两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.     

腺相关病毒载体介导Zs Green基因在体转染大鼠心肌组织的实验研究

目的 观察腺相关病毒载体9型(AAV9)介导Zs Green基因在体转染心肌组织的效果.方法 采用冠状动脉灌注法将携带报告基因Zs Green的腺相关病毒9型(AAV9-Zs Green)以不同滴度(5×106TU,1×107TU)转导至大鼠心肌组织,分别于转染后1、2和4周在荧光显微镜下观察大鼠心肌组织绿色荧光表达情况.结果 病毒载体转染1周后心肌组织可见绿色荧光表达;2周时可见大量绿色荧光表达,荧光强度较1周时明显增强(P＜0.01);4周时荧光强度较2周有所减弱(P＜0.05),但仍有较强表达;随着病毒转导滴度提高,荧光强度明显增加(P＜0.05).结论 腺相关病毒载体能够有效介导Zs Green转染大鼠心肌组织,并长期稳定表达.     

腺相关病毒载体介导ZsGreen基因通过3种转染途径在心肌组织转染效果的比较

目的：采用腺相关病毒（Adeno-associated virus,ＡＡＶ）-9为载体,比较３种转染方法对ZsGreen基因在大鼠心肌组织表达的影响。方法：30只雄性SD大鼠随机分为尾静脉（Tail vein,TV）注射组、心肌（Intramyocardium,IM）注射组、冠脉（Intra－coronary,IC）灌注组,采用相应方法在体转染携带报告基因ZsGreen的腺相关病毒-9型（Adeno-associated virus 9-ZsGreen,AAV9-ZsGreen）。2周后荧光显微镜下观察绿色荧光在大鼠ＩＭ组织的表达情况。结果：TV组ＩＭ有少量绿色荧光分布;IM组绿色荧光表达主要局限在ＩＭ注射位点,注射点周边有少量分布;IC组大量绿色荧光在ＩＭ广泛均匀表达。IM及IC组荧光强度均显著高于TV组（P＜0.01）,IC组荧光强度高于IM组（P＜0.01）。结论：IC灌注法可使ＡＡＶ介导的外源基因在ＩＭ组织高效、广泛、均匀表达,优于TV注射法及ＩＭ注射法。     

超声辐照与丁酸钠对腺相关病毒转染大鼠视网膜色素上皮细胞的影响

目的 探讨超声辐照与丁酸钠在携带增强型绿色荧光蛋白的2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞中的应用价值.方法 大鼠RPE细胞接种于24孔板中,分别以rAAV2-EGFP(对照组)、rAAV2-EGFP+超声辐照(超声辐照组,辐照时间60 s,声强0.5、1 W/cm2)、rAAV2-EGFP+不同终浓度丁酸钠(丁酸钠组)转染大鼠RPE细胞.转染后48 h,倒置荧光显微镜观察转染细胞EGFP表达情况,流式细胞仪检测细胞转染效率(EGFP阳性细胞百分率);转染后24 h,MTS法检测细胞增殖.结果 流式细胞仪检测结果显示:超声辐照组和丁酸钠组EGFP阳性细胞百分率显著高于对照组(P＜0.05),丁酸钠组转染效率提高的百分率显著高于超声辐照组(P＜0.05).细胞增殖检测结果显示,超声辐照组转染细胞的吸光度值显著高于丁酸钠组(P＜0.05).结论 丁酸钠和超声辐照均能提高rAAV2-EGFP对大鼠RPE细胞的转染效率,其中丁酸钠的效果显著,而超声辐照对细胞增殖的抑制程度较轻.     

VEGF165基因重组腺相关病毒构建及转染猪骨髓间充质干细胞的研究

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子（hVEGF）的重组腺相关病毒载体,在体外转染猪骨髓间充质干细胞并观察其表达。方法细胞AAV包装质粒pAAV-IRES-ZsGreen及含hVEGF的质粒经EcoRI＋BamHI双酶切、连接,构建pAAV-hVEGF165-IRES-ZsGreen载体,采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获得rAAV2-hVEGF165及对照重组腺相关病毒,real-timePCR法测定病毒效价。Westernblot检测重组rAAV2-hVEGFl65在猪骨髓间充质干细胞的表达,MTS法检测VEGF蛋白活性。结果成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,rAAV2-hVEGFl65经双酶切和测序鉴定正确,real-timePCR法测定病毒效价为5×10 12vg／ml。转染rAAV2-hVEGF165的猪骨髓干细胞能够有效表达VEGF蛋白,并能促进血管内皮细胞的增殖。结论成功构建rAAV2-hVEGFl65重组腺相关病毒载体,并能在猪骨髓间充质干细胞中有效转染和表达,为进一步探索rAAV2-hVEGF165对治疗缺血性心肌疾病的研究提供实验基础。     

重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)介导增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的有效性和安全性。方法 微型角膜刀制作兔角膜基质瓣；转染组用含rAAV－EGFP转染液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min，对照组用等量BSS液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min，不同时间点(1、3、7、14、21d)通过荧光体视镜观察角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况，收集角膜，其中一半用激光共聚焦显微镜观察、照相，另一半固定后行HE染色。结果 转染组于转染第3天，体视荧光显微镜下观察到兔眼角膜瓣内面及基质床中开始有GFP阳性表达；7d达到高峰, 21d时仍有微弱表达。第7天 在激光共聚焦显微镜下可观察到兔角膜基质中有明显的荧光表达。对照组角膜始终未见荧光表达。转染组和对照组角膜HE染色均未见炎症细胞浸润及新生血管等异常。结论 rAAV- EGFP经兔角膜基质瓣转染角膜基质细胞的方法可将基因安全、相对高效地转入角膜基质细胞。为转基因治疗角膜病提供了新的转染途径。     

MicroRNA-21在缺血再灌注损伤早期大鼠心肌的表达及抗细胞凋亡作用

目的：观察microRNA-21(miR-21)在缺血再灌注损伤(I/R)早期大鼠心肌的表达及对细胞凋亡的影响。方法：SD大鼠随机分为对照组(冠状动脉注射转染空白对照病毒rAAV9-ZsGreen),miR-21组(冠状动脉注射转染rAAV9-ZsGreen-pre-miR-21),Sham组(仅开胸挂线),I/R组(进行I/R处理),I/R+miR-21(转染rAAV9-ZsGreen-pre-miR-21后再进行I/R处理)。用Realtime-PCR检测大鼠miR-21水平,免疫组织化学及Western印迹方法检测Bcl-2, Bax,caspase-3水平并计算Bcl-2/Bax比值。结果：冠状动脉注射rAAV9-ZsGreen-pre-miR-21可使miR-21表达增加4.43倍(P<0.001);与Sham组比较,I/R组大鼠缺血区miR-21水平下调(P<0.05),而非缺血区miR-21升高(P<0.05);与Sham组比较,I/R组再灌注1,2,6 h miR-21水平进行性下降(P<0.05),在同一时间点I/R+miR-21组较I/R组miR-21表达升高(P<0.05);与Sham组比较,再灌注6 h时I/R及I/R+miR-21组Bcl-2增高、caspase-3增高、Bcl-2/Bax降低(P<0.05),与I/R组比较,I/R+miR-21组Bcl-2下调、caspase-3下调、Bcl-2/Bax增高(P<0.05)。结论：I/R早期大鼠心肌缺血区miR-21表达下降,细胞凋亡增加,过表达miR-21可改善细胞凋亡。     

应用杆状病毒系统制备8型腺相关病毒

目的建立应用杆状病毒系统制备8型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的技术体系,并初步检测所制备病毒的感染活力。方法采用杆状病毒生产系统包装rAAV8-EGFP,经高效液相色谱法提取并纯化病毒,实时荧光定量PCR测定病毒滴度,通过观察绿色荧光蛋白的表达强度来检测rAAV8-EGFP对HEK-293细胞的感染活力。结果实时荧光定量PCR显示成功制备高滴度rAAV8-EGFP,滴度可达1.5×1012vg/ml,100ml摇瓶共得到1.5×1013vg rAAV8-EGFP病毒颗粒;感染后的HEK-293细胞具有较强的绿色荧光蛋白表达。结论应用杆状病毒系统成功制备高滴度、高活力的重组腺相关病毒,为后续研究奠定了基础。     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞

目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据。方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1 、3 、5 、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率。MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持。MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义。结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响。     

构建重组人SERCA2a基因9型腺相关病毒载体和病毒包装

目的探讨构建重组人SERCA2a基因9型腺相关病毒载体和病毒包装的方法,并包装出rAAV9-hSERCA2a-EGFP。方法根据细菌内同源重组的方法使用腺相关病毒包装系统,将hSERCA2a基因克隆到腺相关病毒载体中,与腺相关病毒包装质粒pAAV pHelper发生重组,通过脂质体共转染人胚肾293(HEK293)细胞,产生重组腺相关病毒,通过酶切鉴定和DNA测序鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定(采用荧光滴度检测法)。结果酶切鉴定和DNA测序证明重组腺相关病毒载体rAAV9-hSERCA2a-EGFP构建成功,PCR鉴定可见到阳性扩增条带,rAAV9-hSERCA2a-EGFP滴度高达1×1012 vg(virus genomes,vg)/mL。结论本方法成功构建和包装滴度为1×1012 vg/mL携带hSERCA2a基因的rAAV9-hSERCA2a-EGFP。     

Recombinant adeno-associated virus-mediated inhibiting of interleukin-4 expression in rat model of asthma

Asthma is a chronic disease characterized by ,reversible airway obstruction, airway hyperresponsiveness, and inflammation of airways, Th2 cells, one sort of CD4＋ T lymphocytes, are currently considered to play an important role in the chronic airway inflammation of asthma, Meanwhile, a number of laboratories have clearly established the importance of the Th2-dedved cytokine interleukin-4 （IL-4） in mediating the airway inflammatory response, Anti-IL-4 therapy might be beneficial in treatment of chronic asthma.     

Recombinant adeno-associated virus-mediated inhibiting of interleukin-4 expression in rat model of asthma

Asthma is a chronic disease characterized by reversible airway obstruction, airway hyper- responsiveness, and inflammation of airways. Th2 cells, one sort of CD4+ T lymphocytes, are currently considered to play an important role in the chronic airway inflammation of asthma. Meanwhile, a number of laboratories have clearly established the importance of the Th2-derived cytokine interleukin-4 (IL-4) in mediating the airway inflammatory response. Anti-IL-4 therapy might be beneficial in treatme…     

Adeno-associated virus vector-mediated triple gene transfer of dopamine synt hetic enzymes

Objective To explore triple gene transfer of dopamine synthetic enzymes with separate aden o-associated virus (AAV) vectors.Methods The genes for dopamine synthetic enzymes, tyrosine hydroxylase (TH), aromatic L -amino acid decarboxylase (AADC), and GTP cyclohydrolase Ⅰ (GCH, an enzyme cri tical for tetrahydrobiopterin synthesis) were cotransduced into 293 cells with s eparate AAV vectors. Expressions of TH, AADC and GCH were detected by Western b lot analysis. Intracellular dopamine level was assayed by high-performance liq uid chromatography.Results TH, AADC and GCH were effectively coexpressed in transduced cells with three sep arate AAV vectors, AAV-TH, AAV-AADC and AAV-GCH. Furthermore, the coexpressi on resulted in an effectively spontaneous dopamine production in cotransduced ce lls.Conclusion The triple transduction of TH, AADC and GCH genes with separate AAV vectors is e ffective, which might be important to gene therapy for Parkinson’s disease.     

重组腺相关病毒对NK92细胞的转导条件优化

为提高重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)对NK92细胞的转导效率，对转导细胞密度、培养基中IL-2浓度、rAAV血清型和用量进行优化；此外，用不同浓度的促进剂(ZnCl2、氯喹、聚乙烯醇和金雀异黄酮)溶液处理细胞，以进一步提高病毒转导效率。结果表明，在细胞密度为5×10⁵时，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达效率相对较高；当培养基中IL-2的浓度为1 000 IU/mL时，NK92的细胞生长状态最适合病毒转导；不同血清型rAAV对NK92细胞的转导效率由高到低依次为rAAV6、rAAV2和rAAV9；用金雀异黄酮预处理NK92细胞，能够显著提高病毒转导效率，而其他促进剂的添加对病毒转导效率无显著影响。通过上述条件的优化，显著提高了rAAV对NK92细胞的转导效率，为rAAV载体介导工程化NK92细胞奠定基础。     

携带c-Met短发夹结构重组腺相关病毒的包装及滴度测定

目的：包装带有人U6启动子及c-Met短发夹环的重组腺相关病毒，为抑制c-Met的表达及进行肿瘤基因治疗研究奠定基础。方法：通过PCR方法将带有c-Met短发夹结构的片段构建至人U6启动子下游，将U6shMet构建至腺相关病毒载体质粒pSNAV中，将pSNAVUshMet转染BHK细胞，经G418筛选后加辅毒rHSV1-repcap包装成携带U6shMet的重组腺相关病毒。SDS-PAGE电泳分析病毒纯度，斑点杂交测定病毒滴度。结果：获得了2段带有c-Met短发夹结构的片段U6shMet1和U6shMet2,成功包装了2个带有U6shMet序列的重组腺相关病毒rAAVUshMet1和rAAVUshMet2，纯化后的病毒电泳分析条带清晰、杂带少，病毒滴度均为4×10¹²mg•L^-1。结论：成功构建了带有U6shMet的重组腺相关病毒rAAVUshMet，病毒纯度好、滴度高，为抑制c-Met的表达及进行肿瘤基因治疗提供了运载工具。     

白细胞介素4反义基因腺相关病毒载体质粒的构建及鉴定

目的构建携带大鼠反义白细胞介素4（IL-4）基因并含有腺相关病毒（AAV）末端反向重复序列（ITR）结构的重组质粒载体pasIL-4。方法利用基因重组技术将大鼠IL-4eDNA反向克隆到已酶切去除绿色荧光蛋白（GFP）基因的真核表达载体phMGFP中，构建重组中间质粒载体。通过PCR技术扩增获取重组中间质粒载体上的目的片段CMVρ-asIL-4-SV40ε，将此目的片段定向插入已酶切处理的psub201中，构建出重组质粒pasIL-4。进一步通过阳离子脂质体介导，将pasIL-44转染哮喘大鼠CD4^＋T细胞，RT—PCR法和ELISA法分别检测细胞中IL-4mRNA和细胞培养上清液IL-4蛋白的变化。结果pasIL-4经限制性酶切及部分序列测序分析证实II，4反向插入正确。pasIL-4重组质粒转染的CD4^＋T细胞IL-4mRNA水平和细胞培养上清液中IL-4水平较未转染组明显下降。结论pasIL-4重组质粒载体构建成功，为今后利用其进行哮喘基因治疗的研究奠定基础。     

炎症增强报告基因在角膜内皮的表达

目的 研究脂多糖(LPS)诱发的眼内炎症反应能否增强腺相关病毒介导的报告基因在角膜内皮的表达。方法 20只SD大鼠前房注射rAAV-Lacz(10^10个病毒颗粒／ml)，28d后，取10只大鼠的玻璃体腔注射脂多糖溶液诱发眼内炎症，另10只玻璃体腔注射PBS作为对照，2d后，取角膜行5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)组织化学染色，评价报告基因的表达情况；Western blot检测核因子κB(NF-κB)蛋白的表达。结果 X-gal组织化学染色证实，报告基因可以在角膜内皮、角膜基质和虹膜细胞表达，玻璃体腔注射LPS 2d后，眼内炎症反应达高峰，此时角膜内皮细胞表现出明显的Lacz基因的表达；Western blot亦证实，角膜组织NF-κB蛋白表达与炎症反应成正比。结论 rAAV载体能有效携载目的基因到角膜内皮细胞，并且目的基因的表达在炎症情况下明显增强。     

重组腺相关病毒介导内皮抑素的表达及体外活性研究

目的 构建携带人内皮抑素基因的重组腺相关病毒rAAV-hEndo,介导其体外表达并检测其生物活性。方法 采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-hEndo,测定其滴度及感染效率。免疫荧光染色检测内皮抑素蛋白在体外感染细胞中的表达,并通过MTT法、细胞周期检测及TUNEL法检测细胞凋亡指数,观察其对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响。结果 所制备的重组腺相关病毒滴度为2×10¹²vg/ml,感染效率达98%。免疫荧光染色显示内皮抑素蛋白主要表达于细胞胞质。rAAV-hEndo感染细胞培养上清对ECV304细胞72h增殖抑制率为67.3%。内皮细胞转染内皮抑素基因后细胞周期明显阻滞于G₁期,其G₁期占(72.5±4.0)%,与对照组(52.1±2.1)%比较有显著差异(P<0.01)。TUNEL法检测实验组内皮细胞凋亡指数为(32.6±3.2)%,与对照组(4.2±1.9)%比较有显著差异(P<0.01)。结论 所制备的重组腺相关病毒rAAV-hEndo能有效介导具有生物活性的内皮抑素表达,为进一步肿瘤抗血管生成基因治疗动物实验奠定了基础。