人survivin基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人survivin基因反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术。用SacⅠ和SacⅡ双酶切pGEM-T Easy-survivin．然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点。最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将目的片段成功的连接到pIRES2-EGFP上。结论 成功地将survivin目的片段反向插入到pIRES2-EGFP中，构建了人survivin反义真核表达裁体pIRES2-EGFP-survivin。     

携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα基因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论成功构建重组质粒phPPARα-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。     

异种移植模型转人a1,2岩藻糖基转移酶基因小鼠显微注射DNA片段的制备

目的制备转人琢1,2岩藻糖基转移酶(HT)基因小鼠显微注射DNA片段。方法引物两端设计酶切识别位点,聚合酶链反应(PCR)扩增HTcDNA全长序列,两端含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切识序列;回收HTcDNA片段并与PMD18-T载体连接,EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切纯化质粒鉴定;EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pMD18-HTcDNA重组质粒和pCMV-MCS质粒,回收HTcDNA片段和pCMV-MCS质粒片段,进而连接,转化感受态细菌,纯化质粒对其进行酶切、PCR和测序鉴定;PvuⅠ和NotⅠ依次单酶切重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,回收大小约2.85kb片段,溶于适量显微注射用缓冲液。结果成功构建了重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,酶切回收了2.85kb的显微注射DNA片段。结论通过基因工程技术可以获得转人HT基因小鼠显微注射DNA片段,包含基因表达元件,可以用于显微注射法建立转人HT基因小鼠。     

Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体的构建和鉴定

目的构建和鉴定Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体。方法用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连于pTRE-shuttle2质粒的EcoRⅠ酶切位点,经EcoRⅠ酶切鉴定。亚克隆重组质粒片段于腺病毒载体Adeno-XTM,构建重组Adeno-X-hTERT,以PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切、聚合酶链反应(PCR)以及进一步测序鉴定其方向。结果重组质粒经EcoRⅠ酶切后得到预期的3.5、0.88、3.55kb大小的3条片段,重组腺病毒载体经PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切,出现预期32.6、5.09kb片段,与理论计算值完全一致,PCR及测序结果进一步确认了结构与方向的正确性。结论成功构建了Tet-on系统调控人端粒酶催化亚单位基因hTERT的重组腺病毒表达载体。     

中介素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建带有绿色荧光蛋白的中介素(IMD)真核表达质粒pIRES2-EGFP/IMD,并转染大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E)。方法合成带有IMD基因片段的pMD19-TSimple/IMD质粒,将pMD19-TSimple/IMD质粒和pIRES2-EGFP载体双酶切之后进行高效连接,将IMD亚克隆至pIRES2-EGFP上,对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用FuGENEHD转染试剂转染NRK-52E细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白。提取细胞mRNA和蛋白,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测基因表达,Western检测IMD蛋白表达。结果经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/IMD载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的NRK-52E细胞有绿色荧光蛋白的表达,经RT-PCR和Western测定分析,转染细胞IMD基因及蛋白的表达增加。结论pIRES2-EGFP/IMD载体构建成功,并在NRK-52E细胞内成功表达。     

双启动子shRNA真核表达载体的构建

目的:构建含有双启动子的shRNA真核表达载体.方法:通过PCR分别扩增带有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点的人U6启动子序列(U6-B/E)和带有Bgl Ⅱ、HindⅢ酶切位点的人U6启动子序列(U6-B/H),用BamH Ⅰ与EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1(+)与PCR产物U6-B/E后进行连接,重组质粒命名为psPRO.再用BglⅡ与HindⅢ双酶切psPRO与PCR产物U6-B/H后进行连接,构建含有双启动子的shRNA真核表达载体.结果:酶切鉴定以及DNA测序结果显示载体构建成功.结论:构建双启动子的shRNA真核表达载体,使其在细胞中表达2个不同的siRNA,不仅筛选方便,而且可以通过建立这种模式化工具载体,为今后RNA干扰实验研究的开展和深入提供手段.     

重组真核质粒pERFP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)的构建和表达

目的:将人类Tudor-SN蛋白SN(1～4)基因片段分别定向连入pERFP-C1质粒,使Tudor-SN蛋白SN各功能片段与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pERFP-C1载体上,再将构建成功的pERFP-C1-Tudor-SN-SN(1～4)重组质粒转染入HeLa细胞内,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜下观察到红色融合蛋白的表达。结论:重组pERFP-C1-h Tudor-SN-SN(1～4)质粒构建及表达成功。     

NEDD4-1 shRNA真核表达质粒的构建和鉴定

目的：设计并构建靶向NEDD4-1基因shRNA真核表达质粒。方法：依据靶基因序列设计siRNA,克隆入pGPU6/GFP/Neo载体U6启动子的下游,建立shRNA表达质粒系统,采用酶切法和测序法进行鉴定。结果：将重组NEDD4-1 shRNA用BamHⅠ和PstⅠ内切酶分别单酶切。经酶切鉴定、测序分析,序列完全正确。结论：成功构建NEDD4-1 shRNA真核表达质粒,为进一步研究NEDD4-1在胶质瘤发生和发展中的作用提供实验基础。     

双酶切和无缝克隆方法构建HCV CORE表达载体的比较

目的以PLVX-IRES-ZsGreen1为载体骨架,通过双酶切方法和无缝克隆方法构建HCV CORE真核表达载体,比较2种不同载体构建方法的优缺点,以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方法使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶分别酶切PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因聚合酶链反应(PCR)片段,形成带有相同黏性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,转化菌涂在含氨苄青霉素的固体培养基中进行阳性单克隆筛选并测序。无缝克隆方法利用同源重组的原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经XhoⅠ酶切的PLVX-IRES-ZsGreen1线性载体重组连接,连接产物同样转化入感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果跟双酶切载体构建方法比较,同源重组法步骤相对简单,可以更高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。结论同源重组法可更高效地构建载体,但假阳性率高。     

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。     

含MGMT及增强荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因,测序鉴定正确后构建含增强荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体.方法 利用RT-PCR从人正常肝细胞中克隆MGMT并与克隆载体pGEM-T载体相连接.经PCR、酶切及测序鉴定证明克隆成功后用限制性内切酶切下MG-MT片段,同时酶切载体pIRES2-EGFP.凝胶纯化回收后重组构建真核表达载体并鉴定.结果 测序结果显示所克隆的编码序列与GeneBank公布MGMT cDNA序列一致.真核表达载体的PCR及酶切鉴定结果与预期结果一致.结论 成功克隆了耐药基因MGMT并构建了含EGFP编码序列的真核表达载体pIRES2-MGMT-EGFP,为MGMT的进一步相关研究奠定了坚实基础.     

弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的 :体外扩增弓形体主要表面抗原 SAG1基因 ,构建 pc DNA3- SAG1真核表达质粒 ,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法 :采用 PCR技术 ,自行设计一对寡核酸引物 (P1,P2 ) ,从弓形体 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用 Eco R1和 Hind 双酶切后 ,克隆到真核表达质粒 pc DNA3中 ,转化入大肠杆菌 TG1,用氨苄青霉素和 PCR初筛 ,将 PCR扩增阳性的重组子分别用 Sac1单酶切、Eco R1和 Hind 双酶切鉴定。结果成功地构建真核型表达质粒 pc DNA 3- SAG1,从而为进一步 SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果 :从 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码 SAG1的全基因序列 ,扩增目的基因片段大小与预期长度(10 2 5 bp) ,相符 ;将分离、纯化的目的基因片段 SAG1插入 pc DNA3质粒 Hind 和 Eco R1位点 ,构建重组质粒pc DNA3- SAG1。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1     

凋亡素基因的克隆及其原核表达

目的建立凋亡素基因克隆及原核表达的方法。方法根据已报道的鸡贫血病毒凋亡素基因设计合成一对引物 ,通过PCR扩增 ,构建重组质粒pUC18 VP3,将其与pET30质粒分别用限制性内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ消化 ,构建原核表达载体pET30 VP3,用以转化感受态的E .coliDE3,经IPTG化学诱导表达 ,表达产物进行SDS PAGE电泳鉴定。结果凋亡素基因在E .coliDE3中获得了大量表达。结论该结果对凋亡素进一步开发为抗肿瘤新药具有重要意义。     

麻疹H基因克隆及表达条件优化

目的克隆麻疹H蛋白基因,构建重组表达质粒,诱导表达蛋白。方法麻疹Edmonston株减毒活疫苗中提取基因组RNA,RT-PCR扩增H基因。用限制性内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切H蛋白基因片段和pET30a(+)载体,连接后获得重组质粒MV-H-pET30a(+),转化至BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果 RT-PCR扩增片段长度约为1900bp,与MV-H基因相符。MV-H-pET30a(+)测序结果显示:MV-H基因对码正确,核苷酸序列符合率达99.7%。SDS-PAGE结果表明,菌体中含有特异性蛋白,大小约为86kD。结论在pET30a(+)成功克隆麻疹H基因,并有目的蛋白表达。     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的　设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法　运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果　RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论　成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。     

BIS监测下全身麻醉在宫颈癌患者手术中应用

目的构建VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,并检测其在人胚胎肾细胞（HEK293T）中的表达。方法以人脐血单核细胞的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增VEGFA基因,并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl中,构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA。经限制性核酸内切酶BglII和SalI酶切和DNA测序鉴定后,用脂质体法将pEGFP-VEGFA转染HEK293T细胞,转染后24 h和48 h采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA的表达。结果 pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带,测序结果证实VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致。在经转染的HEK293T细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pEGFP-VEGFA成功转染HEK293T细胞,并在其中得到了表达。结论成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础。