不同浓度白藜芦醇对破骨细胞分化的影响及自噬的作用

目的研究不同浓度白藜芦醇(RSV)对破骨细胞分化的影响及自噬在其中的作用。方法RANKL诱导RAW264.7细胞分化过程中,加入不同浓度(0、0.1、0.5、1、5及10μmol/L)RSV,CCK-8检测干预后12、24、48、72 h时的细胞活力;TRAP染色观察破骨细胞分化程度。加或不加入3-甲基嘌呤(3-MA)抑制自噬,RT-PCR检测破骨分化相关标志物TRAP、MMP-9、CTSK和自噬相关标志物LC3、Beclin-1、P62的mRNA表达情况;Western blot检测自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin-1、P62的表达情况。结果RANKL诱导分化过程中,细胞增殖活力提高,加入0.1~10μmol/L的RSV,细胞活力先上升后下降,在0.5μmol/L时达到最大;0.1μmol/L和0.5μmol/L的RSV能提高TRAP染色阳性的破骨细胞数和TRAP、MMP-9、CTSK、LC3、Beclin-1、P62的mRNA表达,自噬相关蛋白LC3II/I和Beclin-1也增加,P62的蛋白表达则减少;而1~10μmol/L RSV随浓度升高相关mRNA及蛋白LC3II/I和Beclin-1的表达减少,P62的蛋白表达增加;加入3-MA后,相关mRNA及蛋白LC3II/I和Beclin-1的表达减少,P62的蛋白表达增加。结论RSV浓度在0.1~10μmol/L范围内,破骨细胞分化和自噬水平先升高后降低,抑制自噬可以抑制破骨细胞的分化。白藜芦醇影响破骨细胞分化可能部分是通过调节自噬发挥作用。     

PPARγ活化对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞趋化因子表达的干预作用

目的：观察PPARγ活化对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾脏纤维化中的干预作用。方法：体外培养肾小管上皮细胞HK-2,LDH法检测15d-PGJ2和TGL对HK-2的细胞毒性,应用不同浓度的15d-PGJ2和TGL作用于TGF-β1诱导下的HK-2细胞,应用实时荧光定量PCR技术和ELISA方法检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白细胞介素-8（IL-8）表达的变化。结果：5μmol/L15d-PGJ2和2.5μmol/LTGL不影响HK-2细胞MCP-1和IL-8mRNA基础表达和蛋白分泌。TGF-β1作用24h时,2.5μmol/L和5μmol/L15d-PGJ2及2.5μmol/LTGL均能有效干预TGF-β1诱导的MCP-1mRNA表达和蛋白的分泌（P〈0.05）。IL-8的表达与MCP-1相似,2.5μmol/L和5μmol/L15d-PGJ2能显著抑制TGF-β1诱导的IL-8表达,TGF-β1诱导24h时2.5μmol/LTGL能显著抑制IL-8mRNA表达（P〈0.05）。结论：PPARγ激动剂15d-PGJ2和TGL作用均能有效干预TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞趋化因子MCP-1和IL-8的表达,可能具有有效干预肾间质炎症作用。     

甲磺酸阿帕替尼治疗胃癌的药代/药效动力学研究

目的探讨甲磺酸阿帕替尼治疗胃癌的药代/药效动力学(PK/PD)特征, 为指导临床合理用药提供数据支持。方法研究对象为在嘉兴学院附属第二医院就诊的145例胃癌患者, 其中80例采用阿帕替尼联合替吉奥进行治疗(阿帕替尼组), 65例采用替吉奥进行治疗(对照组), 治疗3个月。收集治疗期间的静脉血样测定阿帕替尼血药浓度, 并分别采用肿瘤生长抑制(TGI)模型和总存活数模型来评估甲磺酸阿帕替尼抗肿瘤的量效关系。结果甲磺酸阿帕替尼首次口服的Tmax为(2.35±0.95) h, Cmax为(952.02±323.24) ng/ml, AUC0～24 h为(2 120.02±669.52) mg/(ml·h)。治疗3个月, 阿帕替尼组无进展生存率高于对照组(88.47%比73.45%, χ2=4.422, P<0.05)。TGI模型分析结果显示甲磺酸阿帕替尼对肿瘤直径、CEA、CA199、VEGF及VEGFR2的Kdrug分别为0.036、0.005、0.009、0.026及0.055。总存活数模型分析结果显示, 阿帕替尼血药浓度(β血药浓度=1.853)、肿瘤最大径之和(SLD, βSLD...     

双硫仑联合铜离子对乐伐替尼耐药肝癌细胞Huh7增殖及凋亡的影响

目的建立乐伐替尼肝细胞肝癌(简称"肝癌")细胞耐药模型,以研究双硫仑联合铜离子对乐伐替尼耐药细胞Huh7增殖和凋亡的影响。方法通过CCK8法检测乐伐替尼作用下Huh7细胞的半抑制浓度(IC50),采用浓度递增法诱导Huh7细胞乐伐替尼耐药。各组细胞处理:对照组为Huh7细胞加普通培养液培养后的细胞;敏感组为Huh7细胞加10μmol/L乐伐替尼培养后的细胞;耐药组为耐药Huh7细胞加10μmol/L乐伐替尼培养后的细胞;联合组为耐药Huh7细胞加10μmol/L乐伐替尼+1μmol/L双硫仑+0.5μmol/L铜离子培养后的细胞;抑制剂组为耐药Huh7细胞加10μmol/L乐伐替尼+10μmol/L Akt抑制剂MK2206培养后的细胞。CCK8法及流式细胞术分别检测细胞的存活率和凋亡率;Western blot法检测磷酸化-Akt(p-Akt)和半胱氨酸蛋白酶9(caspase-9)和B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)蛋白表达;Transwell法检测细胞侵袭性。结果乐伐替尼耐药细胞系成功建立,选取10、20、40、60、80及160μmol/L 6个乐伐替尼浓度对Huh7细胞作用48 h后计算得出细胞IC50为12.35μmol/L。耐药组细胞存活率明显高于敏感组(P<0.01),联合组细胞存活率明显低于耐药组(P<0.01),抑制剂组细胞存活率明显低于耐药组(P<0.05)。与耐药组比较,联合组及抑制剂组p-Akt蛋白表达明显降低(P<0.01)、caspase-9明显升高(P<0.01),而Bcl-2蛋白在耐药组和联合组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。联合组细胞凋亡率明显高于耐药组(P<0.01)。Transwell结果显示联合组的肿瘤细胞侵袭数明显少于耐药组(P<0.01)。结论双硫仑联合铜离子能增加乐伐替尼对乐伐替尼耐药肝癌细胞Huh7的敏感性,同耐药组相比其细胞抑制率明显提高,其机制可能与抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt通路及促进caspase-9蛋白表达有关。     

钙化纳米微粒诱导人肾小管上皮细胞自噬的研究

目的 观察不同浓度钙化纳米微粒( calcifying naniparticles,CNP)对人肾小管上皮细胞HK-2生长的影响,探讨CNP是否可以诱发体外培养HK-2细胞的自噬作用. 方法 将0.0125、0.025、0.05、0.1 mg/ml等4种浓度CNP加入对数生长期的HK-2细胞,培养12、24、48、72 h后,MTT法检测HK-2细胞生长、增殖情况.EGFP-LC3表达质粒转染体外培养HK-2细胞,培养24 h后,加入CNP共同孵育,作用3、6、24、48 h后收集细胞,透射电镜下检测CNP作用后HK-2细胞自噬体的形成,荧光显微镜检测CNP作用前后HK-2细胞LC-3斑点的形成情况. 结果 CNP对HK-2细胞的生长抑制作用随着CNP浓度的升高和作用时间的延长而增强,0.05 mg/ml CNP作用48 h后HK-2细胞增殖抑制率为14.5％,0.1 mg/ml CNP作用72h后抑制率达21.5％.加入CNP 6 h后透射电镜下可见CNP聚集形成结晶样物并黏附于HK-2细胞表面,HK-2细胞质内见散在的自噬体形成.荧光显微镜下可见转染EGFP-LC3的HK-2细胞质内散在分布的LC-3荧光斑点. 结论 CNP可以诱发HK-2细胞的自噬作用,可能在肾结石等生物矿化相关疾病发生中起重要的作用.     

戊糖多硫酸钠通过抑制P38MAPK通路的激活干预高糖刺激下肾小管上皮细胞的增殖

目的观察戊糖多硫酸钠是否通过调控P38MAPK干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞的损伤。方法利用不同浓度(10 mmol/L~50 mmol/L)葡萄糖刺激人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cells,HK-2)48 h,应用CCK-8比色法检测肾小管上皮细胞增殖的改变。利用不同时间段(0~48 h)葡萄糖刺激细胞,用Western blot法检测P38MAPK蛋白的表达水平,分为正常对照组(CON组)、高糖组(high glucose,HG组,葡萄糖30 mmol/L)、戊糖多硫酸钠(pentosan polysuflate,PPS)组(PPS 200μg/ml)、高糖+戊糖多硫酸钠组(HG+PPS组),P38抑制剂组(SB 202190,20μmol/L),p38抑制剂+高糖组(SB+HG组)、p38抑制剂+戊糖多硫酸钠组(SB+PPS),刺激48 h后检测HK-2细胞增殖的改变,刺激6 h后检测HK-2细胞P38MAPK蛋白的表达水平。结果高糖刺激下HK-2细胞增殖在30 mmol/L的浓度最高。与HG组相比,加用戊糖多硫酸钠干预能明显抑制HK-2的增殖,差异有统计学意义(P均0.01);与正常对照组相比,高糖刺激HK-2细胞6 h后磷酸化(p)p38MAPK蛋白表达水平明显增加(P均0.01);与HG组相比,HG加戊糖多硫酸钠干预6 h后HK-2细胞p-p38MAPK蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P均0.05)。应用p38MAPK抑制剂SB202190(20μmol/L)处理细胞,与HG组相比,HG加用SB202190干预能明显抑制p-p38MAPK蛋白表达及HK-2细胞的增殖(P均0.05);与PPS组相比,PPS加SB202190干预后p-p38MAPK蛋白表达降低及HK-2细胞数目减少(P均0.05)。结论戊糖多硫酸钠可能通过抑制p38MAPK的表达,减少肾小管上皮细胞的增殖而对糖尿病肾病起保护作用。     

索拉非尼通过调节Beclin-l的表达诱导肝癌细胞自噬的实验研究

探讨索拉非尼诱导肝癌细胞自噬的作用及机制。选取人肝癌HepG2细胞,随机分为对照组、2.5μmol/L组、5μmol/L组和10μmol/L组,其中2.5μmol/L组、5μmol/L组和10μmol/L组分别给予2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L索拉非尼,采用MTT法检测细胞增殖,倒置荧光显微镜观察自噬小体,Western blot检测LC3-Ⅱ、Beclin-l表达。2.5μmol/L组、5μmol/L组和10μmol/L组培养24、48和72 h时吸光度(A)值明显低于对照组(P<0.05),其中10μmol/L组培养24、48和72 h时A值分别为0.289±0.097、0.310±0.100和0.411±0.103,明显低于2.5μmol/L和5μmol/L组(P<0.05);2.5μmol/L组、5μmol/L组和10μmol/L组自噬小体形成数明显高于对照组(P<0.05),其中10μmol/L组自噬小体形成数为(37.40±4.45)个,明显高于2.5μmol/L组和5μmol/L组(P<0.05);2.5μmol/L、5μmol/L组和10μmol/L组LC3-Ⅱ、Beclin-1相对表达量明显高于对照组(P<0.05),其中10μmol/L组LC3-Ⅱ、Beclin-1相对表达量为1.022±0.105和0.562±0.102,明显高于2.5μmol/L组和5μmol/L组(P<0.05)。索拉非尼可抑制肝癌细胞增殖,促进自噬小体生成,可能与调控Beclin-1表达有关。     

吉非替尼对小鼠睾丸癌I-10细胞生长抑制及诱导凋亡作用

目的:观察吉非替尼对体外培养的小鼠睾丸癌细胞(I-10)生长抑制及诱导凋亡作用。方法:将不同浓度(0、1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L)吉非替尼作用于对数生长期的睾丸癌I-10细胞。MTT法检测吉非替尼对I-10细胞生长的抑制作用;Annexin V/PI双染法观察吉非替尼作用后I-10细胞的早期凋亡;Hoechst 33258荧光染色法观察吉非替尼作用后I-10细胞晚期凋亡;Western印迹法检测吉非替尼作用后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase 3/9的变化。结果:10、20μmol/L的吉非替尼对I-10细胞增殖有明显抑制作用,与对照组相比差异有显著性(P0.05),40μmol/L的吉非替尼作用下,I-10细胞的生存率为(32.4±2.8)%,与对照组相比差异显著(P0.01);40μmol/L吉非替尼组I-10细胞的早期和晚期凋亡率分别为(26.7±4.2)%和(59.33±10.2)%,与对照组相比差异显著(P0.05、P0.01);吉非替尼(10、20、40μmol/L)作用后,与对照组相比,促凋亡蛋白Bax表达分别增加了(41.9±7.1)%、(60.1±9.8)%、(69.0±11.3)%(P均0.05)而抑凋亡蛋白Bcl-2表达分别减少了(50.3±8.9)%、(63.9±6.9)%、(88.7±13.9)%(P0.05);剪切的caspase3表达分别增加(69.0±6.9)%、(71.5±8.1)%、(110.9±14.2)%(P0.05);剪切的caspase9表达分别增加了(51.8±4.9)%、(54.7±6.7)%、(43.8±11.8)%(P均0.05)。结论:吉非替尼可以增加I-10细胞的细胞毒性并诱导细胞凋亡,其机制与线粒体凋亡信号通路有关。     

黄芩苷对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的：观察不同浓度的黄芩苷对TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）细胞转分化的影响。方法：以5ng/ml的TGF-β1作用HK-2不同的时间（0、12、24、48和72h）,用RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏蛋白基因表达情况。以40、80、160、320μmol/L浓度的黄芩苷与5ng/mlTGF-β1共孵育48h,每12h在倒置显微镜下观察细胞形态。结果：黄芩苷干预后可抑制HK-2梭形变,抑制α-平滑肌肌动蛋白基因表达,上调E-钙黏蛋白基因表达,且在一定范围内呈剂量依赖性。结论：一定浓度的黄芩苷在体外有阻滞TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化作用。     

3-甲基腺嘌呤促进吡柔比星诱导膀胱癌BIU-87细胞凋亡及机制

目的 探讨3-甲基腺嘌呤(3-MA)自噬抑制剂联合吡柔比星(THP)对膀胱癌BIU-87细胞杀伤作用及机制.方法 膀胱癌BIU-87细胞分为对照组、3-MA(10 mmol/L)组、THP(5 mg/L)组、3-MA(10 mmol/L)+ THP(5 mg/L)组.噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测各组细胞中自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ、Beclin-1以及凋亡蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3和Caspase-9的表达.结果 药物作用24h后,各组细胞增殖率分别为(86.64±3.09)％、(63.70±5.62)％、(58.43±3.89)％、(37.55±4.17)％,其中3-MA+THP组细胞增殖下降最明显(P ＜0.05);3-MA与THP联合应用后,自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达明显减弱,而凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达在各组中最强(P＜0.05).结论 3-MA抑制膀胱癌BIU-87细胞对化疗药物保护性自噬反应,增加膀胱癌细胞对THP细胞毒杀伤作用的敏感性.     

自噬在吗啡预处理减轻小鼠原代皮层神经元氧糖剥夺/复糖复氧损伤中的作用及其与JNK的关系

目的评价自噬在吗啡预处理减轻小鼠原代皮层神经元氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤中的作用及其与c-Jun氨基末端激酶(JNK)的关系。方法选择出生24 h内的C57BL/6乳鼠, 培养原代皮层神经元, 采用随机数字表法分为9组(n=24):对照组(C组)、OGD/R组、吗啡预处理组(M组)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(3-MA组)、3-MA+吗啡预处理组(3-MA+M组)、自噬抑制剂氯喹组(Ch组)、氯喹+吗啡预处理组(Ch+M组)、JNK抑制剂SP600125组(SP组)和SP600125+吗啡预处理组(SP+M组)。吗啡预处理:OGD/R前加入吗啡3 μmol/L孵育2 h。3-MA组、Ch组和SP组分别加入3-MA 5 mmol/L、氯喹50 μmol/L、SP6001252 5 μmol/L, 孵育150 min。3-MA+M组、Ch+M组和SP+M组于吗啡预处理前30 min时分别加入3-MA 5 mmol/L、氯喹50 μmol/L、SP600125 25 μmol/L。随后氧糖剥夺1 h, 复糖复氧24 h。采用CCK-8法测定神经元活力;Western b...     

自噬在右美托咪定减轻大鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的评价自噬在右美托咪定减轻大鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法正常培养的对数期大鼠H9c2心肌细胞,以1×106个/ml密度接种于6孔板,采用随机数字表法分为4组(n=15):对照组(C组)、高糖缺氧复氧组(HG+H/R组)、右美托咪定组(DEX组)和右美托咪定+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(3-MA组)。细胞密度达到50%时,使用含1%胎牛血清+1%双抗的培养基孵育24 h。采用高糖培养基(糖浓度33 mmol/L)培养24 h,37 ℃下培养箱(95%N2+5%CO2)培养4 h,复氧(90%O2+10%CO2)2 h,制备高糖心肌细胞缺氧复氧损伤模型,DEX组和3-MA组于缺氧前1 h时加入右美托咪定,终浓度5 μmol/L,3-MA组右美托咪定孵育1 h时加入3-MA,终浓度5 μmol/L。于复氧后2 h时采用CCK-8法测定细胞活力,采用试剂盒检测上清液LDH活性,采用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3、P62和Beclin-1的表达,计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,采用RT-PCR法检测P62和Beclin-1 mRNA的表达。结果与C组比较,HG+H...     

抑制自噬对5-氟尿嘧啶治疗肝癌疗效的影响及机制研究

目的研究自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导肝癌细胞系SMMC7721凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法利用单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色技术,在荧光显微镜下对细胞自噬进行定性观察;以CCK8法检测3-MA抑制细胞自噬前后经5-FU诱导SMMC7721细胞的存活,凋亡以AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法检测;以Western blot法分别检测自噬特异性蛋白LC3及凋亡蛋白caspase-3活化片段和PARP裂解片段的表达。结果 5-FU处理肝癌SMMC7721细胞48 h后,可诱导其发生自噬,细胞存活率为（60.73±2.65）%,凋亡率为（40.42±2.34）%;联合应用3-MA处理48 h后,可使肝癌SMMC7721细胞存活率明显降低（P〈0.01）,为（42.31±1.32）%,而细胞凋亡率显著增加（P〈0.01）,为（60.92±2.99）%,同时引起自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ及凋亡蛋白caspase-3活化片段和PARP裂解片段表达增加,其灰度值比较差异均有统计学意义（均P〈0.01）。结论自噬在5-FU诱导肝癌细胞系SMMC7721凋亡过程中起保护性作用,抑制自噬可提高肝癌SMMC7721细胞对5-FU的敏感性,其可能主要通过激活caspase-3及剪切PARP来实现的。因此,自噬特异性抑制剂3-MA可能为提高肝癌对5-FU的敏感性提供新思路。     

PI3K/AKT/mTOR信号通路在肝癌细胞自体吞噬中的作用研究

目的探讨在肝癌细胞中PI3K／AKT／mTOR信号通路在氨基酸缺乏诱导的自体吞噬中的作用。方法观察HCCLM3、MHCC97L及SMMC-7721肝癌细胞在氨基酸缺乏情况下及与P13K抑制剂3-MA、Wortmannin及LY294002，mTOR抑制剂雷帕霉素协同作用下细胞活力变化。GFP—LC3荧光法观察细胞内自噬体的形成。Western印迹检测LC3-Ⅱ蛋白的表达。结果经无氨基酸培养液EBSS处理后48h，HCCLM3、MHCC97L及SMMC-7721细胞存活率分别为（78．9±3．8）％、（57．2±13．1）％及（3．4±3．0）％（P〈0．01）。与HCCLM3、MHCC97L相比，细胞中的自噬体在SMMC-7721细胞中明显增多，分别为（13．1±3．5）％、（20．0±1．1）％及（48．9±4．5）％（P〈0．01）。Western印迹显示在EBSS处理后早期即有LC3—Ⅱ蛋白的明显表达。在EBSS基础上雷帕霉素20μmol／L处理24h，3种细胞株活力明显下降。3-MA、Wortmannin及LY294002处理也加速EBSS诱导的细胞死亡。结论高转移潜能肝癌细胞比较耐受自噬样细胞死亡。P13K／AKT／mTOR信号通路对自噬样细胞死亡可能起重要调节作用。     

ERK1/2信号通路在甲状旁腺激素致人近曲小管上皮细胞分泌纤溶酶原激活物抑制剂1中的作用

目的 从体外观察ERK信号通路在甲状旁腺激素（PTH）致人近曲小管上皮细胞（HK-2）合成纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）中的作用。 方法 以HK-2细胞株为研究对象,用不同浓度PTH（10-8、10-9、10-10、10-11、10-12 mol/L）作用细胞48 h,以及10-10 mol/L PTH作用细胞不同时间（12、24、36、48、72 h）,分别用RT-PCR法检测PAI-1 mRNA表达,Western印迹法检测PAI-1蛋白表达。以10-10 mol/L PTH作用细胞48 h,分别观察细胞ERK1/2抑制剂预处理前后磷酸化（p）ERK1/2、PAI-1mRNA及蛋白的变化情况。 结果 10-12 mol/L PTH可促进细胞在基因及蛋白水平合成PAI-1,随着PTH浓度逐渐上升,PAI-1mRNA及蛋白浓度均相应增加,以10-10 mol/L PTH组刺激作用最显著,分别为对照组的4.01倍和3.81倍（均P < 0.01）。但随着PTH浓度进一步增加,PAI-1mRNA及蛋白浓度却随之下降。10-10 mol/L PTH作用细胞,12 h时有少量PAI-1表达,72 h时达峰值,并呈时间依赖性,分别为0 h组的4.06倍和4.03倍（均P < 0.01）。10-10 mol/L PTH作用细胞48 h,有大量的p-ERK1/2合成（P < 0.01）,经ERK1/2抑制剂预处理后,PAI-1及ERK均显著下降（均P < 0.01）,但仍高于对照组（均P < 0.05）。 结论 ERK信号通路部分参与PTH致HK-2细胞合成PAI-1的作用。     

索拉菲尼对肝癌细胞HepG2自噬的抑制作用

目的：研究化疗药物索拉菲尼（Sorafenib）对肝癌细胞HepG2自噬的作用及自噬与细胞增殖、细胞凋r_的关系。方法：常规细胞培养,以10μmol／L的索拉菲尼作用不同时间,采用MDC染色,在荧光显微镜下观察自噬泡的情况：用Western印迹检测自噬相关蛋白LC3的动态变化;用3-MA抑制肝癌细胞中自噬的表达,并用CCK8法检测索拉菲尼及其联合3-MA对细胞生存率的影响,用AnnexinV／PI流式细胞仪检测抑制自噬后凋亡的变化。结果：HepG2经索拉菲尼作用后,自噬泡明显减少,LC3蛋白尤其是LC3-Ⅱ随着作用时间延长逐渐减弱;索拉菲尼联合3-MA可进一步抑制HepG2细胞中自噬的表达,抑制自噬后细胞死亡明显增加,特别是细胞凋亡明显增加。结论：索拉菲尼抗肝癌作用可能与抑制肝癌细胞自噬有关。     

肾小管上皮细胞内质网应激时NGAL表达改变的调控机制研究

目的:探讨人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)发生内质网应激时,NGAL表达增加的上游调控机制。方法:将HK-2细胞分为对照组(正常HK-2细胞),TG(毒胡萝卜素,thapsigargin)组(5μmol/L TG处理8 h),单纯转染组(siRNAATF4试剂转染24 h),转染+TG组(siRNA-ATF4试剂转染24 h后,5μmol/L TG处理8 h),阴性对照组(siRNA-阴性对照物转染24 h),DMSO组(5μmol/L DMSO处理8 h)。采用Western blot检测各组细胞内质网源性转录因子(CHOP)、内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、中性粒细胞明胶酶相关性载脂蛋白(NGAL)、激活转录因子4(ATF4)的表达,采用Real-time PCR方法测得ATF4mRNA、NGALmRNA表达量。结果:与对照组相比,TG组细胞NGAL、ATF4、ATF4mRNA、NGALmRNA表达量显著提高(P <0. 05),而转染+TG组、单纯转染组、阴性对照组、DMSO组中ATF4及NGAL差异无统计学意义(P> 0. 05)。与TG组相比,转染+TG组ATF4、NGAL、ATF4mRNA及NGALmRNA表达量呈显著降低趋势(P <0. 05)。在TG组与转染+TG组细胞中,CHOP和GRP78呈过表达状态(P <0. 05),而转染+TG组细胞CHOP和GRP78提升趋势明显低于TG组细胞(P <0. 05)。结论:(1) TG可诱导人肾小管上皮HK-2细胞发生内质网应激反应。(2) HK-2细胞发生内质网应激反应时,抑制ATF4表达会引起NGAL降低,提示ATF4是NGAL表达的上游调控因子。(3) HK-2细胞发生内质网应激反应时,抑制ATF4不能阻止CHOP和GRP78发生过表达,但可降低其升高程度,提示ATF4及NGAL降低可能对内质网应激反应介导HK-2细胞损伤起到一定的缓解作用。     

索拉菲尼对肝细胞癌凋亡和自噬相关蛋白表达的影响及耐药分析

目的:分析索拉菲尼对肝细胞癌凋亡及自噬相关蛋白表达的影响,及肝细胞癌对其耐药的机制.方法:常规培养人肝癌SMMC-7721细胞,以1.25、2.5、5、10、20μmol/L索拉菲尼处理细胞,观察其对细胞增殖的影响.观察索拉菲尼和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对细胞凋亡和自噬,及其相关蛋白表达的影响.结果:随着索...     

番茄红素对高糖诱导的足细胞自噬以及凋亡的影响

目的探讨番茄红素(Lyc)对高糖诱导的足细胞自噬及凋亡的影响,旨在为临床治疗糖尿病肾病提供可靠的理论依据。方法采用条件永生化小鼠足细胞系为研究对象,通过添加不同剂量的Lyc对高糖诱导的足细胞进行干预。实验细胞分6组,分别为正常对照组(5.5m m ol/L葡萄糖)、高渗对照组(5.5 m m ol/L葡萄糖+1 9.5 m m ol/L甘露醇)、高糖组(2 5 m m ol/L葡萄糖)、低剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+3.125μmol/L Lyc)、中剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+6.25μmol/L Lyc)和高剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+12.5μmol/L Lyc)。在细胞培养4 8 h后,用吖啶橙染色法观察各组细胞的自噬体变化情况;流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率变化;采用实时定量荧光PCR和蛋白质印迹法分别检测自噬相关基因LC3、beclin-1、p62/SQSTM I m RNA和蛋白的表达变化情况。结果与正常对照组、高渗对照组相比,高糖组细胞中的自噬体数目明显增多,细胞的凋亡率极显著增加(P0.01),自噬相关基因LC3-II、beclin-1的表达量显著增加(P0.05),而p62/SQSTMI基因的表达量则显著降低(P0.05)。与高糖组比较,不同剂量Lyc组中的足细胞自噬体数目更多;细胞的凋亡率显著降低(P0.05),且高剂量Lyc组细胞的凋亡率降低极显著(P0.01);自噬相关基因LC3-II、beclin-1表达量显著增加(P0.05);而p62/SQSTMI基因表达量则显著降低(P0.05);且高剂量Lyc组基因表达量变化极显著(P0.01);蛋白水平上的检测结果与mRNA水平基本一致。结论Lyc能进一步增强高糖诱导引起的足细胞的自噬,但对足细胞的凋亡却起到了一定的抑制作用,且高剂量的Lyc作用效果更加明显。     

葛根素通过HMGB1/TLR4/NF-κB轴抑制自噬减轻体外模型缺血再灌注损伤

目的本研究旨在探讨葛根素对人肾组织性缺氧/复氧(H/R)诱导的急性肾损伤的体外保护作用。方法利用肾小管上皮细胞(HK 2)细胞和H/R处理模拟缺血再灌注损伤的体外实验。实验分为对照组(Control)、H/R处理组(0、6、12和24 h)、H/R 24 h +葛根素处理组、H/R 24 h +葛根素+ 3-甲基腺嘌呤(3-MA, Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂)处理组、H/R 24 h + 3-MA处理组。采用免疫印迹法(WB)检测自噬相关蛋白的表达变化, 用细胞计数试剂-8(CCK-8)检测细胞增殖情况, 电子显微镜检测自噬体形成, 原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测凋亡。结果与对照组相比, H/R处理组(24 h)微管相关轻链3-II(LC3-II)的表达增加, 且自噬标志物P62的表达减少, 自噬体数目增多, 细胞活力降低, 细胞出现炎症反应。葛根素作用与3-MA作用接近, 与H/R处理组(24 h)相比, 加入葛根素处理后可逆转H/R诱导的LC3、P62表达水平变化(P<0.05), 表现为细胞活力增加, 降低了自噬体数目, 减轻了细胞凋亡(P<0.05)。同...