PCR和实时荧光PCR方法检测华支睾吸虫

目的利用PCR技术建立快速、灵敏、特异的检测华支睾吸虫的方法，比较PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性，探讨其在华支睾吸虫检测中的应用。方法根据华支睾吸虫的特异性基因序列，设计了PCR引物及实时荧光PCR的特异性引物和探针，分别进行灵敏性和特异性试验。结果设计的引物能够扩增华支睾吸虫，而且探针的特异性很高。实时荧光PCR对华支睾吸虫的最低检测浓度为3fg/ul，实时荧光PCR的灵敏性比常规PCR高2个数量级。结论PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的准确性和特异性均高，操作简便，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段和方法依据。     

实时荧光定量PCR检测胆囊结石中华支睾吸虫DNA的研究

目的运用基于Taqman探针实时荧光定量PCR技术检测胆囊结石中的华支睾吸虫DNA。方法选取2012年3～4月份40例实施内镜取石保胆手术患者的胆囊结石,通过傅里叶红外光谱法分析结石成分,对结石研磨涂片镜检观察,并提取其DNA,运用实时荧光定量PCR技术检测华支睾吸虫基因。结果 40例患者的胆囊结石按主要成分可分为胆色素性结石(25例),胆固醇性结石(6例),混合性结石(9例)。结石涂片镜检有23例发现华支睾吸虫虫卵(阳性率57.5%),其中胆色素性结石19例,混合性结石4例。实时荧光定量PCR检测华支睾吸虫DNA阳性率为65.0%(26/40),其中包括23例镜检虫卵阳性标本及3例镜检阴性标本。结论运用实时荧光定量PCR在胆囊结石中检测出华支睾吸虫DNA,敏感性高于镜检法查虫卵。这不仅为华支睾吸虫感染诱发胆囊结石形成提供了分子生物学证据,同时也提供了一种诊断华支睾吸虫感染的有效手段,对胆囊结石病人的病因诊断、临床治疗以及术后预防复发等具有重要的指导意义。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10 拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列，设计、合成、筛选特异性引物和探针，建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测敏感性；分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测特异性；通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增，初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法，其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板，该方法最低检出限为10 拷贝/μL；以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板，该方法最低检出限为3 pg/μL；以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板，检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本，具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

淡水鱼华支睾吸虫囊蚴 LAMP 检测方法的建立

目的 建立一种高效灵敏的环介导等温扩增(LAMP)方法检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴。 方法 以华支睾吸虫 ITS2 基因序列为靶序列,合成 Cs-1、Cs-2、Cs-3 三组 LAMP 引物体系。 以华支睾吸虫囊蚴 DNA 样本为模板,日本血吸虫成虫、带绦虫成虫、蛔虫虫卵及其他吸虫囊蚴 DNA 样本为参考,比较三组引物体系的特异度;以不同浓度的华支睾吸虫成虫基因组 DNA 为模板,比较三组引物体系的灵敏度;用 LAMP 法及 PCR 法平行检测 16 份华支睾吸虫囊蚴样本和 23 份其他吸虫囊蚴样本,评价 LAMP 法的敏感性和特异性。 结果 三组引物体系的灵敏度及特异度以 Cs-3 为最优,以其建立的 LAMP 法反应体系,检测华支睾吸虫成虫 DNA 的最低检出浓度可达到 3. 33×10^-4ng / μL,敏感性和特异性与 PCR 法一致,均为 100%。 结论 成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的 LAMP 方法,为淡水鱼寄生虫病监测工作提供了便捷高效的检测手段。     

基于线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1基因鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的双重PCR法的建立

分别提取华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的基因组DNA,针对两种吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1(COX1)基因设计引物,进行单重和双重PCR扩增。用针对华支睾吸虫的3对引物进行单重PCR扩增,FC1/RC1和FC3/RC3引物分别扩增出328 bp和356 bp的特异性目的条带,而FC2/RC2引物未扩增出任何条带;用针对扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物进行单重PCR扩增,分别扩增出200 bp和190 bp的特异性目的条带。用华支睾吸虫FC1/RC1引物,结合扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物,分别进行双重PCR扩增,均能扩增出特异性条带,彼此间无干扰。     

重组抗原应用于SPG-ELISA检测华支睾吸虫循环抗体的效果评价

目的评价重组抗原用于SPG-ELISA诊断华支睾吸虫感染的价值。方法分别使用重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（Cs-CysB）与华支睾吸虫成虫可溶性抗原（CAA）,以SPG-ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG,比较两种抗原包被SPG-ELISA方法的敏感性与特异性。结果检测50份华支睾吸虫感染者血清,重组Cs-CysB与CAA包被的SPG-ELISA阳性率均为94.00%,健康人血清50例均为阴性;检测日本血吸虫病血清20份、并殖吸虫病血清20份、囊虫病血清10份,交叉反应率分别为5.00%、10.00%、20.00%和5.00%、0、20.00%。结论以重组Cs-CysB为包被抗原用SPG-ELISA检测血清华支睾吸虫抗体具有较高的敏感性及特异性,检测效果与CAA包被的SPG-ELISA相当。     

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测淡水鱼华支睾吸虫囊蚴的初步应用

目的 评价重组酶介导的核酸等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)用于淡水鱼肉样本中华支睾吸虫囊蚴检测效果，为后续该方法标准化及现场应用提供科学依据。方法 2022年6—9月在江苏省泰州市姜堰区、兴化市、泰兴市华支睾吸虫感染阳性人群所在行政村河道内采集野生淡水鱼样本。取6份不含华支睾吸虫囊蚴的鱼肉组织(每份5 g)，分别加入0、1、2、4、8、16个华支睾吸虫嚢蚴，提取鱼肉组织基因组DNA后采用荧光RAA法进行检测，评价该方法检测灵敏度；分别以华支睾吸虫、东方次睾吸虫、钩棘单睾吸虫、台湾棘带吸虫嚢蚴基因组DNA为模板，采用荧光RAA法检测，评价其交叉反应；分别采用荧光RAA法和压片法检测现场采集的淡水鱼样本，比较两种方法检测华支睾吸虫效果。结果 含1、2、4、8、16个华支睾吸虫囊蚴的鱼肉组织样本均出现阳性扩增，荧光RAA法可在20 min内对5 g鱼肉组织中含1个华支睾吸虫囊蚴的样本实现阳性扩增；以东方次睾吸虫、钩棘单睾吸虫、台湾棘带吸虫嚢蚴基因组DNA为模板进行RAA检测，结果均为阴性。对采集的1 735条淡水鱼分别采用荧光RAA法和压...     

改良加藤厚涂片法和PCR法检测华支睾吸虫感染的 效果比较

目的　比较改良加藤厚涂片法（Kato?Katz法）和PCR法对现场人群粪便样本中华支睾吸虫感染的检出率,为华支睾吸虫感染检测方法的选择提供依据。方法　在2016年广西壮族自治区藤县人体华支睾吸虫感染流行病学调查的基础上,随机抽取133份粪便样本,-20 ℃保存。分别采用Kato?Katz法（1粪3检）和PCR法检测华支睾吸虫感染,比较两种方法对华支睾吸虫感染的检出率,采用Kappa分析评价两种检测方法结果的一致性。结果　133份人群粪便样本中,华支睾吸虫感染总检出率为77.44%（103/133）,其中Kato?Katz法检出率为57.14%（76/133）,PCR法检出率为70.68%（93/133）, PCR法检出率显著高于Kato?Katz法（[χ2] = 26.15,P <0.01）。76份Kato?Katz法阳性粪便样本中,88.16%（67/76）的样本PCR法扩增阳性;57份Kato?Katz法阴性样本中,47.37%（27/57）的样本PCR法扩增阳性。PCR法对每g粪便虫卵数（EPG）> 1 000的粪便样本中华支睾吸虫感染的检出率（94.7%,18/19）高于EPG < 1 000的样本（85.96%,49/57）,但差异无统计学意义([χ2] = 1.05,P = 0.436)。两种方法检出率一致性检验结果一般（Kappa = 0.73）。结论　PCR法对人群华支睾吸虫感染的检出率显著高于Kato?Katz法。建议在华支睾吸虫感染度较轻的地区,采用Kato?Katz法结合PCR法进行检测,以提高检出率。     

检测华支睾吸虫特异性IgG4生物素-亲和素复合酶联免疫吸附法的建立及检测效能分析

目的探讨亲和素-生物素复合酶联免疫吸附法(ABC-ELISA)检测特异性Ig G4抗体用于诊断华支睾吸虫病的效果。方法建立检测华支睾吸虫特异性抗体Ig G4的ABC-ELISA法(Ig G4-ABC-ELISA),以此方法检测华支睾吸虫病、日本血吸虫病、卫氏并殖吸虫病、弓形虫病、棘球蚴病、囊尾蚴病和曼氏裂头蚴病患者血清样本。以Ig G4-ELISA和Ig GELISA法为对照,比较3种方法用于诊断华支睾吸虫病的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及诊断效率。结果成功建立了用于检测华支睾吸虫特异性抗体的Ig G4-ABC-ELISA法,用此方法检测华支睾吸虫病患者血清特异性抗体Ig G4的敏感性为90.0%,特异性为98.2%,阳性预测值为93.8%,阴性预测值为97.0%,诊断效率为96.3%;Ig G4-ELISA法检测华支睾吸虫病患者血清特异性抗体敏感性为86.0%,特异性为98.2%,阳性预测值为93.5%,阴性预测值为95.9%,诊断效率为95.4%;Ig G-ELISA法检测华支睾吸虫病患者血清特异性抗体Ig G的敏感性为94.0%,特异性为88.1%,阳性预测值为70.1%,阴性预测值为98.0%,诊断效率为89.4%。Ig G4-ABC-ELISA法检测华支睾吸虫病患者血清特异性抗体的敏感性高于Ig G4-ELISA法(P0.05),特异性高于Ig G-ELISA法(P0.05)。结论 Ig G4-ABC-ELISA法检测华支睾吸虫特异性抗体IgG4具有高度敏感性与特异性,在华支睾吸虫病诊断中具有较好应用价值。     

基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立一种方便快捷的检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法。方法根据GenBank公布的微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对引物,通过质粒DNA和卵囊检测标准曲线的绘制及特异性和重复性的研究,建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法,进而对奶牛粪便进行检测。结果建立的Real-time PCR法对检测微小隐孢子虫具有很高的特异性,质粒DNA和卵囊的检测阈值分别达到1个拷贝和10个卵囊,奶牛粪便阳性率为25.93%（21/81）,高于普通PCR检测率20.99%（17/80）。结论建立的Real-timePCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于微小隐孢子虫的快速定量检测。     

荧光定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究

目的利用LightCycler建立一种简便、特异的实时荧光定量PCR检测方法,用于炭疽芽孢杆菌的快速检测。方法采用SYBR GreenⅠ随机掺入法,利用本实验室建立的实时荧光定量PCR反应体系,根据炭疽芽孢杆菌荚膜和水肿因子设计引物,同时检测两个毒力相关质粒的存在,检测其灵敏度和特异性,并以盲测试验进行验证;在此基础上鉴定14株炭疽芽孢杆菌,并测试该法检测土壤模拟污染标本的灵敏度,实验中设置内对照以排除假阴性结果的存在。结果炭疽杆菌基因组DNA的检测灵敏度可达每反应体系0.53pg,两个克隆株提取质粒的检测限分别为每反应体系12拷贝、140拷贝;检测14株炭疽芽孢杆菌及29株非炭疽芽孢杆菌的PCR扩增结果表明,炭疽芽孢菌DNA均出现特异的扩增结果,29株对照菌的DNA均为阴性;土壤模拟污染标本检测灵敏度可达每反应体系36个芽孢;20次重复实验结果表明其平均值与标准差为14.602±0.640。结论该方法检测炭疽芽孢杆菌具有简便、快捷、灵敏度高和特异性好的特点,为临床诊断、环境监测、卫生防疫等方面,快速检出炭疽芽孢杆菌提供了有利的手段。     

OmpA-VS2为靶基因的非标记实时荧光PCR检测沙眼衣原体感染

目的建立一种以OmpA-VS2为靶基因的非标记实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,以检测沙眼衣原体。方法设计15种型别沙眼衣原体通用引物,对OmpA-VS2进行套式PCR扩增和实时荧光PCR检测,并对其敏感性、特异性进行评价,并用临床标本进行验证。结果15种型别沙眼衣原体均扩增出168bp的目的片段;敏感性为每个反应1个拷贝。特异性分析可见,与10种泌尿生殖道病原体和共生菌均没有交叉反应。临床标本验证的结果显示,该方法与以质粒为靶基因的核酸扩增检测的Amplicor CT/NG方法的检测结果一致。结论该方法具有敏感性高、特异性强、扩增后无需PCR后处理等特点,可望用于临床与防治项目中沙眼衣原体的检测。     

鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测。方法以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法。结果循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102-1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989。该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍。结论本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测。     

实时荧光PCR检测棘球绦虫方法的建立及应用

目的 为了高效检测棘球绦虫(Echinococcus).方法 针对棘球绦虫的线粒体基因高度同源区域设计特异性引物和探针,建立了一种检测棘球绦虫的荧光PCR检测方法.在优化反应条件并测试灵敏度和特异性之后进行样本检测.结果 该方法有较高的灵敏度,检测质粒浓度极限为10 copies/μL;特异性好,未见非特异性扩增;应用...     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的建立一种快速廉价的检测空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR方法。方法根据空肠弯曲菌flaA、gyrA基因设计引物,建立空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法。结果以flaA基因引物对空肠弯曲菌DNA进行实时荧光定量PCR,扩增曲线呈S形指数增长,大肠埃希菌等对照菌扩增阴性。方法的灵敏度为10CFU/ml菌悬液。结论建立的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、准确等特点,具有一定的使用价值。     

荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 ,适用于鼠疫紧急疫情时的快速诊断和疫源地监测     

阪崎肠杆菌实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系。方法根据阪崎肠杆菌基因组16SrRNA～23SrRNA的内部转录间隔区（ITS）基因和外膜蛋白A（OmpA）基因的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系对阪崎肠杆菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对阪崎肠杆菌基因组的检测灵敏度为4×10-1pg/反应体系;该检测体系在检测50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan PCR检测体系可作为阪崎肠杆菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时检测阪崎肠杆菌的致病力。     

检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)方法。方法根据贝氏柯克斯体特异的23SrRNA插入基因序列设计引物和探针,以克隆的23SrRNA插入基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体,检出结果均为0。用荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体感染的小鼠脾脏标本,脾脏中贝氏柯克斯体的感染量与感染过程具有相关性。结论本研究建立的检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合样本中微量贝氏柯克斯体DNA的检测,其定量检测可用于动物实验中的贝氏柯克斯体感染程度的分析。     

香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术研究

目的利用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法,建立一种简便,快速,特异,灵敏的香港海鸥型菌检测方法.方法 根据香港海鸥型菌16S rDNA的保守区域设计特异性引物和探针.用不同浓度,不同温度对反应体系引物浓度,探针浓度及退火温度进行优化.用添加已知量的香港海鸥型菌样本验证方法敏感性;用香港海鸥型菌以及大肠杆菌,沙门菌,副溶血性弧菌,金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性和稳定性.结果 当25 μL反应体系中上,下游引物(10 μmol/L)各为0.6 μL,探针(10 μmol/L)为0.4 μL,模板DNA量为5.0 μL,反应条件:预变性95 ℃ 20 s ,变性95 ℃10 s,退火57 ℃ 40 s,40个循环时,香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系[Ct=-3.538×log(菌浓度)+13.56,r=0.999],方法的最低检测浓度达到36 cfu/mL.23株香港海鸥型菌检测Ct值均小于35,而104株非香港海鸥型菌检测Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线.隔天连续5 d重复试验Ct值变异系数小于3.20件活鲤鱼,18件活草鱼香港海鸥型菌检测率实时荧光PCR检测技术显著高于常规检测方法(P <0.01,χ²=21.50).且后者所需时间为5 d,前者仅需10 h.结论 TaqMan实时荧光定量PCR法是一种快速简便,特异性强,灵敏度高的香港海鸥型菌检测方法,值得推广应用.