高通量测序技术在临床医学中的应用进展

高通量测序技术(第二代测序技术)近年来取得快速发展,与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点,主要以454测序技术、Solexa测序技术以及SOLiD测序技术为代表。高通量测序技术在生命科学以及医学领域方面的研究越来越广泛,该文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况。     

基于高通量测序技术分析慢性牙周炎患者牙菌斑微生物多样性及群落结构

目的 采用16SrDNA高通量测序技术分析墨玉县口腔健康人群及慢性牙周炎人群的牙菌斑微生物群落结构特点及其差异性.方法 收集2018年8月在墨玉县体检的慢性牙周炎患者(20例)的牙菌斑样本为研究对象,以同时期体检口腔健康人群(15例)的牙菌斑样本为对照,通过Illumina MiSeq高通量测序技术(High-thro...     

糖尿病足感染病原微生物分布及风险预测模型的建立

目的 分析糖尿病足（DF）感染病原微生物分布特征,并建立DF感染风险预测模型。方法 选取2019年1月—2022年1月文昌市人民医收治的82例DF患者为研究对象,对其足部创面分泌物进行细菌培养,总结DF感染病原菌分布特点,多因素Logistic回归分析确定DF感染独立危险因素并建立风险预测模型,绘制受试者工作特征（ROC）曲线判断各独立指标与风险预警模型诊断的准确性,交叉验证法验证风险预警模型效能。结果 82例DF患者中有50例足部分泌物中分离出病原菌,共检出病原菌79株,其中革兰阳性菌37株（46.84%）,革兰阴性菌38株（48.10%）,真菌4株（5.06%）。多因素Logistic回归分析结果提示,DF病程［O^R=2.201（95% CI：1.754,2.763）］、周围神经病变［O^R=3.177（95% CI：1.518,6.652）］、白细胞计数（WBC） ［O^R=2.425（95% CI：1.512,3.890）］、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C） ［O^R=1.976（95% CI：1.481,2.636）］是DF感染的独立危险因素（P <0.05）。ROC曲线结果表明,DF病程、周围神经病变、WBC、LDL-C预测DF感染的曲线下面积（AUC）分别为0.665、0.659、0.685和0.645,敏感性分别为68.0%（0.538,0.841）、60.0%（0.563,0.794）、76.0%（0.550,0.882）和62.0%（0.512,0.803,特异性分别为68.7%（0.548,0.853）、71.9%（0.615,0.899）、59.4%（0.440,0.603）和62.5%（0.536,0.815）。将上述进入多因素Logistic回归模型变量的b作为系数,建立风险预警模型,Logit（P）=e^y/（1+e^y）,y =0.789×DF病程+1.156×周围神经病变+0.886×WBC+0.681×LDL-C-3.157。ROC曲线分析结果表明,风险预测模型AUC为0.908,截断值为0.513,敏感性及特异性分别为84.10%（0.651,0.917）和75.61%（0.579,0.855）。结论 DF感染率较高,但多为单一病原菌感染,DF病程、周围神经病变、WBC、LDL-C是DF感染的独立危险因素,以此为基础建立风险预测模型,便于临床快速准确筛查DF感染高危人群。     

基于16S rDNA高通量测序分析2型糖尿病腹泻患者肠道菌群的变化

目的 利用16S rDNA高通量测序技术,研究2型糖尿病腹泻患者肠道菌群的变化。方法 收集18例2型糖尿病腹泻患者和23例健康受试者的粪便样本,提取肠道菌群基因组,采用二代高通量基因测序技术,对16S rDNA V3～V4高变区进行扩增测序、生物信息学分析,比较两组人群肠道菌群结构和种类的差异。结果 Alpha多样性分析显示2型糖尿病腹泻患者肠道中菌群的丰度和多样性低于健康对照组,P<0.05。在门水平上,2型糖尿病腹泻患者组拟杆菌门占比低于健康组,P<0.05;而厚壁菌门,疣微菌门高于健康组,P均<0.05。另外,厚壁菌门/拟杆菌门比值,患者组高于健康组,P<0.05。在属水平上,2型糖尿病腹泻患者组中粪杆菌属低于健康对照组,P<0.05。结论 16S rDNA高通量测序技术有助于分析2型糖尿病腹泻患者肠道菌群多样性,为研究肠道菌群与2型糖尿病腹泻的关系提供新的思路和理论依据。     

高通量测序技术在白血病临床应用中的研究进展

高通量测序技术的迅速发展不仅为功能基因组学的研究提供了高效的平台,还在临床肿瘤、精准医学领域呈现出巨大的应用价值.高通量测序技术以通量高、成本低、精确度高、信息量丰富等特点被广泛应用于白血病的临床研究,在揭示肿瘤的异质性、追踪细胞谱系、探索肿瘤克隆演变的复杂机制研究中发挥着重要作用,且在白血病的预后分层、辅助诊断、靶向...     

基于高通量测序分析头颈肿瘤中CircRNAs的表达谱差异

目的 基于高通量测序分析头颈肿瘤(HNC)中环状RNA(CircRNAs)的表达谱差异,探究其临床应用价值.方法 通过高通量测序、基因本体和KEGG通路分析检测18例HNC患者的肿瘤组织及癌旁组织中CircRNAs的表达及其功能.采用实时荧光定量PCR验证部分CircRNAs在137例HNC组织及癌旁组织中的差异表达,...     

高通量测序法研究不同pH的饮用水对SPF小鼠肠道微生物的影响

目的研究不同pH饮用水对SPF小鼠肠道微生物多样性的影响。方法 21日龄SPF小鼠90只随机分成3组,每组30只,分别给予三类水,即酸化水(pH 3.0),中性水(pH 7.0)和碱性水(pH 9.0),并进行为期三个月的饲养。每组分别在饲养4周、8周、12周末各处死10只动物,取血清按SPF国标项目检测了细菌、病毒、寄生虫,取回盲部内容物,根据细菌16S rRNA的保守性设计引物,构建文库,进行高通量(Illumina)测序,获得10 G的数据,并对数据进行统计,聚类分析。结果以pH 3.0处理的小鼠肠道微生物丰富度适中,稳定性高。结论在规模化饲养条件下,选取pH 3.0饮用水小鼠能较长时间维持肠道微生物多样性,稳定性达到一个平台。本研究为长期稳定维持动物质量的生产实践提供了理论与技术支持,也是胃肠道宏基因组学技术在动物质量控制领域的一个具体应用。     

高通量测序分析肠易激综合征患者和健康人肠道菌群差异

目的 通过高通量测序方法分析肠易激综合征患者(Irritable Bowel Syndrome,IBS)和健康人肠道菌群差异.方法 采用Illumima系统MiSeq平台对正常组和IBS组粪便进行16S rRNA测序.结果 IBS患者的肠道菌群多样性无显著变化.在门水平上,Firmicutes丰度显著增加(P<0.01),Bacteroidete的丰度和Bacteroidetes/Firmicutes的比值下降.在科水平上,正常组和IBS组粪便肠道菌群中检测到Cryomorphaceae、Erysipelotrichaceae、Campylobacteraceae和Fibrobacteraceae,且丰度变化具有显著差异(P<0.05).结论 IBS患者和健康人相比,肠道菌群多样性未见明显差异.但某些细菌菌种存在显著差异.     

16SrRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的：运用16SrRNA基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法：提取细菌DNA,采用通用引物PcR扩增16SrRNA基因片段并测序。将测序结果用Blastn在线软件在Nucleotide数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果：12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。结论：16SrRNA基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

16S rRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的: 运用16S rRNA 基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法: 提取细菌DNA,采用通用引物PCR扩增16S rRNA 基因片段并测序。将测序结果用Blastn 在线软件在Nucleotide 数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果: 12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。 结论: 16S rRNA 基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

16S rRNA在检测肺炎克雷伯菌引起血流感染中的应用

目的初步建立一种对肺炎克雷伯菌引起血流感染的快速检测方法。方法应用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）,从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以特异性引物扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定的对照。结果检测142份已知肺炎克雷伯阳性标本,65份非肺炎克雷伯阴性对照,52份双盲样本显示敏感性为100%（146/146）特异性为100%（113/113）,整个实验可在2h内完成。结论较传统的培养鉴定法而言,以16SrRNA作为实时荧光定量靶基因可快速检测肺炎克雷伯菌,具有很好的研究价值与应用前景。     

16SrRNA序列分析技术对临床标本中疑难细菌的鉴定

目的：应用16S rRNA序列分析技术鉴定临床少见或疑难细菌,提高细菌鉴定的准确性。方法收集临床少见或疑难细菌44株,提取DNA,采用通用引物进行PCR扩增及目的片段基因测序,并将测序结果在核酸数据库中比对分析以确定菌种。结果44株临床少见或疑难细菌均扩增到16S rRNA目的基因片段并成功测序,40株(90．9%)鉴定到“种”,4株(9．1%)鉴定到“属”;其中常规方法与测序方法在“属”水平一致的有34株(77．3%),不一致的有10株(22．7%)。结论16S rRNA序列分析技术可以准确、快速地鉴定临床少见或疑难细菌,可以作为临床细菌鉴定的重要方法之一。     

多重PCR检测唾液标本中的幽门螺杆菌16S rRNA及cagA基因

目的 检测唾液标本幽门螺杆菌（Hp）的16S rRNA基因及cagA基因,了解消化道疾病患者口腔中Hp存在情况及致病情况。方法 利用生物学信息技术,设计Hp 16S rRNA、cagA基因特异性引物,建立检测Hp 16S rRNA、cagA基因的多重PCR方法;重组克隆质粒构建标准阳性对照品;收集156例消化道疾病患者的唾液标本,提取唾液标本中细菌DNA,应用建立的多重PCR方法,检测Hp 16S rRNA基因及cagA基因,并对结果进行分析。结果 建立的检测Hp 16S rRNA基因及cagA基因的多重PCR方法特异性强,灵敏性较高,最低检测线为103 copies· μL-1;重组质粒pGMT-16s和pGMT-cagA,可作为鉴定Hp的标准阳性对照品;检测Hp感染的消化道疾病患者的唾液标本,口腔携带Hp 16S rRNA基因的阳性率为87.2%,cagA基因阳性率为23.1%。结论 Hp感染的消化道疾病患者口腔唾液标本中存在Hp,口腔中存在Hp可能是诱发消化道Hp感染及治疗后复发的一个重要原因。     

16S-23S rRNA基因区间细菌鉴定实验研究

目的 :探讨 16 S- 2 3S r RNA基因区间对细菌鉴定的应用。方法 :以 16 S- 2 3S r RNA基因区间为靶序列设计引物 ,采用聚合酶链反应检测标准菌株及临床菌株 DNA。结果 :对 2 7株代表 2 7个菌种的标准菌株进行 PCR扩增 ,分别出现不同的 DNA图谱 ,该图谱能直接或经核酸内切酶处理后用于细菌分类 ,敏感性可达 2 .5 CFU/ml的细菌 ,与人外周血白细胞 DNA和真菌及病毒无交叉。 32株临床细菌标本均扩增出与相应标准菌株一致的图谱。结论 :16 S- 2 3S r RNA基因区间 PCR扩增技术检测细菌 ,具有敏感、特异、快速、准确的优点 ,为临床败血症病原的快速诊断提供了新的方法     

16S rRNA基因检测在新生儿败血症早期诊断中的研究进展

新生儿败血症是新生儿期的常见病及危重症,是导致新生儿期死亡的重要原因之一。由于该症早期缺乏特异性的临床症状,所以选择敏感、快速的检测细菌方法具有重要意义。近年来,国内外学者应用分子生物学技术进行细菌分类、鉴定,为新生儿败血症的早期诊断提供了极有前途的检测方法。细菌16S rRNA基因所具有的结构特征,使其成为细菌鉴定的最常用的部位。本文就该基因的特征、检测方法及临床应用与研究的新进展简要综述。     

肝硬化失代偿期患者腹水、胸水及血液中16S rRNA基因检测

为寻找诊断肝硬化失代偿期并发自发性腹膜炎、胸膜炎和败血症时检测病原菌的方法。采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增真细菌域的１６ＳｒＲＮＡ基因，与Ｇｒａｍ阴性和Ｇｒａｍ阳性特异探针杂交检测肝硬化失代偿期患者胸腹水和血液中的致病菌。结果：ＰＣＲ腹水检测病原菌的阳性率９１４％；Ｇｒａｍ阴性探针斑点杂交（Ｄｏｔｂｌｏｔ）阳性率１００％；Ｇｒａｍ阳性杂交阳性率２１７％，高于细菌培养和鲎试验。结果提示：用ＰＣＲＤｏｔＢｌｏｔ杂交法检测病原菌的１６ＳｒＲＮＡ基因是诊断肝硬化自发性腹膜炎、胸膜炎和败血症等各种细菌感染的一种新方法     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。