-β1组(未转染肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+AODN组(转染AODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+RODN(正义寡核苷酸)组(转染RODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激)。每组设3复孔,并作细胞爬片,镜下计数肺成纤维细胞数量,绘制生长曲线。MTT比色法测定肺成纤维细胞增殖率。免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。通过ELISA法检测培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量。用RT-PCR法分析肺成纤维细胞Smad3 mRNA、Smad7 mRNA、Ⅰ型胶原mRNA表达水平。结果:1细胞计数显示:TGF-β1+RODN组各时段成纤维细胞的数目均较对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组明显增多(P<0.05);TGF-β1+AODN组中成纤维细胞增殖数比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。2MTT结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞光密度值明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞光密度值明显比TGF-β1组减低(P<0.05)。3免疫细胞化学染色结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞与对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组比较,α-SMA染色的平均光密度值(IOD)明显增加(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞α-SMA染色的平均光密度值(IOD)比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。4 ELISA法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。5RT-PCR法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显比TGF-β1组明显减低(P<0.05);TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad7mRNA表达明显低于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad7 mRNA表达比TGF-β1组明显增加(P<0.05)。结论:bFGF反义寡核苷酸可抑制肺成纤维细胞的增殖、转化及胶原合成,bFGF反义寡核苷酸可能通过下调TGF-β1-Smad信号通路来发挥作用。     

Notch1在TGF-β1诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中的作用

目的：研究转化生长因子β1（TGF-β1）诱导心肌成纤维细胞（CFs）向肌成纤维细胞（MFB）转分化过程中Notch1的变化情况,探讨在此转分化过程中Notch1的可能作用.方法：体外分离培养CFs,以10μg/LTGF-β1诱导CFs向MFB转分化.实验分为对照组,TGF-β1作用24,48,72h组,采用消化法测定羟脯氨酸（HYP）含量;免疫荧光、免疫印迹法测定α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达;实时定量PCR、免疫印迹法测定Notch1 mRNA及蛋白表达.利用γ分泌酶抑制剂DAPT（75μmol/L）阻断Notch1受体活化.实验分对照组,DAPT作用24,48,72h组,检测SMA及胶原的表达变化.结果：TGF-β1作用后,与对照组相比较α-SMA,HYP表达量随TGF-β1诱导时间的增加呈上升趋势,而Notch1则呈下降趋势,均以72h最显著（P〈0.01）;加入DAPT后,与对照组相比较α-SMA,HYP表达量随DAPT作用时间增加呈上升趋势,以72h最显著（P〈0.01）.结论：TGF-β1可以诱导CFs向MFB转分化,Notch1在此过程中的表达呈下降趋势,而DAPT阻断Notch1活化后可以促进CFs向MFB转分化.     

青蒿琥酯对转化生长因子-β1诱导的原代肺成纤维细胞分化中Notch1信号通路的影响

目的 探讨青蒿琥酯在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的原代肺成纤维细胞分化过程中的作用及其可能机制.方法 采用酶消化法及组织贴块法提取原代肺成纤维细胞,免疫荧光检测Vimentin的表达鉴定细胞;CCK法检测青蒿琥酯半数抑制浓度(IC50),根据IC50选择药物干预浓度.无血清同步化培养细胞分为4组:对照组(无血清培养基);TGF-β1诱导组(TGF-β15 ng/mL);青蒿琥酯干预组(TGF-β1 5 ng/mL+青蒿琥酯8μg/mL);青蒿琥酯对照组(青蒿琥酯8μg/mL).培养24 h后,Masson染色检测细胞及胶原分泌情况,Western blot 检测各组Notch1、Jagged1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况.结果 青蒿琥酯作用于TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞24 h的IC50为8.56μg/mL;Masson染色示TGF-β1诱导组胶原的表达明显高于对照组,而青蒿琥酯干预组胶原的表达较TGF-β1诱导组明显减少.在TGF-β1诱导组,与对照组比较,Notch1、Jagged1、α-SMA的表达明显升高(P＜0.05);青蒿琥酯干预组Notch1、Jagged1、α-SMA表达较TGF-β1诱导组均明显减少(P＜0.05).结论 青蒿琥酯能抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞分化过程,其机制可能为抑制Notch信号的表达.     

Ac\|SDKP调节Rac1信号抑制皮肤肌成纤维细胞的转化和迁移

目的 研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)通过阻断小G蛋白Ras相关的C3肉毒素底物(Rac1)信号,抑制转化生长因子β1(TGF-β1)介导的皮肤肌成纤维细胞转化的机制。 方法 原代培养大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞,分为空白对照组、TGF-β1诱导组及Ac-SDKP预处理组。划痕实验检测细胞迁移能力,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Rac1蛋白的表达,Western-blot法检测α-SMA、血清应答因子(SRF)、心肌蛋白相关转录因子(MRTF-A)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)及Rac1蛋白的表达。 结果 细胞划痕实验显示,TGF-β1诱导组与空白对照组比较,细胞迁移至中央划痕区的距离明显增大,Ac-SDKP预处理组与TGF-β1诱导组比较,细胞迁移至中央划痕区的距离减小。免疫细胞化学法检测结果显示,TGF-β1诱导组α-SMA和Rac1的阳性表达较空白对照组增强,而Ac-SDKP预处理组可明显抑制α-SMA和Rac1的阳性表达。TGF-β1诱导组的α-SMA,SRF,MRTF-A,ColⅠ及Rac1蛋白表达均较空白对照组明显上调,Ac-SDKP预处理组的蛋白表达较TGF-β1诱导组下降(P<0.05)。 结论 Ac-SDKP能够阻断Rac1信号,抑制TGF-β1介导的皮肤成纤维细胞迁移能力的提高和肌成纤维细胞转化。     

Notch1在肌成纤维细胞转化中的作用及表达变化

目的  探讨在成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中,Notch1表达的变化规律,以及γ-分泌酶抑制剂（DAPT）抑制Notch信号后,对细胞转化的影响。方法  取新出生2～3 d SD大鼠的肺组织,用胰酶消化法分离肺成纤维细胞,再将培养至第3代的细胞分为3组：对照组、转化生长因子-β1（TGF-β1）组、TGF-β1+ DAPT组。对照组为空白对照,TGF-β1组加入5ng/ml TGF-β1,TGF-β1+DAPT组同时加入5 ng/ml TGF-β1及5μmol/L DAPT。采用免疫细胞化学法对α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达变化进行检测。同时通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测Notch1 mRNA和蛋白的表达变化。结果  α- SMA免疫细胞化学结果表明,对照组大部分细胞无染色,而TGF-β1组则可见大部分细胞内有黄色和棕黄色颗粒及条纹,DAPT组和对照组无明显差异。对照组、TGF-β1组、TGF-β1+DAPT组Notch1 mRNA表达量分别为（0.278±0.022）、（0.783±0.018）和（0.313±0.029）,对照组与TGF-β1组、TGF-β1组与TGF-β1+DAPT组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,对照组与TGF-β1+DAPT组比较差异无统计学意义（P >0.05）。对照组、TGF-β1组、TGF-β1+DAPT组Notch1蛋白表达量分别为（0.312±0.019）、（0.701±0.026）和（0.345±0.022）,组间比较结果同Notch1 mRNA。结论  Notch1可以促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,进而促进肺纤维化。

     

PDTC对TGF-β_1诱导的大鼠纤维化肺成纤维细胞转分化的影响

目的:通过核因子-κB(NF-κB)抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)探讨NF-κB对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞转分化的影响。方法:采用体外细胞培养,免疫细胞化学技术,流式细胞术等技术,检测PDTC对TGF-β1诱导的成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响。结果:TGF-β1诱导肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞(MF),表达α-SMA增强(P<0.05),PDTC抑制了TGF-β1的诱导作用(P<0.05),单独应用PDTC对肺成纤维细胞转分化无影响。结论:NF-κB促进TGF-β1诱导肺纤维化模型中肺成纤维细胞转分化成MF。     

Meprinα对TGF-β1诱导的成纤维细胞胶原合成的调节作用

目的观察Meprinα对转化生长因子(TGF)-β1介导的成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞分化的调节作用。方法原代培养肺成纤维细胞,采用TGF-β1诱导,并予以重组Meprinα及放线酰胺素(Actinonin)预处理。免疫细胞化学染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,免疫印迹法检测Meprinα、I型胶原、α-SMA的表达。结果 TGF-β1能够促进肺成纤维增殖和迁移能力,显著上调I型胶原、α-SMA的表达,同时降低Meprinα的表达(P<0.05)。免疫印迹结果显示,予以Meprinα预处理能够显著抑制TGF-β1介导的I型胶原、α-SMA表达的上调(P<0.05);予以Actinonin预处理,则能够显著促进TGF-β1介导的I型胶原、α-SMA表达的上调(P<0.05)。结论 Meprinα具有抑制TGF-β1介导的肺成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞分化的作用。     

TGF-β1通过上调Shh 信号诱导大鼠脑膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转化

目的 探讨TGF-β1在诱导脑膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞中对Shh信号的影响。方法 新生24 h SD大鼠脑膜原代成纤维细胞经Ⅳ型胶原酶提取纯化。原代脑膜成纤维细胞随机分为3个组：分别为空白对照组、10 ng/mL TGF-β1处理组（TGF-β1组）、10 ng/mL TGF-β1联合20 μmol/L TGF-β1受体抑制剂SB-431542组(TGF-β1+SB组)。各组细胞在药物处理前均用无血清培养基培养24 h后换用加入了药物的DMEM/F12完全培养基处理72 h。采用CCK-8法检测各实验组成纤维细胞的增殖能力;细胞划痕实验检测各实验组成纤维细胞的迁移能力;免疫荧光法检测各实验组纤维连接蛋白（Fn）的表达;Western blotting检测各实验组Fn、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Shh蛋白的表达;q-PCR检测各实验组细胞Shh mRNA的表达。结果 TGF-β1可促进原代脑膜成纤维细胞的增殖（P<0.05）;TGF-β1可促进原代脑膜成纤维细胞的迁移（P<0.05）。TGF-β1可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化并增加Fn的分泌（P<0.05）。TGF-β1处理后可上调Shh蛋白和mRNA的表达（P<0.05）,TGF-β1受体抑制剂SB-431542则可抑制TGF-β1引起的原代脑膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化并减少纤维连接蛋白的分泌（P<0.05）。结论 TGF-β1可通过上调Sonic Hedgehog信号通路中Shh蛋白的表达,诱导脑膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。     

基于Notch信号筛选调控心肌纤维化的miRNA

目的筛选调控心肌纤维化的Notch信号相关miRNA。方法分离和培养SD大鼠原代心脏成纤维细胞(CFs),采用转化生长因子-β1(TGF-β1)建立心肌纤维化模型,γ-分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitor,DAPT)抑制Notch信号通路,miRNAs快速检测试剂盒检测miRNA的表达,筛选处理前后差异表达的miRNA。miR-21、miR-23b、miR-140反向序列抑制剂抑制部分差异表达的miRNA,利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测CFs增殖,实时荧光定量PCR检测波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达。结果通过抑制Notch信号通路筛选出14个可能调控心肌纤维化的Notch信号相关miRNA,其中上调2个,下调12个。miR-21、miR-23b抑制剂可明显抑制CFs增殖(P<0.05),提高Vimentin表达(RQ=2.52、1.86,均P<0.001),降低α-SMA表达(RQ=0.50、0.74,均P<0.001)。结论 miR-21和miR-23b能够特异性促进心肌纤维化。     

肝细胞生长因子对转化生长因子诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化的影响

目的:研究肝细胞生长因子(HGF)对转化生长因子β1(TGFβ-1)诱导肺泡上皮细胞转分化的影响。方法:应用TGF-β1诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化。将人肺腺癌A549细胞株培养液分为4组:①对照组;②HGF组;③TGFβ-1组;④HGF+TGFβ-1组,应用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肺泡上皮细胞特异性标志物肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的表达。结果:①TGF-β1组肺泡上皮细胞从原来典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞样形态。②TGF-β1组的细胞α-SMA的表达明显增加,SP-A的表达明显减低。③HGF组的细胞形态学、α-SMA、SP-A的表达与对照组无明显差异。④HGF+TGFβ-1组,多数细胞保持原来肺泡上皮细胞的形态,α-SMA表达明显低于TGFβ-1组、SP-A表达明显高于TGFβ-1组。结论:HGF能够在一定程度上负性调控TGFβ-1诱导的肺泡上皮细胞的转分化。     

麦冬多糖抑制TGF-β1诱导的人胚胎肺成纤维细胞表型的转化

研究麦冬多糖对转化生长因子-β₁(TGF-β₁)诱导的人胚胎肺成纤维细胞表型转化的影响,并初步探讨其分子机制。方法 采用TGF-β₁诱导人胚胎肺成纤维细胞(HEL)转化,同时给予麦冬多糖进行干预;采用CCK-8检测细胞的增殖率,电镜观察细胞的超微结构,Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ 型胶原蛋白(COL I)、Smad2蛋白和p-Smad2蛋白的表达,实时荧光定量RT-PCR检测α-SMA mRNA和COL Ⅰ mRNA的表达。结果 25、50、100 μg.ml^-1浓度的麦冬多糖对HEL细胞均无明显毒性,并能抑制TGF-β₁诱导所致的成纤维细胞增殖(P＜0.05);与对照组相比,麦冬多糖干预组细胞表面微绒毛减少、微丝变短,胞浆内线粒体数目下降,粗面内质网减少; 同时下调α-SMA、COL I、Smad2、p-Smad2蛋白的表达量和α-SMA、COL I的mRNA表达水平(P＜0.05)。结论 麦冬多糖可能通过干预TGF-β/Smads信号通路,在一定程度上抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。     

肝X受体激动剂T0901317抑制TGF-β1诱导的人正常肺成纤维细胞α-SMA的表达

摘要：目的探讨肝X受体激动剂T0901317对TGF-β1诱导的人正常肺成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的影响。方法组织块贴壁法培养人正常肺成纤维细胞,波
形蛋白和角蛋白免疫细胞化学鉴定。T0901317和/或TGF-β1刺激人正常肺成纤维细胞后,分别应用RT-PCR,Western blot 和免疫荧光观察α-SMA mRNA和蛋白水平的表
达。结果人肺成纤维细胞表达波形蛋白而不表达角蛋白。RT-PCR,Western blot,免疫荧光结果均显示正常肺成纤维细胞基态下组成性表达少量的α-SMA,TGF-β1 5 ng/ml 即可以诱导α-SMA mRNA和蛋白表达的明显上调,而T0901317 5
μg/ml时可以明显抑制这种表达的上调。结论肝X受体激动剂T0901317可以在基因和蛋白水平抑制TGF-β1诱导的体外人正常肺成纤维细胞α-SMA表达的上调,可能具有潜在抗纤维化应用价值。     

Snail介导的肺上皮间质转化在肌成纤维细胞活化中的作用

目的 探讨核转录因子Snail介导的肺上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）在肌成纤维细胞活化中的作用。方法 培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞（MLE-12）并利用转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）刺激获得EMT模型,应用RT-qPCR检测上皮标志物E钙粘蛋白（E-cadherin,CDH1）、间质标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、核转录因子Snail mRNA表达变化。建立MLE-12与小鼠胚肺成纤维细胞（NIH-3T3）共培养体系,应用RT-qPCR检测NIH-3T3的α-SMA、Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ α1,COL1A1）、Ⅲ型胶原（collagen Ⅲ α1,COL3A1）mRNA表达。利用Snail-shRNA转染MLE-12,应用RT-qPCR、Western blotting检测Snail mRNA和蛋白质表达。建立慢病毒转染的MLE-12与NIH-3T3共培养体系,应用RT-qPCR检测NIH-3T3的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表达。采用单因素方差分析及最小显著差法判断结果差异是否具有统计学意义。结果 加入TGF-β1刺激48 h后,RT-qPCR结果显示,与对照组相比,TGF-β1组的CDH1 mRNA的表达下调、α-SMA和Snail mRNA的表达上调（P<0.05）;共培养体系中,RT-qPCR结果显示,与TGF-β1和MLE-12组相比,加入TGF-β1刺激的MLE-12引起下室NIH-3T3的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表达上调,且上调程度高于TGF-β1和MLE-12的单独作用（P<0.05）;慢病毒转染后,与阴性对照病毒组相比,Snail慢病毒干扰组Snail的mRNA和蛋白质表达均明显下调（P<0.05）;分别用阴性对照病毒和Snail慢病毒转染MLE-12后与NIH-3T3建立共培养体系,RT-qPCR结果显示,与TGF-β1+阴性对照病毒组相比,TGF-β1+Snail慢病毒转染组下室NIH-3T3的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表达上调程度降低（P<0.05）。结论 Snail介导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT可引起肌成纤维细胞活化,敲减Ⅱ型肺泡上皮细胞的Snail基因可抑制成纤维细胞活化为肌成纤维细胞。提示Snail介导的肺上皮间质转化在肌成纤维细胞活化中发挥重要作用。     

CRAMP对小鼠心脏成纤维细胞激活、增殖和胶原分泌功能的影响

目的:探讨CRAMP对小鼠心脏成纤维细胞激活、增殖和胶原分泌功能的影响。方法:分离培养小鼠心脏成纤维细胞。第一部分实验将细胞分为3组：对照组、转化生长因子β1(TGF-β1)组(10 mg/L 48 h)、CRAMP组(TGF-β1处理后给予CRAMP 0.5 mg/L 24 h),采用MTT法检测细胞增殖活性,采用免疫荧光染色检测α-SMA、Ⅲ型胶原和PCNA蛋白表达水平,采用RT-PCR检测Ⅲ型胶原和α-SMA mRNA表达水平,采用Western blot检测Smad信号通路蛋白表达水平。第二部分实验将细胞分为3组：TGF-β1组(10 mg/L 48 h)、SIS3组(TGF-β1处理后给予SIS3 10μmol/L 24 h)、CRAMP+SIS3组(TGF-β1处理后给予CRAMP 0.5 mg/L和SIS3 10μmol/L 24 h),采用免疫荧光染色和RT-PCR检测Ⅲ型胶原和α-SMA蛋白及mRNA表达水平。结果:TGF-β1组成纤维细胞增殖活性,PCNA、Ⅲ型胶原、α-SMA蛋白表达水平,Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA表达水平,p-Smad2、p-Smad3和Sm...     

羊栖菜多糖对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞的影响

目的 研究羊栖菜多糖对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞的影响,探讨其抗肺纤维化作用及机制。方法 将实验分成对照组、TGF-β1组、TGF-β1+不同剂量羊栖菜多糖组（25、50、100μg/ml）,采用MTT法检测细胞增殖,RT-PCR法检测Smad 3、Smad 7、α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA的表达,ELISA法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达, Western blot法检测α-SMA的表达。结果 TGF-β1能诱导肺成纤维细胞增殖及表达Smad3 mRNA、Smad7 mRNA、Ⅰ型胶原、α-SMA（P < 0.05）。羊栖菜多糖可以不同程度抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的增殖以及Smad3mRNA、Ⅰ型胶原和α-SMA的表达,且呈剂量依赖性（P < 0.05）,能促进TGF-β1诱导的肺成纤维细胞表达Smad7 mRNA, 呈剂量依赖性（P < 0.05）。结论 在离体细胞,羊栖菜多糖能抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖、分化与表达,其机制可能与其下调Smad3,促进Smad 7表达从而抑制TGF-β/Smads信号通路有关。     

CSD肽对肺成纤维细胞细胞外基质及Smad信号表达的影响

目的研究CSD肽（CSD-p）对转化生长因子β1（TGF-β1）刺激下人胚肺成纤维细胞的细胞外基质及Smad信号表达的影响。方法体外培养人胚肺成纤维细胞,分为4组：对照组（无TGF-β1处理）、TGF-β1处理组、CSD-p处理组、TGF-β1及CSD-p联合处理组。RT-PCR测定各组窖蛋白1mRNA的表达;Western blot检测各组窖蛋白1、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原Ⅰ、p-Smad2、p-Smad3及Smad7蛋白的表达。结果 TGF-β1刺激人胚肺成纤维细胞后,窖蛋白1的mRNA和蛋白表达较对照组明显降低（mRNA：0.404±0.027比1.540±0.262;蛋白：0.278±0.054比1.279±0.085;P〈0.01）。经TGF-β1刺激,人胚肺成纤维细胞的胶原Ⅰ（1.127±0.078比0.234±0.048）、α-SMA（1.028±0.058比0.295±0.024）,p-Smad2（1.162±0.049比0.277±0.014）、p-Smad3（1.135±0.057比0.261±0.046）蛋白表达增加（P〈0.01）;Smad7表达较对照组明显降低（0.379±0.004比1.249±0.046,P〈0.001）。与TGF-β1处理组比较,CSD肽明显抑制TGF-β1诱导的胶原Ⅰ（0.384±0.040）、α-SMA（0.471±0.071）、p-Smad2（0.618±0.096）、p-Smad3（0.461±0.057）蛋白表达;上调Smad7的蛋白表达（0.924±0.065比0.379±0.004）。结论 CSD肽下调TGF-β1刺激下人胚肺成纤维细胞的胶原Ⅰ及α-SMA蛋白的表达,可能通过抑制TGF-β1/Smads信号通路激活,提示使用CSD肽增加窖蛋白1功能可能对肺纤维化具有一定的干预作用。     

GSK3β/eEF2K信号通过调控自噬参与肺成纤维细胞诱导分化

目的 探讨糖原合成酶激酶3β(GSK3β)/真核延伸因子2激酶(eEF2K)在肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中的表达,以及对细胞自噬和纤维化的影响。方法 将L-929细胞(对照组)于适宜条件下培养48 h,加入5 ng/mL TGF-β1诱导其表型转化为肌成纤维细胞(TGF-β1组)。将空质粒、si-eEF2K及si-GSK3β转染肌成纤维细胞,培养48 h后采用免疫荧光染色法检测p-eEF2K和α-SMA蛋白表达情况,蛋白质印迹法检测各组eEF2K、p-eEF2K、GSK3β、P62及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达情况。结果 与对照组相比,TGF-β1组细胞p-eEF2K、GSK3β蛋白和α-SMA蛋白表达显著增加(P<0.05);转染si-eEF2K及si-GSK3β后,L-929细胞p-eEF2K/eEF2K表达下降(P<0.05),P62和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达水平增加(P<0.05),α-SMA蛋白表达降低(P<0.05)。结论 GSK3β/eEF2K信号可能通过降低自噬活性促进肺成纤维细胞向肌纤维细胞的表型转化,促进细胞纤维化进程。     

阿托伐他汀对转化生长因子β1诱导的大鼠肺肌成纤维细胞分化的影响

目的以转化生长因子β(1TGF-β1)诱导肌成纤维细胞的分化作为切入点,观察经阿托伐他汀干预后肌成纤维细胞的标志性产物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及细胞增殖情况的改变,探讨他汀类药物抑制肺纤维化的机制。方法气管内注入博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型,分离培养博莱霉素实验组和生理盐水对照组大鼠的肺成纤维细胞,分别分为空白对照亚组、TGF-β1诱导亚组和不同剂量阿托伐他汀阻断亚组。用倒置纤维镜观察细胞的形态结构,MTT计数法观察细胞的增殖情况,免疫组化染色法半定量观察α-SMA的表达情况。结果阿托伐他汀对TGF-β1诱导α-SMA具有明显的抑制作用。阿托伐他汀能够抑制TGF-β1诱导的大鼠肺肌成纤维细胞的增殖。结论阿托伐他汀能够抑制TGF-β1诱导的肌成纤维细胞的分化,主要表现在细胞形态、细胞增殖情况及α-SMA等指标的改变上。     

转化生长因子-β1对大鼠肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原表达的影响

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对大鼠肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原和TGF-β表达的影响.方法应用Northern印迹杂交和免疫细胞化学法.结果经TGF-β1作用后,肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及其蛋白的表达增强,也可见TGF-β的mRNA杂交信号和其蛋白的阳性反应.结论 TGF-β1能够促进大鼠肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型前胶原;TGF-β能促进肺成纤维细胞自身合成TGF-β.认为肺成纤维细胞自分泌TGF-β是肺纤维化进行性进展的重要原因之一.     

阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导肾成纤维细胞表型活化的影响

目的 观察阿魏酸哌嗪对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导肾成纤维细胞表型活化的影响,探讨其抗肾间质纤维化的可能机制.方法 体外培养正常大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F),利用MTT观察阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞活力的影响;免疫细胞化学法观察阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达的影响;实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞α-SMA及CTGF mRNA表达的作用,双抗体夹心ABC-ELISA法检测阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞上清Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、纤维连接蛋白(FN)表达的影响.结果 TGF-β1可以显著增加大鼠肾脏成纤维细胞活力,上调细胞α-SMA、CTGF蛋白和mRNA的表达以及Col Ⅰ、FN的表达.与TGF-β1刺激组相比,阿魏酸哌嗪能部分抑制TGF-β1诱导的细胞活力增加、α-SMA、CTGF的表达和细胞外基质(ECM)的合成.结论 阿魏酸哌嗪可以在一定程度上拮抗TGF-β1诱导的肾纤维化效应.