DNA适体筛选中双链DNA拆分方法研究

目的研究能够用于DNA适体筛选的双链DNA拆分方法。方法采用琼脂糖凝胶电泳,观察和比较λ核酸外切酶法、不对称PCR法、磁珠法以及琼脂糖凝胶法的拆分效果。结果琼脂糖凝胶电泳显示,λ核酸外切酶法不能充分拆分双链DNA形成单链DNA;不对称PCR法产生的非特异性单链DNA较多;磁珠法拆分双链DNA获得单链DNA的量较低,且成本较高;琼脂糖凝胶法拆分双链DNA较为充分,单链DNA纯度较高。结论琼脂糖凝胶法可用于DNA适体筛选中双链DNA的拆分。     

不同生物素检测系统在核酸分子杂交检测中的应用——Ⅱ 碱性磷酸酶标记亲和素及胶体金标记链霉亲和素检测系统

分别应用碱性磷酸酶标记亲和素和胶体金标记链霉亲和素对斑点杂交结果进行检测。通过提高溶液中离子浓度和pH值的方法基本消除了碱性磷酸酶标记亲和素与核酸的非特异结合,这一检测系统的检测敏感性可达到1pg。胶体金标记链霉亲和素的检测效果欠佳,仅为12.5ng。     

磁性纳米粒子与链霉亲和素的连接及初步应用

目的在磁性纳米粒子表面偶联上链霉亲和素,用于VEGF质粒的提纯.方法用缩合反应将链霉亲和素偶联在磁性纳米粒子上, NBT/BCIP显色法和放射性核素标记法测定链霉亲和素的连接;利用生物素和链霉亲和素的高亲和力将生物素连接的探针连接在磁性纳米粒子上,制备成三链螺旋磁性纳米粒子;修饰好的粒子从含有VEGF质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.结果显色反应证实链霉亲和素连接在磁性纳米粒子表面,核素标记法显示其结合率在室温时为2.5 μg/100 μg,65 ℃时为22.28 μg/100 μg;三链螺旋磁性纳米粒子可以提纯出质粒,且纯度较高.结论通过一定修饰的磁性纳米粒子可以从含有质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.     

磁性纳米粒子与链霉亲和素的连接及初步应用

目的在磁性纳米粒子表面偶联上链霉亲和素,用于VEGF质粒的提纯.方法用缩合反应将链霉亲和素偶联在磁性纳米粒子上, NBT/BCIP显色法和放射性核素标记法测定链霉亲和素的连接;利用生物素和链霉亲和素的高亲和力将生物素连接的探针连接在磁性纳米粒子上,制备成三链螺旋磁性纳米粒子;修饰好的粒子从含有VEGF质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.结果显色反应证实链霉亲和素连接在磁性纳米粒子表面,核素标记法显示其结合率在室温时为2.5 μg/100 μg,65 ℃时为22.28 μg/100 μg;三链螺旋磁性纳米粒子可以提纯出质粒,且纯度较高.结论通过一定修饰的磁性纳米粒子可以从含有质粒的细菌裂解上清液中提纯质粒.     

基于磁珠的可视化基因芯片在诺如病毒快速检测中的应用

目的建立可用于临床样本检测的基于磁珠的可视化基因芯片检测方法。方法在玻璃芯片上以链霉亲和素包被的磁珠作为标记物,采用生物素标记的核酸为样品,通过链霉亲和素与生物素的亲和作用,进行核酸杂交检测,杂交结果以肉眼或通过普通显微镜观测,验证方法的特异性、灵敏性及重复性。结果方法检测的灵敏度为50ng,特异性和重复性均较好;对20份临床粪便样本分别进行PCR和芯片检测,芯片检测结果与PCR方法检测结果一致。20份临床样本中,6份阳性,其中1份为诺如病毒Ⅰ型、5份为诺如病毒Ⅱ型,14份阴性。结论方法显示具有高效、实用和可视化的特点,可同时检测样品中含有的诺如病毒Ⅰ型、诺如病毒Ⅱ型;检测时间短,能够满足口岸诺如病毒的快速检测要求,具有较好的实用价值,对于进一步开发更多指标的微生物检测方法具有很好的示范作用。     

慢性髓细胞性白血病K562细胞适体的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定出慢性髓细胞性白血病（CML）K562细胞的寡核苷酸适体.方法：体外合成长度为88个碱基的随机单链DNA（ssDNA）文库,采用生物素-链霉亲和素磁珠法制备次级文库,以正常人血液中提取的中性粒细胞为反筛细胞,利用指数富集的配基系统进化（SELEX）技术筛选出与CMLK562细胞特异结合的适体.将筛选得到的适体回收纯化后连接pGEM-T质粒载体,经蓝白筛选后,随机挑选24个克隆子进行序列测定.采用荧光标记引物法检测ssDNA文库与K562细胞的亲和力,并用Clustal 2.05和DNA sis V2.5软件对适体序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测.结果：经过13轮循环筛选,CML K562细胞适体的A值从0.12上升到1.25,至第13轮A值无明显增高.一级结构分析无同源序列,但可分为6个家族,其中5个家族各自具有保守序列,家族6无保守序列.二级结构分析表明,适体形成的茎环、凸环结构可能是与K562细胞特异性结合的结构基础.结论：利用SELEX技术成功筛选出高亲和性的CML K562细胞适体.     

癌胚抗原单链抗体-链亲和素融和蛋白的功能鉴定

目的: 用pET21原核表达系统表达癌胚抗原单链抗体-链亲和素融合蛋白.方法: 融合表达载体转化大肠杆菌菌株HMS174(DE3),用1mmol/L的IPTG诱导表达,表达产物行亲和印迹及免疫斑点分析.结果: SDS-PAGE表明,融合蛋白分子质量约57ku,亲和印迹及免疫斑点证实融合蛋白具有结合CEA与生物素的双特异性.结论: 原核表达系统可以表达具有双特异性的融合蛋白,该融合蛋白利用生物素标记的辣根过氧化物酶可直接检测抗原.     

建立BioID-质谱联用技术筛选细胞内蛋白质相互作用

目的 通过BioID-质谱联用技术建立一种新的蛋白质相互作用的筛选系统,并采用免疫共沉淀-蛋白质印迹法验证与Yes相关蛋白1(YAP1)相互作用的蛋白质.方法 构建YAP1-BirA*融合表达质粒,将质粒转染进293T细胞后,在细胞培养基中加入50μmol/L生物素,继续培养24 h后提取细胞总蛋白质.利用YAP1特异抗体,采用蛋白质印迹法检测YAP1-BirA*融合蛋白的表达.利用HRP偶联的亲和素检测细胞内蛋白质被生物素标记的水平.通过亲和素磁珠对细胞内生物素化的蛋白质进行亲和纯化,多次洗涤去除亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白质后对亲和素磁珠纯化的蛋白质进行溶解.取40μg总蛋白行SDS-PAGE,然后采用蛋白质银染试剂盒对凝胶中的蛋白质进行染色,确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果.用非标记定量质谱法鉴定生物素化的蛋白质.针对鉴定得到的蛋白质,采用蛋白质印迹法对生物素化的SMAD家族成员3(SMAD3)进行验证.通过YAP1的免疫共沉淀-蛋白质印迹法确定SMAD3能否与YAP1相互作用.结果 成功构建YAP1-BirA*融合表达质粒,该质粒在293T细胞中能够高效表达融合蛋白.在生物素存在的情况下,YAP1-BirA*融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与YAP1-BirA*融合蛋白邻近的蛋白质.在细胞裂解后,这些在细胞内被生物素标记的蛋白质能够被偶联亲和素的磁珠纯化,经过多次洗涤,能够富集生物素标记的蛋白质.质谱鉴定显示,能够获得细胞内与YAP1在空间上相互靠近的蛋白质.免疫共沉淀-蛋白质印迹法结果证明SMAD3蛋白能与YAP1相互作用.结论 BioID-质谱联用方法是一种能用于蛋白质相互作用筛选的简单、高效技术,与免疫共沉淀-蛋白质印迹法联合使用可以成为一种新的蛋白质相互作用研究体系.     

用ELISA测定卵巢癌患者血清、腹腔液VEGF水平及其临床意义

目的测定卵巢癌患者血清、腹腔液血管内皮生长因子(VEGF)水平,并探讨其临床意义.方法采用酶链免疫吸附试验(ELISA)检测28例卵巢癌患者血清、腹腔液及卵巢癌细胞株SKOV3、3AO和原代培养卵巢癌细胞上清液中VEGF水平.结果卵巢癌患者血清VEGF中位值为463 2ng/L,腹腔液中位值为2630.5ng/L,腹腔液显著高于血清(U=58,P＜0.001),但两者无相关性(r=0.185,P＞0.05);卵巢癌细胞株SKOV3、3AO和原代培养卵巢癌细胞上清液有较高水平的VEGF蛋白分泌(171.5～16232.9pg/ml/106个细胞).结论卵巢癌患者腹腔局部VEGF水平较高,可能主要来源于癌细胞的分泌;阻断VEGF的作用可能是卵巢癌有效的治疗策略.     

血管内皮生长因子反义核苷酸对口腔鳞癌细胞的影响

目的探讨VEGF反义核酸对口腔鳞癌细胞的影响。方法利用脂质体将VEGF反义核酸导入口腔鳞癌KB细胞，采用ELISA法检测其培养上清液中的VEGF表达水平，用MTT检测肿瘤细胞生长状况，过氧化物酶的抗荧光素抗体法检测肿瘤细胞凋亡指数。结果经VEGF反义核酸处理后，肿瘤细胞的VEGF蛋白表达水平和细胞生长受到明显抑制，肿瘤细胞凋亡率显著增加。结论VEGF反义核酸通过阻止VEGF蛋白表达和促进细胞凋亡，对口腔鳞癌细胞有明显的抑制作用。     

尿素酶试验在结核分支杆菌耐药性测定中的应用

目的利用尿素酶试验的方法对结核分支杆菌的耐药性进行检测。方法采用液体结核分支杆菌的培养基加尿素和酚红指示剂，高压消毒灭菌，将分离纯培养鉴定的500株结核分支杆菌接种其中，再加入不同浓度的抗结核分支杆菌的药物进行培养。同时用传统的绝对浓度法对500株结核分支杆菌进行耐药性测定，观测并比较结果。结果500株尿素酶法与传统的绝对浓度法检测结核分支杆菌耐药性结果比较，差异无统计学意义（Χ^2=2．25，P〉O．10）。结论利用尿素酶试验对结核分支杆菌的耐药性进行检测，方法快速、简便，有临床实际意义。     

肝癌血清肿瘤标志物适配体的筛选及活性鉴定

目的:肝癌血清中含有已知和未知的标志物,可以作为SELEX筛选的靶标,获得一组已知和未知肝癌血清标志物的适配体,为肝癌早期诊断提供新的分子生物学检测方法。方法：收集50例经诊断证实为原发性肝癌患者的血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体。先将磁珠-正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠-肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD18-T载体连接进行转化、挑选单克隆团送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值)。结果：经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个。结论：特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-1、Seq-16、Seq-17、Seq-56、Seq-72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91%以上,为肝癌的早期诊断提供了新方法。     

适配子型压电石英晶体传感器探针固定方法的研究

目的 比较金膜表面两种探针固定法的优劣,选择适配子型压电传感器探针固定的最佳方法.方法 用巯基固定法及生物素-亲和素固定法将针对人IgE的适配子探针固定在压电传感器的金膜表面,对不同浓度IgE引起的频率变化进行检测.结果 与巯基法相比,生物素-亲和素法固定探针压电传感器频率下降更为明显,检出限低,线性范围宽,0.1～2.5 mg/L浓度范围内IgE浓度与频率变化呈明显的线性相关,相关系数0.994 5.结论 在压电基因传感器探针固定中效果良好的巯基法在适配子探针固定中并不适用,生物素-亲和素法在适配子压电传感器探针固定中有明显优势.     

TRIzol法与磁珠法用于丙型肝炎病毒RNA定量检测的比较

目的 比较TRIzol法与磁珠法对丙型肝炎病毒(HCV) RNA定量检测结果的影响.方法 收集117例丙型肝炎病毒感染阳性患者的血清及其基因分型信息.分别采用TRIzol法与磁珠法提取患者血清样本的HCVRNA,qPCR检测提取HCV RNA的病毒载量,分析两种提取方法所得HCV RNA检测结果的差异.结果 qPCR结果显示TRIzol法和磁珠法具有良好的线性相关性:y=0.978x+0.063(R2 =0.973).Bland-Altman统计分析显示TRIzol法提取的HCV RNA病毒载量对数值的平均值略低于磁珠法,但差异无统计学意义(P＞0.05).基因型分析结果显示1a、1b、2a、3a和6a基因型中两种提取方法差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 TRIzol法提取HCV RNA的定量检测结果和磁珠法相当,且成本低廉,可在国内广泛用于试剂盒的开发和HCV RNA临床检测.     

快速检测TOX、CMV IgG抗体的适配子型SPR传感器微阵列的初步构建

目的初步构建弓形虫(toxoplasma gondii,TOX)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)IgG抗体的适配子型SPR传感器微阵列的快速检测方法。方法采用SELEX技术筛选TOX、CMV IgG的适配子,并将其整合于SPR生物传感器实时在线分析系统,通过在传感器表面固定探针分子,对溶液中的TOX、CMV IgG进行杂交检测,并进一步研究该检测方法的稳定性与线性检范围。结果该新型快速检测方法能够实现对TOX、CMV IgG的实时检测,检测系统稳定性良好,八通道间检测时互不影响,线性检测范围为20～300μmol/L。结论该实验建立的快速检测方法,具有稳定性好等优点,SPR传感器技术结合适配子技术在临床诊断工作中有着广阔的应用前景。     

抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠的制备与鉴定

目的制备抗sHLA—Ⅰ免疫磁珠去除红细胞悬液和机采血小板中的sHLA—Ⅰ分子。方法将单克隆抗体W6／32以共价偶联的方式包被制备免疫磁珠,以FITC标记的羊抗鼠二抗标记磁珠,用流式细胞仪鉴定包被效果。取10例红细胞悬液和机采血小板上清和制备好的免疫磁珠孵育后移去磁珠,用ELISA检测吸附前后sHLA—Ⅰ浓度变化评价吸附效果。结果制备的抗sHLA—Ⅰ免疫磁珠包被效率约为75％。对红细胞悬液和机采血小板中sHLA—Ⅰ的吸附效果可达到84％和83％。结论采用单克隆抗体W6／32制备的免疫磁珠能有效去除红细胞悬液和机采血小板中的sHLA—Ⅰ分子,在改善临床输血安全方面有广阔的应用前景。     

三种血清尿素测定方法的比较

目的旨在找出三种测量尿素方法之间的异同处，以利于指导临床实验。方法在Beckman Coulter Synchron CX3上用尿素酶电极法，在Beckman Coulter Synchron CX4上用尿素酶速率法，在721分光光度计上用二乙酰一肟法，对这三种方法进行方法学比较。结果三种方法之间相关性良好。尿素酶电极法线性范围大于尿素酶速率法大于二乙酰一肟法。尿素酶电极法，尿素酶速率法精密度均明显大于二乙酰一肟法，尿素酶速率法的批内变异小于尿素酶电极法，而批间变异则大于尿素酶电极法。溶血对三种方法均有影响。结论三种方法均符合临床对尿素的检测要求，各有利弊，但尿素酶电极法准确、简便、快速、范围宽，应是未来尿素测量的发展方向。     

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV gp41抗原适配体

目的 通过消减SELEX技术筛选得到高特异性、强亲和力的HIV gp41抗原适配体,为HIV的早期诊断提供了新的检测技术.方法 以琼脂磁珠为载体,HIV gp41抗原为靶标分子,利用消减SELEX技术和实时定量-PCR技术,筛选得到HIV gp41抗原适配体.结果 通过6轮筛选,筛选得到的次级ssDNA库通过PCR扩增得到dsDNA,dsDNA与pMDTM 18载体链接,进行克隆、测序,获得4条HIV gp41抗原适配体.获得的4条适配体亲和力(Kd)均在纳摩尔水平,其中15号适配体的亲和力最强,特异性检测表明筛选得到的适配体几乎只与HIV gp41抗原结合,不与其他非特异性蛋白结合.结论 利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与HIV gp41抗原特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗HIV gp41抗原的能力.     

酚红比色法与电极法、酶法测定血清碳酸氢根的实验对比

目的比较酚红比色法、离子选择电极法、酶法三种全自动测定血清碳酸氢根方法的可靠性及临床应用,为临床方法的选择和实验结果的评价提供理论依据。方法依据美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）有关文件对三种方法的线性、精密度、回收试验、对照试验、干扰试验、试剂稳定性方面进行比较。结果酚红比色法与离子选择性电极法、酶法比较,相关系数分别为0.9822和0.9813,碳酸氢根测定浓度在15-45 mmol/L时的预期相对偏差均值分别为1.64%和1.59%。在11.0-50.3 mmol/L实验范围内,三种方法线性关系良好,酚红比色法线性回归方程为y=0.014x-0.078,r=1.000;酶法线性回归方程为y=0.012x＋0.015,r=0.9995;电极法线性回归方程为y=0.9869x-0.5876,r=0.9997。三种方法批内及批间不精密度均小于3.4%,平均回收率酚红比色法为99.2%,酶法99.1%,电极法100.1%。结论酚红比色法与电极法、酶法比较在线性、精密度、结果相关性方面均很好,具有可比性,且试剂稳定性和经济实用性明显优于酶法和电极法,是适合常规和急诊测定血清碳酸氢根的理想方法,值得推广应用。     

TRIzol法与磁珠法用于丙型肝炎病毒RNA定量检测的比较

目的 比较不同核酸提取方法TRIzol法与磁珠法对丙型肝炎病毒核酸（HCV RNA）定量检测结果的影响。 方法 收集117例丙型肝炎病毒感染阳性患者的血清及其基因分型信息。分别采用TRIzol法与磁珠法提取患者血清样本的HCV RNA,定量PCR检测提取HCV RNA的病毒载量,比较两种提取方法HCV RNA检测结果的差异性。 结果 定量PCR检测结果显示TRIzol法和磁珠法具有良好的线性相关性：y=0.978x+0.063（R2=0.973）。Bland-Altman统计分析显示TRIzol法的检测平均值略低于磁珠法,但无明显统计学差异（P>0.05）. 基因型分析显示1b、2a、3a和6a 亚型之间无显著性差异（P>0.05）.结论TRIzol提取法的HCV定量检测结果和磁珠法相当,且标本用量更少,成本低廉,可在国内广泛使用,且能更大范围地应用在试剂盒的开发和HCV RNA临床检测中。