唑来膦酸联合Ghrelin对人成骨细胞增殖及成骨活性影响

目的:研究唑来膦酸联合Ghrelin对人成骨细胞hFOB1.19的作用。方法:以不同浓度唑来膦酸和Ghrelin处理成骨细胞,以MTT法检测其不同浓度和处理时间下细胞增殖情况,研究其最佳作用浓度;并以最佳作用浓度,单独和联合处理成骨细胞,检测成骨细胞在不同时间内碱性磷酸酶活性和骨钙素的表达量,研究成骨细胞的成骨活性。结果:唑来膦酸和Ghrelin对成骨细胞增殖均具有促进作用,其最佳作用浓度分别为10^(-10)mol/L和10(-10)mol/L和10^(-11)mol/L;该浓度下两者均可提高碱性磷酸酶活性和骨钙素表达量,但两者联合应用时碱性磷酸酶活性无明显差异,骨钙素表达量在作用72 h时有明显差异。结论:唑来膦酸和Ghrelin可以促进成骨细胞的增殖,提高碱性磷酸酶活性和骨钙素表达量,两者联合应用可能促进成骨细胞活性。     

P物质对体外培养成骨细胞增殖和活性的影响

目的: 观察P物质(substance P,SP)对体外培养的成骨细胞增殖和活性的影响. 方法: 采用新生大鼠颅盖骨消化法培养成骨细胞,再加入不同浓度的SP,观察细胞生长数量,测定碱性磷酸酶活性及观察细胞周期变化. 结果: 浓度范围从1×10-12～1×10-6 mol/L的SP对成骨细胞的增殖和活性都有促进作用,在浓度为1×10-8 mol/L对成骨细胞增殖和活性的促进作用最强. 结论: SP对成骨细胞增殖和活性有促进作用.     

淫羊藿苷对大鼠成骨细胞核结合因子α1、骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4 mRNA表达的影响

目的:研究淫羊藿苷对成骨细胞增殖、分化以及对核心结合因子α1(Cbfαl)、骨形成蛋白-2(BMP2)、骨形成蛋白-4(BMP4)mRNA表达的影响.方法:以酶序列消化法从新生大鼠颅骨分离、培养成骨细胞,采用碱性磷酸酶染色和钙结节茜素红染色法鉴定细胞.取第3-5代细胞,用CCK-8法检测经0 mol/L、10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L的淫羊藿苷处理24、48、72 h后成骨细胞的增殖情况.分别用流式细胞技术和对硝基苯酚法检测上述各浓度的淫羊藿苷处理48 h后成骨细胞的增殖指数和碱性磷酸酶(ALP)活性.用real-timePCR法检测10～(-6)mol/L淫羊藿苷处理48 h后成骨细胞Cbfα1、BMP2和BMP4 mRNA表达的改变.结果:10~(-8)～10~(-4)moL/L的淫羊藿苷对成骨细胞均无增殖促进作用,但可促进成骨细胞的ALP活性;10~(-6)mol/L淫羊藿苷可以上调成骨细胞Cbfα1、BMP2和BMP4 mRNA的表达.结论:淫羊藿苷可能是通过上调Cbfα1、BMP2和BMP4 mRNA的表达而促进成骨细胞的分化.     

槐角苷及染料木素对成骨细胞生物学特性的影响

目的：比较槐角苷及染料木素对成骨细胞生物学特性的影响。方法：成骨细胞由新生24h SD大鼠头盖骨分离得到。通过细胞增殖率测定、碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色矿化结节形态计量方法,对比槐角苷和染料木素在体外对成骨细胞骨形成功能的影响。利用基因克隆和报告基因方法,检测槐角苷和染料木素对人骨保护素（osteoprotegerin,OPG）启动子活性的作用,观察两者对骨保护素基因转录活性的调节。结果：体外培养的成骨细胞在1和0．1μmol／L槐角苷的干预下,均显示增殖刺激作用（与对照组比较P〈0．05）。10μmol／L染料木素使细胞增殖受抑制,但0.1μmol／L染料木素则显示增殖刺激作用（与对照组比较P〈O．05）。槐角苷在实验的各种浓度中均能提高ALP活性,而染料木素只在0．1μmol／L浓度才能提高ALP活性。槐角苷在10、1和0．1μmol／L浓度对成骨细胞的矿化总面积较对照组分别提高了73％、138．6％和114．3％,而染料木素各个浓度下成骨细胞矿化总面积均减少。10、1和0．1μmol／L浓度槐角苷干预后检测报告β-半乳糖苷酶基因（LacZ）活性均增加,但染料木素仅在0．1μmol／L浓度对LacZ活性有增强作用（与对照组比较P〈0．05）。结论：槐角苷能够促进成骨细胞的增殖、分化和矿化功能,与染料木素比较,不出现对成骨细胞成骨功能的抑制作用。而对于成骨细胞产生的破骨细胞抑制因子骨保护素,较染料木素有更强的上调作用。     

成骨生长肽羧基端片段及其衍生物G38I对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的探讨成骨生长肽(OGP)羧基端片段[OGP(10~14)]及其衍生物G38I对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响。方法大鼠颅盖骨成骨细胞体外培养至第3代,分别加入10-15~10-7mol/L的OGP(10~14)或G38I,48h后行细胞计数,并用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖情况。细胞分为实验组[OGP(10~14)组和G38I组]及对照组,实验组给予10-11mol/L的药物干预48h。电镜观察细胞超微结构的变化,测定培养上清液碱性磷酸酶(ALP)含量,用免疫组织化学方法比较细胞中Ⅰ型胶原蛋白含量的变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定细胞中核结合因子a1(Cbfa1)和Ⅰ型胶原mRNA表达水平的变化。结果在较低浓度时,随药物浓度升高,OGP(10~14)和G38I促进细胞数增加、提高细胞活性的作用增强,10-11mol/L药物作用时成骨细胞数分别为37×104/ml和30×104/ml,进一步升高药物浓度反而抑制细胞增殖。电镜下实验组细胞粗面内质网发达,胞质中有大量分泌囊泡。对照组细胞囊泡中可见钙盐结晶。OGP(10~14)组和G38I组与对照组比较,细胞培养上清液ALP含量高(4·47U/g、3·82U/g vs2·21U/g),细胞中Ⅰ型胶原蛋白含量多,Cbfa1和Ⅰ型胶原mRNA表达水平较高,差异均具有统计学意义(P<0·01,P<0·05)。结论OGP(10~14)及其衍生物G38I具有与OGP全长肽相同的促进成骨细胞增殖、提高细胞活性的作用,OGP(10~14)和G38I可上调成骨细胞Cbfa1和Ⅰ型胶原mRNA表达水平,增加细胞中Ⅰ型胶原的合成,促进细胞分化和成骨作用。     

镉对体外培养成骨细胞增殖、凋亡、分化及矿化的影响

目的探讨镉对体外培养成骨细胞（osteoblast,OB）增殖、凋亡、分化及矿化的影响。方法用混合酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养;成骨细胞与不同浓度的Cd2＋作用后,MTT法测定细胞增殖;AO/EB双染法进行凋亡形态学观察;PNPP法检测碱性磷酸酶活性;矿化结节计数和面积测量分析镉对成骨细胞矿化能力的影响。结果各剂量组氯化镉均可抑制成骨细胞增殖,其中2.0μmol/L以上剂量组与对照组相比差异有统计学显著意义（P〈0.01）;16.0μmol/L、32.0μmol/L剂量组OB可见较多凋亡细胞;各时点、各剂量组氯化镉均能抑制ALP活性,尤其是48h以上影响作用更明显（P〈0.01）;0.5μmol/L、1.0μmol/L浓度的氯化镉可明显抑制成骨细胞矿化能力。结论镉离子可以抑制成骨细胞增殖、分化及矿化能力,促进成骨细胞凋亡,对成骨细胞的骨形成能力有明显抑制作用。     

降钙素对成骨细胞作用机制的体外实验研究

目的　观察降钙素 (calcitonin ,CT)对体外培养成骨细胞功能及其细胞因子表达的影响 ,初步探讨其作用机制。方法　采用酶消化法培养新生SD大鼠的成骨细胞 (osteoblast,OB) ,加入不同浓度 (1× 10 -12 ～ 1× 10 -8mol/L)的CT ,观察OB的增殖、分化功能和矿化功能。采用RT PCR方法观察胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF Ⅰ )、碱性磷酸酶 (ALP)的表达。结果　增殖率测定CT组自 1× 10 -12 mol/L起 ,吸光度 (A值 )均较对照组增加 ,且呈剂量依赖关系 ,CT≥ 1× 10 -9mol/L时差异有显著性 (P =0 .0 39) ;ALP活性自 1× 10 -12 mol/L起均较对照组增加 ,也呈剂量依赖关系。CT≥ 1× 10 -10 mol/L时差异有显著性 (P =0 .0 32 ) ;矿化结节面积 /孔 :CT=1× 10 -12 mol/L组为对照组的 1.6 72倍 (P =0 .0 2 4 ) ,1× 10 -8mol/L组为对照组的 2 .92 4倍 (P =0 .0 0 6 )。CT组细胞因子IGF Ⅰ、ALPmRNA表达较对照组显著升高 (P <0 .0 5 )。结论　适当浓度的CT对体外培养的OB增殖、分化、矿化均具有促进作用。部分机制与CT可以刺激IGF Ⅰ表达增加有关。     

不同浓度二甲双胍对大鼠离体成骨细胞增殖和分化的影响

目的 观察不同浓度二甲双胍对大鼠离体成骨细胞增殖和分化的影响。方法 从SD乳鼠颅骨中分离出原代成骨细胞后进行培养和鉴定。用不同浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1 600μmol/L、3 200μmol/L)二甲双胍干预成骨细胞72 h后,检测成骨细胞的增殖情况。用不同浓度(0μmol/L、50μmol/L、200μmol/L、800μmol/L、1 600μmol/L、3 200μmol/L)二甲双胍干预成骨细胞72 h后,检测成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性,以及骨形成指标ALP、Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)的基因和蛋白表达水平。结果 (1)干预72 h后,与0μmol/L二甲双胍相比,经50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L二甲双胍干预后成骨细胞的增殖活性呈浓度依赖性增强,其中经800μmol/L二甲双胍干预的成骨细胞增殖活性最强(P<0.05),而经3 200μmol/L二甲双胍干预后成骨细胞的增殖活性降低(P<0.05)。(2...     

成骨生长肽对大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞增殖和分化的影响

目的研究成骨生长肽(OGP)在体外对成骨细胞样细胞增殖分化的影响。方法在体外培养的新生大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞中加入不同浓度的OGP(10-11mol/L~10-7mol/L),用MTT法检测细胞增殖,酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)的表达,RT-PCR法检测核心结合因子1(Cbfa1)mRNA的表达。结果OGP对成骨细胞样细胞增殖有促进作用(P<0.05),最大效应浓度为10-9mol/L;能增加细胞内ALP活性(P<0.05),最大效应浓度为10-8mol/L;可促进Cbfa1mRNA的表达(P<0.05),其最佳促进表达浓度为10-8mol/L,Cbfa1mRNA与β-actinmRNA像素值比值为0.89±0.02。结论OGP可促进成骨细胞样细胞增殖,增强Cbfa1mRNA的表达水平。     

不同浓度降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞OPG mRNA表达的影响

目的 观察不同浓度降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠成骨细胞OPG mRNA的表达影响.方法 采用新生大鼠颅盖骨组织块培养成骨细胞,加入不同浓度CGRP干预体外培养成骨细胞,观察成骨细胞增殖和ALP活性,检测OPG mRNA及RANKL mRNA的表达水平.结果 CGRP在浓度为1×10-8mol/L时对成骨细胞增殖的促进作用最强,在1×10-9mol/L时对成骨细胞ALP活性的促进作用最强;CGRP不仅能明显增强OPG mRNA的表达水平(P＜0.05),还能明显抑制RANKL mRNA的表达水平(P＜0.05),以10-8和l0-7浓度时表达最为明显,均呈剂量依赖性;且CGRP可明显上调OPG/RANKL的比值(P＜0.05).结论 CGRP对成骨细胞增殖和活性均有促进作用,可能通过上调成骨细胞OPG/RANKL,最终发挥抑制骨吸收的作用.     

醛固酮介导心肌成纤维细胞增殖的机制研究

目的探讨醛固酮诱导心肌成纤维细胞(FBs)增殖及对诱导型一氧化氮合成酶一氧化氮(iN-OS-NO)活性的影响。方法以培养的FBs为模型,用醛固酮剌激FBs增殖,螺内酯阻断醛固酮的作用,检测FBsNO含量、iNOS活性和iNOSmRNA表达,用3H-胸腺嘧啶掺入量作为反应FBs增殖的指标。结果醛固酮呈浓度依赖性的促FBs核酸合成速率明显增高,降低FBsNO含量、iNOS活性和iNOSmRNA表达;螺内酯能明显抑制醛固酮介导的FBs核酸合成速率增高,与醛固酮剌激组相比差异显著(P<0.01)。同时发现醛固酮剌激组NO含量、iNOS活性和iNOSmRNA表达与对照组相比差异显著(P<0.05或P<0.01)。螺内酯抑制醛固酮介导的FBs的上述作用。醛固酮干预下FBs核酸合成速率与NO含量及iNOS活性呈显著负相关(r分别为-0.932和-0.928,均P<0.01)。结论醛固酮通过降低iNOS-NO剌激FBs增殖,螺内酯能逆转上述作用。     

木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3 T3-E1增殖、分化、矿化和Wnt通路的影响

目的:探讨木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化及Wnt通路的影响.方法:在体外培养的MC3T3-E1s培养基中加入木犀草素0.25~8.00μmol/L培养12、24和48 h,以洛伐他汀0.04μmol/L作为阳性对照,采用细胞计数试剂盒法检测细胞增殖情况;用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞内ALP的活性;茜素红S染色法检测细胞矿化能力;采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞Ⅰ型胶原、骨钙素、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)、β-连环素、护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达水平.结果:木犀草素可以剂量依赖性和时间依赖性地促进成骨细胞MC3T3-E1增殖(P<0.05~P<0.01);木犀草素(2.00、4.00和8.00μmol/L)可以剂量依赖性地促进MC3T3-E1成骨细胞ALP活性,增强MC3T3-E1成骨细胞矿化能力并上调MC3T3-E1成骨细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素、Lrp5、β-连环素和护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达.结论:木犀草素2.00、4.00和8.00μmol/L可以促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化与矿化及Wnt通路中Lrp5和β-连环素mRNA的表达.     

葛根素影响雌激素受体α启动子甲基化调控成骨细胞增殖分化的研究

目的：探究葛根素对大鼠成骨细胞代谢调控的途径,为绝经后骨质疏松治疗提供理论依据。方法取新生 SD 大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞,分别加入不同浓度（5、10、25、50、100μmol／L）葛根素分组培养,应用巢式甲基敏感性聚合酶链反应方法观察雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）启动子 A 区甲基化,反转录－聚合酶链反应方法观察 ERαmRNA 表达,MTT 法和对硝基苯磷酸酯方法观察体外培养成骨细胞的增殖及碱性磷酸酶活性。结果随着葛根素浓度增加,ERα基因启动子甲基化程度逐渐减弱;同时发现细胞中 ERα mRNA 表达逐渐增强,25μmol／L葛根素浓度时表达最强（P ＜0．01）。葛根素能刺激成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性（P ＜0．01）。结论葛根素抑制 ERα启动子甲基化及增加 ERαmRNA 表达,可能通过此途径促进成骨细胞增殖分化。     

环淫羊藿素逆转糖皮质激素所致骨质疏松的机理研究

目的 阐明环淫羊藿素(CICT)逆转糖皮质激素所致骨质疏松作用,并探讨其作用机制。方法 采用泼尼松龙诱发斑马鱼骨质疏松模型,茜素红染色后,荧光倒置显微镜观察CICT对斑马鱼头骨染色情况、计算染色面积和累计光密度;ICP-MS测定各组斑马鱼中的钙和磷元素含量;采用分子对接技术模拟并预测CICT与BMPs的相互作用;采用qPCR检测Runx 2和AKP基因的表达量。结果 与空白组比,经泼尼松龙(25 μmol/L)培养后,可显著降低斑马鱼骨累积光密度和头骨矿化面积(P<0.01),且斑马鱼的Ca和P水平显著降低(P<0.01),Runx 2和AKP基因表达量显著降低(P<0.01);与泼尼松龙组相比,经不同剂量的CICT(0.1、1.0、10.0 μmol/L)干预后,斑马鱼的头骨累积光密度值和骨矿化面积均有显著的提高(P<0.01),斑马鱼Ca和P水平均显著提高(P<0.01);采用分子对接技术研究表明,CICT可与靶蛋白BMPs(BMP-2/BMP-4)稳定对接,对接得分分别为-5.493 256 09和-5.993 616 58;Runx 2和AKP基因表达量有显著增加(P<0.01)。结论 CICT能逆转糖皮质激素所致骨质疏松,这一作用可通过CICT与BMPs蛋白靶点结合,并调节BMPs信号通路而促进成骨分化而发挥抗骨质疏松作用。      

钠离子调节成骨细胞功能及其相关基因的差异性变化

目的探讨钠离子(Na+)对大鼠成骨细胞成骨功能的调节,及其相关基因mRNA的变化。方法应用CCK-8试剂盒和碱性磷酸酶(AKP)试剂盒检测5种不同浓度Na+对成骨细胞增殖和分化的影响。再从中选用低(1×10-4mol/L)、中(0.1 mol/L)、高(0.5 mol/L)3种浓度,于处理细胞15、30、120 min时,通过RT-PCR测定Na+对成骨细胞成骨功能相关基因OPN、Cbfa1 mRNA转录的影响。结果在1×10-4～1 mol/L范围内,与正常组相比,低浓度Na+明显促进成骨细胞分化,使AKP活性增加,高浓度则呈抑制作用,而Na+对成骨细胞的正常增殖无影响。RT-PCR结果显示与正常组相比,低浓度Na+显著地上调成骨细胞OPN、Cbfa1 mRNA的转录,高浓度则呈抑制作用。然而OPN、Cbfa1基因对Na+调节作出反应所需的时间存在差异,Cbfa1基因在经处理30 min时即可出现mRNA转录变化,而OPN基因则在处理120 min时才出现相应改变。结论 Na+可直接调节成骨细胞成骨功能,低浓度促进成骨细胞分化和相关功能基因OPN、Cbfa1的增加,而高浓度则显示抑制作用;且各基因转录变化具有时间差异。     

阿托伐他汀对骨髓基质细胞增殖及向成骨细胞分化的影响

目的比较不同浓度的阿托伐他汀对小鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化、矿化成骨的影响。方法分别将10^-8、10^-7、10^-6mol／L的阿托伐他汀和空白药物加入传代培养的小鼠骨髓基质细胞，通过细胞形态学观察、细胞增殖率检测、碱性磷酸酶（ALP）检测和钙结节染色，比较药物在成骨细胞分化过程中对细胞增殖和分化的影响。结果阿托伐他汀可以剂量依赖性方式抑制骨髓基质细胞的增殖，10^-7mol／L组和10^-6mol／L组较明显（均P〈0．05）。阿托伐他汀可以提高骨髓基质细胞ALP活性，培养10～22d，10^-7mol／L组和10^-6mol／L组ALP活性高于对照组和10^-8mol／L组（均P〈0．05）。矿化成骨染色显示在培养26d后，10^-6mol／L组染色明显深于其它各组。结论阿托伐他汀可促进骨髓基质细胞来源的成骨细胞的分化，抑制了细胞增殖，促进骨结节钙化。     

脂质体介导10-23脱氧核酶对人血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :研究针对增殖细胞核抗原 (PCNA)基因特异性的 10 - 2 3脱氧核酶 (DNAzyme)对人血管平滑肌细胞(VSMC)PCNA的表达和细胞增殖的影响。方法 :应用脂质体转染法将不同寡聚核苷酸转入体外培养的人脐动脉VSMC。采用3 H -TdR掺入法观察空白对照组、脂质体组和等摩尔浓度 (1.0 μmol/L)的DNAzyme、反义寡核苷酸 (A SODN)、mDNAzyme在干预 2d后VSMC的DNA合成速率 ;免疫组化检测 1.0 μmol/L的DNAzyme和ASODN转染 2d后对PCNA表达的影响 ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法分析不同剂量的DNAzyme(0 .12 5、0 .2 5、0 .5、1.0、2 .0 μmol/L)转染5d后VSMC增殖活性。结果 :1.0 μmol/LDNAzyme和ASODN转染 2d后 ,VSMC的3 H -TdR掺入量均较对照组显著减低 (P <0 .0 5 ) ,DNAzyme较ASODN更显著减低 (P <0 .0 5 ) ;1.0 μmol/LDNAzyme作用 2d后细胞增殖抑制率为 6 4 .5 % ,高于ASODN组 (37.7% )、mDNAzyme组 (11.9% )和脂质体组 (3.3% )。DNAzyme和ASODN处理细胞 2d后 ,PCNA的表达水平 (平均光密度值 )分别为 0 .2 95 6± 0 .0 2 5 1和 0 .3880± 0 .0 92 5 ,明显低于空白对照组 0 .7342± 0 .2 136 (P <0 .0 1)。转染 5d后 ,DNAzyme的作用呈剂量依赖性 ,0 .12 5 μmol/LDNAzyme处理后VSMC的增殖较对照组低 (P <0 .0 5 )。