地塞米松诱导促进BMP-2基因转染的兔MSCs的成骨转化

目的: 研究地塞米松诱导对BMP-2基因修饰的rMSCs的增殖和分化表型的影响.方法: 将地塞米松诱导和未经诱导的兔MSCs分别转导BMP-2基因后,以RT-PCR和免疫组化方法检测转导后细胞BMP-2的表达;通过观察细胞生长及碱性磷酸酶活性和骨钙素含量的测定,分析地塞米松诱导对BMP-2基因修饰的rMSCs的增殖和分化表型的影响.结果: 转导后BMP-2基因在两组rMSCs中均有表达,定量分析显示诱导组细胞碱性磷酸酶活性(134.36±8.84) nkat/L较对照组(104.02±7.83) nkat/L明显增高;诱导组细胞骨钙素含量(14.68±0.73) μg/L较对照组(6.52±1.21) μg/L明显增高.结论: 转导前地塞米松诱导能够促进BMP-2基因修饰的rMSCs的增殖和成骨转化.     

成骨因子 BMP-2/Smads/Runx2信号转导通路

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)-2在骨形成过程中起着重要作用, BMP-2与多种细胞因子形成信号通路,促进成骨性细胞分化和骨细胞外基质合成与分泌。在骨形成过程中, BMP-2也作为启动调节因子促进新骨形成。该文就骨形态发生蛋白重要信号通路 BMP-2/ Smads/ Runx2与骨发生发育的研究进展作一综述。     

BMP-2基因修饰自体BMSCs移植促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究

目的:检测骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因mRNA及其蛋白的表达,探讨BMP-2基因修饰自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对兔下颌骨牵张成骨新骨形成的促进作用。方法:取新西兰白兔36只随机分为3组,每组12只。建立牵张成骨动物模型,在固定期第2天,实验组于牵张间隙注射200μL的BMP-2基因修饰的自体BMSCs液;对照组注射等量自体BMSCs液;空白组注射等量生理盐水。分别于固定2,6周通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、免疫组化等手段检测BMP-2基因mRNA及其蛋白的表达情况。结果:实验组牵张间隙新生骨组织均可见BMP-2基因mRNA和其蛋白强阳性表达。结论:BMP-2基因修饰的自体BMSCs移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成。     

经声诺维转染骨形态发生蛋白2后促进人牙周膜成纤维细胞成骨向分化

目的 研究通过声诺维(SonoVue)转染骨形态发生蛋白2(BMP2)进入人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的条件及其对HPDLFs成骨向诱导的作用.方法 原代培养HPDLFs,按不同声诺维浓度、超声强度和辐照时间转染细胞,筛选获得最佳转染参数.将细胞随机分为4组:声诺维+质粒+超声组、脂质体+质粒组、超声组和空白对照组,按所筛选条件进行转染,分别于转染后3、5、7、9d时检测碱性磷酸酶活性,21 d时通过茜素红染色检查钙化情况;7、10、14 d时行RT-PCR对骨桥素(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、骨钙素(OCN)、成骨特异性转录因子(Runx2)的mRNA进行半定量检测.结果 超声功率为0.8 W/cm2、辐照时间为90 s、声诺维浓度为20％时细胞转染率与存活率均较佳,以该参数条件为转染参数.各时间点声诺维+质粒+超声组细胞的碱性磷酸酶活性及钙化结节形成量均高于空白对照组和超声组(P＜0.05);RT-PCR结果显示各时间点声诺维+质粒+超声组细胞OPN、BSP、Col Ⅰ、OCN、Runx2的mRNA表达量均高于超声组与空白对照组(P＜0.05),但与脂质体+质粒组相比差异无统计学意义.结论 通过声诺维能成功将BMP2转染进入HPDLFs并诱导其成骨向分化,为声诺维在牙周组织工程的应用奠定了基础.     

BMP-2/bFGF双基因转染的骨髓间充质干细胞复合生物陶瓷骨促进兔桡骨缺损修复

目的探讨骨形态发生蛋白2 (BMP-2)/碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)双基因转染的骨髓间充质干细胞(BMSC)复合生物陶瓷骨在兔桡骨缺损模型中的治疗作用,及其与EphB4/ephrin-B2信号通路的调控关系。方法体外分离培养兔BMSC并经流式细胞术鉴定,采用慢病毒载体将BMP-2/bFGF基因转染到兔BMSC,通过Western blotting鉴定过表达。制备BMSC复合生物陶瓷骨,植入兔挠骨缺损模型后,8周后取出缺损侧挠骨组织。HE染色观察桡骨组织形态变化;实时定量PCR检测成骨标志物Runt相关转录因子2 (Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)的表达;采用Lane-Sandhu组织学评分分析桡骨修复情况;采用免疫荧光检测桡骨组织ColⅠ、OPN的表达;采用Western blotting检测桡骨组织中EphB4、ephrin-B2水平。结果 BMP-2/bFGF双基因转染的BMSC复合生物陶瓷骨能够改善缺损桡骨组织形态,提高桡骨组织Lane-Sandhu组织学评分,上调桡骨组织中Runx2、ALP、OPN和ColⅠ的表达,并能够上调...     

腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响

目的: 用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响.方法: 用Ad-BMP-2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响.酶标法检测ALP活性;免疫荧光检测骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响.结果: BMP-2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达.流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异.ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质.结论: 在腺病毒载体介导下BMP-2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化.     

BMP-14与bFGF联合诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的实验研究

目的 研究骨形态发生蛋白-14(BMP-14)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)向软骨分化的协同作用.方法 采用密度梯度离心法与贴壁分离法相结合分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,用含10%胎牛血清的L-DMEM培养至第3代作为种子细胞,对照组A组不加生长因子,实验组B、C、D组分别加入100 ng/ml BMP-14、10 ng/mlbFGF和100ng/ml BMP-14+10 ng/ml bFGF,培养24 h后各组间行细胞增殖比较,14 d后观察各组细胞形态学改变,各组间行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色和阿尔辛蓝染色.结果 培养14 d后,A、B、C、D 4组的Ⅱ型胶原细胞染色阳性率分别为(7.5210±3.7243)%、(40.8271±1.2787)%、(17.2818±1.4242)%、(60.5114±1.7634)%;阿尔辛蓝染结果 为:A组阴性,B、C组呈淡染,D组呈蓝色.结论 BMP-14和bFGF的联合应用较单个细胞因子可以明显诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化及促进细胞增殖.     

BMP-2控释涂层对加力状态下牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的测试在加力状态下,层层自组装BMP-2控释涂层的缓释效果,并检测其对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSC)的成骨诱导作用。方法 通过层层自组装技术在Flexcell加力六孔板上负载[(PAH/BMP-2)/PSS][COL/ALG]₂₀涂层,利用ELISA检测加力状态下缓释涂层21d内释放的BMP-2浓度;将4~6代PDLSCs种于预置BMP-2控释涂层的BioFlex专用六孔培养板,置于FX-4000T加力系统中,加载动态张应力(10%形变牵张力,20Hz),各组作用时间均为1h/次,3次/d,间隔4h加力,分别培养3、5、7d。对照组为非预置涂层添加BMP-2培养液(100ng/ml)的BioFlex板同条件下加力培养;使用用Real-Time PCR和Western印迹法分析PDLSCs在不同张应力作用前后,其表型标志Runx2, ALP和OCN在 mRNA和蛋白水平的表达变化情况。结果实验结果显示,与对照组相比,实验组加力3、5、7d后,Runx2、ALP和OCN标志物mRNA与蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.05)。结论[(PAH/BMP-2)PSS]/[COL/ALG]₂₀涂层对hPDLSCs在加力状态下成骨向分化能力具有显著增强作用。     

Ad-BMP-2基因转移诱导兔下颌骨骨膜成骨的实验研究

目的 探讨腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(Ad-BMP-2)部基因转移对兔下颌升支外侧骨膜处异位成骨的诱导作用.方法 选用18只成年新西兰大白兔作为实验动物,在一侧下颌升支外侧骨膜处注射0.2mL Ad-BMP-2(共含病毒滴度2×10~9 pfu)为实验组,对侧注射等量的PBS为对照组,术后2、5、10周分别处死6只动物,行大体观察、影像学和组织学检查,观察新骨形成的时间和空间变化特点.结果 Ad-BMP-2局部注射引起一定程度的炎症反应,随时间延长逐渐减弱;第2周,注射区域的细胞开始增生和分化,有较多成纤维细胞样细胞聚集;第5周,类骨基质开始形成,部分区域开始矿化;第10周,有编织骨和髓腔样结构形成.骨化程度在不同个体间存在差异.对照组始终没有新骨形成.结论 一定浓度的Ad-BMP-2可以诱导下颌升支外侧骨膜处的异位骨形成,增加皮质骨的厚度.     

miR-95-5p靶向BMP2调控脂肪干细胞成骨分化的作用及机制

目的 研究miR-95-5p靶向骨形态发生蛋白2(BMP2)调控脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化的作用及机制.方法 培养ADSCs并分为转染阴性对照(NC)的miR-NC组及转染miR-95-5p mimic的miR-95-5p组,成骨诱导分化后采用试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)活力,显微镜检测ALP染色,采用茜素红染...     

hsa-miR-654-5p通过抑制骨形态发生蛋白2调控人骨髓基质干细胞成骨分化

目的明确萎缩性骨不连组织水平表达上调的hsa-miR-654-5p在人骨髓基质干细胞(hBMSCs)中对其预测靶基因骨形态发生蛋白2(BMP2)mRNA和蛋白的抑制作用,探索其在成骨分化过程中的生物学调控功能。方法分离培养hBMSCs,将第4代hBMSCs培养16 h后分别按相应体系转染细胞,再培养48 h后取六孔板内细胞提取总RNA和总蛋白,进行实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting,取24孔板内细胞进行双荧光素酶报告基因检测。结果当hBMSCs中hsa-miR-654-5p过表达时,BMP2的mRNA和蛋白表达水平均发生明显下调;双荧光素酶报告基因检测提示,BMP2的预测靶位点直接受hsa-miR-654-5p的抑制调控,该靶位点被突变后hsa-miR-654-5p对BMP2的抑制作用消失。结论 hsa-miR-654-5p可通过作用于BMP2的特定靶位点而直接抑制BMP2的mRNA和蛋白表达。hsa-miR-654-5p的变化在成骨分化调控过程中具有重要作用。     

骨形态发生蛋白-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在雷奈酸锶(Strontium ranelate,Sr)促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化中的作用。方法体外分离培养4周龄大鼠BMSCs,取第3~4代,用细胞碱性磷酸酶标法检测不同浓度Sr作用下碱性磷酸酶(ALP)活性的表达;用茜素红染色法检测钙结节的表达;用Western blot测定BMP-7的表达水平。结果在0.1~3.0 mmol/L的浓度范围内,Sr呈浓度依赖性地增加ALP活性,其浓度为3 mmol/L时,ALP活性表达最高,并明显促进钙结节的表达;Sr(0.1~3.0 mmol/L)呈浓度依赖性地上调BMP-7表达,其中浓度为3 mmol/L时,BMP-7表达最高;BMP-7阻断剂(noggin)(100 ng/ml)不仅抑制Sr诱导的BMP-7表达,而且使ALP活性及钙结节的表达明显下降。结论 Sr可通过上调BMP-7表达促进BMSCs向成骨细胞分化。     

BMPs-ERK5信号通路调控人牙周膜干细胞成骨分化的研究

目的 比较骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)2、7、9对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化的诱导作用,探讨BMPs-ERK5信号通路在成骨分化中的作用.方法 首先采用组织块酶消化法分离培养原代hPDLSCs并鉴定,利用腺病毒载体介导的GFP、BMP2、BMP7和BMP9(Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9)分别感染hPDLSCs,通过早期成骨分化指标碱性磷酸酶活性定性和定量检测、茜素红染色检测晚期成骨分化指标钙盐结节沉积情况、qRT-PCR检测细胞成骨分化相关基因骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA表达,比较发现BMP9对细胞成骨分化的作用最强;采用Ad-BMP9感染hPDLSCs 24 h后,检测BMP9作用PDLSCs后对ERK5磷酸化水平的影响和ERK5信号通路特异性抑制剂BIX02189预处理后BMP9-ERK5通路对hPDLSCs成骨分化的影响.结果 ①分离培养的hPDLSCs为成纤维细胞样,呈漩涡状生长,抗波形蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性,具有间充质属性和克隆形成能力.②BMP2、BMP7和BMP9均有促进细胞成骨分化作用,其中3组的碱性磷酸酶定量结果和成骨分化相关基因相对表达量与GFP组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05),且BMP9效力最强.③Western blot检测显示BMP9增强p-ERK5的表达.而抑制剂BIX02189呈剂量依赖性地抑制p-ERK5的表达.BIX02189预处理细胞后、感染Ad-BMP9的结果显示,BMP9对细胞的促成骨作用较未处理组明显降低,其中BMP9组的碱性磷酸酶定量分析结果与成骨分化相关基因相对表达量与BIX02189处理组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 BMP9具有较强的促hPDLSCs成骨分化作用,ERK5信号转导途径在BMP9诱导hPDLSCs成骨分化过程中发挥了正向调节作用.     

Human bone morphogenetic protein-2 gene transfer induces human mesenchymal stem cell proliferation and differentiation in vitro

To identify eukaryotie expression veetor of human bone morphogenetie protein 2 peDNA3/BMP2, verify its expression in transfected hulnan mesenchynlal stem cells(hMSCs) and the effect on hMSCs differentiation. Methods: The BMP2 gene was cloned into a eukaryotic expression veetor pcDNA3. Transfeeted the reeombinant into hMSCs by liposome, Lmmunnohistochemistry and it situ hybridization methods were used to identify the expression of BMP2 mRNA and protein; ALP and Von Kossa stains were performed to identify the BMP2 gene differentiated effect on the hMSCs. Resuits: The pcDNA3/BMP2 fragments were as large as theory. BMP2 mRNA and protein were espressed and synthesized both in 48 h and 4 weeks after transfeetion, the ALP and Ca deposit eshibitiio, which marked the osteogenie lineage of hMSCs, were enhanced and Sped. Conclusion: Transfeetion of pcDNA3/BMP2 is able to provide transient and persistent expressionin hMSCs, and promote the MSCs differentiation to osleogenic lineage.     

大麻素II型受体参与调控低氧微环境下大鼠骨髓间充质干细胞的骨向分化

目的：研究大麻素II型受体（CB2）对低氧微环境调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）骨向分化的作用及其调控机制。方法：全骨髓细胞贴壁法分离培养rBMSCs。应用化学低氧剂CoCl2建立低氧模型,实时荧光定量PCR和Western blot检测成骨关键蛋白RUNX2、OCN在基因和蛋白水平的表达,评估骨向分化能力。进一步结合CB2抑制剂AM630探讨CB2在低氧微环境下介导rBMSCs骨向分化中的作用。结果：与对照组比,低氧处理24、48、72、96 h后rBMSCs的RUNX2、OCN mRNA和蛋白表达量显著上升（P＜0.05）;同时低氧处理上调CB2 mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。CB2抑制剂AM630下调低氧所促进的RUNX2、OCN的表达（P＜0.05）。结论：CB2参与低氧促进rBMSCs的成骨分化的调控。     

microRNA调控间充质干细胞成骨分化的研究进展

间充质干细胞是一类体内广泛存在的多能干细胞,具有多向分化潜能,为多种组织器官提供保护及损伤修复。近年来,间充质干细胞向成骨细胞诱导分化用于治疗骨代谢等相关性疾病已成为热点。microRNA（miRNA）作为生物体内重要的小分子非编码RNA,通过转录后调控影响基因表达,参与各种生命过程。研究显示,多种不同的miRNA在间充质干细胞向成骨分化过程中起着核心调节作用。本文结合相关文献,对miRNA调控间充质干细胞成骨分化的作用及机制归纳总结,以帮助全面了解靶向miRNA治疗骨代谢性相关疾病的潜能。     

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化

目的 通过成人脂肪体外分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）研究其生理特性及在特定培养条件下向成骨分化,探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景.方法 从成人脂肪中利用胶原酶消化法分离并体外培养干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,P3代脂肪干细胞通过成骨诱导液诱导向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP）,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OP）表达变化.结果 成人脂肪间质来源的ADSCs,能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞检测证实其特异表达相关干细胞表面标记物;成骨诱导后表现出呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性,茜素红染色阳性,诱导培养0、3、7、14、21、28天后RT-PCR定量检测证实细胞中ALP、OP阳性表达.结论 成人脂肪中可分离得到ADSCs,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向骨细胞分化,阳性表达OP、ALP,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源.     

低频脉冲电磁场增强骨形态发生蛋白9诱导牙周膜干细胞成骨分化作用

目的 探讨低频脉冲电磁场能否增强骨形态发生蛋白9（BMP9）诱导人牙周膜干细胞（PDLSC）成骨分化的作用。方法 培养健康人前磨牙牙周膜组织细胞，通过免疫磁珠分选后得到CD146⁺/STRO-1⁺细胞，即PDLSC。用携带过表达BMP9基因的重组腺病毒（Ad-GFP-BMP9）感染PDLSC，并暴露于频率为15Hz、磁场强度分别为0.6、1.2、1.8、2.4、3.0mT的脉冲电磁场进行干预（每12h辐照1h）。通过qRT-PCR和蛋白质印迹法检测Runt相关转录因子2（Runx2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）、骨钙蛋白（OCN）等成骨基因及蛋白表达量。结果 过表达BMP9基因可以促进PDLSC中成骨标志物Runx2、ALP、OCN、OPN的表达（P<0.05）。给予磁场强度分别为1.2、1.8、2.4、3.0mT的脉冲电磁场干预后，PDLSC内的成骨标志物表达水平均较单独BMP9时增高（P<0.05），并且在磁场强度为2.4mT时达到最高峰（P<0.05），表明低频脉冲电磁场可以增强BMP9诱导PDLSC成骨分化并且存在“窗口效应”。结论 磁场强度为1.8~3.0mT的15Hz脉冲电磁场可以体外增强BMP9诱导人PDLSC的成骨分化。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。