分泌抗hCG-抗HRP双特异单克隆抗体的二次杂交瘤细胞株E_4和E_7

用分泌抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)单克隆抗体的6-巯基鸟嘌呤抗性杂交瘤突变株BAH_1-TG细胞与用辣根过氧化物酶(HRP)免疫的小鼠脾细胞进行二次杂交。二次杂交瘤细胞的培养上清用双抗原夹心放射免疫测定法和双抗原夹心酶联免疫测定法检测抗hCG-抗HRP双特异抗体。经多次克隆和筛选,获得两株分泌抗hCG-抗HRP双特异单克隆抗体的二次杂交瘤株E_4和E_7。     

小鼠体内抗牛血清白蛋白B细胞克隆对McAb筛选的影响

目的　探讨小鼠体内存在的抗牛血清白蛋白 B细胞克隆对抗原特异性 Mc Ab筛选的影响。方法　在Mc Ab筛选过程中 ,采用间接 EL ISA法 ,分别以人重组高效复合干扰素 (r SIFN- co)和 BSA为抗原包被酶标板 ,对杂交瘤细胞培养上清进行“双筛”,建立 r SIFN- co/ BSA双阳性杂交瘤细胞克隆和 r SIFN- co单阳性杂交瘤细胞克隆 ,并且对所建立的各株杂交瘤细胞培养上清和正常小鼠血清 ,用 BSA进行吸附抑制实验。结果　建立了 1株r SIFN- co/ BSA双阳性杂交瘤细胞株 ,3株 r SIFN- co单阳性杂交瘤细胞株 ,双阳性杂交瘤细胞株培养上清经 BSA预先吸附后 ,与 r SIFN- co的反应性被显著抑制 (P<0 .0 5 )。而且正常小鼠血清与 r SIFN- co呈阳性反应 ,经 BSA吸附后 ,与 r SIFN- co的反应也被显著抑制。结论　在杂交瘤细胞筛选中 ,存在对特异性抗原和用于封闭酶标板的BSA显示双阳性的杂交瘤细胞克隆 ,提示小鼠体内可能天然存在抗 BSA的 B细胞克隆 ,它们在 Mc Ab筛选过程中会引起假阳性反应 ,因而在杂交瘤细胞筛选过程中应该用特异性抗原和 BSA进行“双筛”。     

分泌抗猪囊尾蚴囊液抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

Kohler及Milstein(1975)首创的制备单克隆抗体的杂交瘤技术,已在医学、生物学等方面的研究中得到广泛应用。在寄生虫学领域内,国内外已对廿余种(亚种)寄生虫应用杂交瘤技术进行研究,至今尚未见到有关猪囊尾蚴单克隆抗体的研究报道。我们用猪囊尾蚴囊液抗原免疫BALB/C小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系NS-○融合,获得成功。经克隆化获得三株分泌抗猪囊尾蚴囊液抗原的McAb杂交瘤细胞,分别命名为Aq_1、G_11、F_3,用ELISA和IHA检测证实三株杂交瘤细胞分泌特异抗体。     

抗HBV逆转录酶杂交瘤细胞系的建立及其单克隆抗体鉴定

目的 建立抗乙型肝炎病毒逆转录酶单克隆抗体杂交瘤并研究杂交瘤细胞及抗体特性。方法 用经原核表达的乙型肝炎病毒逆转录酶蛋白（HBV-RT）免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经筛选和克隆化制备杂交瘤细胞系,然后用ELISA法筛选出阳性克隆,最后用免疫组化ABC方法研究杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体特性。结果 2株能持续、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系,其杂交瘤细胞经过100d连续培养,单克隆抗体分泌稳定,特异性强、腹水抗体效价免疫组化ABC法1：1000。免疫组化检测显示其相应抗原在肝炎及肝硬变组织中呈高表达（73%）,正常肝组织中未见阳性反应;其抗原主要分布于细胞质内。结论 此2株抗乙型肝炎病毒逆转录酶杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体具有特异亲合性,它们的成功制备为研究HBV感染的早期诊断及乙肝患的治疗奠定了基础。     

一株抗人胆管癌相关抗原杂交瘤细胞株的建立及鉴定

目的 建立能分泌与人胆管癌组织特异结合的高效价抗人胆管癌相关抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法 用２的人胆管癌细胞系Ｓｋ－ＣＨＡ－１免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后，获取免疫小鼠的脾细胞。与小鼠骨髓瘤ＳＰ２／０融合，ＥＬＩＳＡ方法及免疫荧光染色法筛选细胞晤后生成的杂交瘤细胞株。结果 ＥＬＩＳＡ方法及免疫荧光染色法共筛选出５株能持续稳定分泌抗人胆管癌相关抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中２Ｆ４Ｅ８杂交瘤细胞株     

小鼠人工感染锥虫的免疫学研究——抗伊氏锥虫单克隆抗体对伊氏锥虫感染力的影响

应用杂交瘤技术研制并分离出11株分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。先前的研究表明,11个杂交瘤细胞株中,2-C-7杂交瘤细胞株的培养上清液具有较高的抗体阳性滴度(ELISA法)。用多种其它寄生虫抗原做交叉反应试验表明,该株对伊氏锥虫有着专一反应性。为了进一步探讨2-C-7细胞株分泌的单抗的生物学活性,我们观察了用单抗处理过的伊氏锥虫对小鼠的感染力。同时还用另一杂交瘤细胞株R_4所分泌的单抗进行了类似的试验。     

鼠抗早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鼠抗早孕因子（EPF）单克隆抗体,纯化并进行鉴定。方法用重组EPF免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术获得抗EPF杂交瘤细胞株,注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-G亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,用间接ELISA法测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,用Western blotting鉴定其特异性,并进行类及亚类、细胞染色体核型分析。结果筛选出2株具有较高活性和良好稳定性的分泌抗EPF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水的抗体效价均高于2×10^-5,2株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,2株单抗有不同的抗原表位。SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体有较高的纯度,Western blotting表明其与EPF抗原有特异结合性。结论成功制备2株具有较高活性的鼠抗EPF单克隆抗体,为建立检测EPF方法奠定了良好的基础。     

抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞系的建立及其单克隆抗体鉴定

目的：制备分泌抗乙型肝炎病毒末端蛋白mAb杂交瘤并研究杂交瘤细胞及所产生抗体的特性．方法：用经原核表达的乙型肝炎病毒末端蛋白(HBV-TP)免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／O融合，经筛选和克隆化建立杂交瘤细胞系，然后用ELISA法筛选出阳性克隆，以免疫组化ABC方法研究杂交瘤细胞分泌的mAb特性．结果：共筛选出3株能持续、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系，其杂交瘤细胞经过100d连续培养，mAb分泌稳定，特异性强，腹水抗体效价免疫组化ABC法1：1000。免疫组化检测显示其相应抗原在肝炎及肝硬变组织中呈高表达(80％)，正常肝组织中未见阳性反应；其抗原主要分布于细胞质内．结论：此3株抗乙型肝炎病毒末端蛋白杂交瘤细胞分泌的mAb具有特异亲合性，其成功制备为研究HlBV感染的早期诊断及乙肝患的生物治疗奠定了基础。     

抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备及其对抗原决定簇特异性的研究

用杂交瘤技术建立三株分泌抗甲状腺球蛋白(TG)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所获三种单克隆抗体经兔抗小鼠IgG亚类、IgM及IgA血清鉴定表明,两种为IgG_1,一种为IgA;三种含单克隆抗体小鼠腹水的滴度(ELISA法)均为51200以上;以竞争性固相抗体结合试验测定它们对抗原决定簇的特异性差异,结果发现三种单克隆抗体的抗原结合部位是不同的,但对抗原的结合有一定的相互竞争抑制现象。     

分泌抗人C_4单克隆抗体的淋巴细胞杂交瘤

1975年Kohler和Milstein报告的淋巴细胞杂交瘤技术,为制备抗各种抗原决定簇的单克隆抗体提供了精确的手段。1983年我们运用杂交瘤技术,用提纯的人补体第4成分(C_4)免疫BALB/c小鼠,取其脾脏淋巴细胞与小鼠SP2/0—Ag14骨髓瘤细胞融合,获得了分泌抗人C_4单克隆抗体的淋巴细胞杂交瘤。     

Hoechst 33342标记恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化

 [目的]探讨皮肤干细胞诱导分化为结膜上皮细胞,为组织工程结膜探索一种新型的种子细胞,为严重眼表疾病的治疗奠定基础。[方法]在体外培养纯化鉴定恒河猴皮肤干细胞,并用Hoechst 33342标记,标记后的皮肤干细胞与结膜上皮细胞进行Transwell非接触共培养10d,然后对诱导后的细胞用细胞免疫化学以及流式细胞术检测结膜上皮细胞的特异性表面标志,包括角蛋白4和粘蛋白4,同时检测细胞的Hoechst 33342表达情况。[结果]纯化后的皮肤干细胞比例接近90%。Hoechst 33342标记后的皮肤干细胞胞核显示蓝色荧光。在与结膜上皮细胞共培养10d后,皮肤干细胞显示结膜上皮细胞的标志粘蛋白4和角蛋白4阳性,流式细胞术检测阳性细胞比例分别为49.9%和95.6%,同时细胞还显示胞核的Hoechst 33342表达。[结论]灵长类动物恒河猴的皮肤干细胞,在体外的适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

体外诱导恒河猴皮肤干细胞分化为结膜上皮细胞的实验研究

目的诱导体外培养、纯化的恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化,探索皮肤干细胞的可塑性。方法体外培养恒河猴皮肤干细胞,用Ⅳ型胶原纯化,纯化前后用流式细胞仪检测β1整合素和角蛋白15阳性细胞比例,纯化后的皮肤干细胞用细胞免疫荧光和逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术鉴定β1整合素和角蛋白15。皮肤干细胞转染绿色荧光蛋白基因,24h后挑选出有荧光的细胞,与人结膜上皮细胞共培养10d,再进行结膜上皮细胞的特异性抗原黏蛋白4和角蛋白4的鉴定,检测方法包括细胞免疫荧光和RT—PCR。结果体外培养的皮肤干细胞纯化后比例接近90％。细胞免疫荧光和RT—PCR检测β1整合素和角蛋白15阳性。转染绿色荧光蛋白基因24h后,细胞呈现绿色荧光,与结膜上皮细胞共培养10d后,细胞免疫荧光和RT—PCR检查黏蛋白4和角蛋白4阳性。结论在体外培养纯化的灵长类动物恒河猴皮肤干细胞,在适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

体外利用MGc80-3胃癌细胞诱导肿瘤杀伤细胞的实验研究

以健康人外周血单个核细胞作为肿瘤杀伤细胞的前体细胞，ＭＧｃ８０ ３胃癌细胞作为刺激细胞，在体外进行同种异体淋巴细胞和肿瘤细胞混合培养之后，单独加入重组白介素 ２和同时加入重组白介素 ２、抗ＣＤ３单克隆抗体，分别诱导出Ｌ 肿瘤杀伤细胞和ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞．用噻唑蓝比色法在体外检测其对ＭＧｃ８０ ３胃癌细胞的杀伤活性，并与淋巴因子 激活杀伤细胞、ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞相比较结果显示，ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞的杀伤活性最高．在倒置显微镜下及透射电镜下观察ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞对ＭＧｃ８０ ３胃癌细胞的杀伤过程，发现ＣＤ３ 肿瘤杀伤细胞首先接触、粘附靶细胞，以细胞坏死和细胞凋谢的方式杀伤肿瘤细胞     

CIK细胞与DC-CIK细胞抗肿瘤效应的对照研究

目的比较细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,CIK）与树突状细胞（dendritic cells,DC）结合CIK细胞抗肿瘤效应。方法外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA法测定干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。结果 DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0.05）,DC-CIK细胞共培养后,CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋细胞比率较相同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0.05）,共培养3 d,DC-CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均比CIK细胞单独培养的水平高（P〈0.01）,DC-CIK细胞对白血病细胞与淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0.01）。结论 DC-CIK细胞比CIK细胞有更强的抗肿瘤效应。     

树鼩角膜原代上皮细胞的分离培养、纯化与鉴定

目的 建立树鼩角膜上皮细胞(CECs)稳定的体外培养技术,为人类角膜疾病研究提供新的实验材料.方法 使用改进的双酶消化法取得树鼩CECs,用转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂配合梯度消化对树鼩CECs进行纯化,角蛋白3/12抗体对CECs进行免疫荧光检测及鉴定.结果 优化的酶消化法可以快速、有效得到高纯度的树鼩CECs. TGF-β抑制剂及梯度消化法可以达到良好的纯化目的,纯化的CECs在传代过程中仍保持良好形态.树鼩CECs免疫荧光染色显示角蛋白3/12单克隆抗体阳性.结论 成功建立了一种有效、简单、经济适用的树鼩角膜上皮原代细胞的体外培养技术,所获得的原代细胞具有较好的上皮细胞形态特征并可以连续传代,为眼科疾病的研究提供一种新材料.     

再造组织工程化平滑肌组织的实验研究

目的采用组织工程技术,将培养扩增的膀胱平滑肌细胞与国产可降解的聚合聚乙交酯丙交酯（PLGA）支架材料复合构建并植入裸鼠体内进行培育,探讨再造组织工程化平滑肌组织的可行性。方法从幼兔取膀胱,机械分离与酶消化获取培养平滑肌细胞,传代扩增平滑肌细胞后将其接种到国产PLGA支架材料的表面作为实验组,未接种细胞的单纯支架材料作为对照组。分别将它们植入到裸鼠体内进行培育。经裸鼠体内培育4周、8周后取材并进行大体观察、组织学及免疫组织化学检测。结果实验组标本经HE和Masson染色显示在材料表面形成数层平滑肌细胞层,经抗平滑肌α-肌动蛋白免疫组织化学染色呈棕黄色阳性。随着培育时间的延长,支架材料降解明显,而平滑肌细胞层进一步增殖形成平滑肌组织。对照组经HE染色材料表面见有少量成纤维细胞沉积,Masson染色示兰色,经抗平滑肌α-肌动蛋白免疫组织化学染色为阴性。结论采用国产PLGA聚合物为支架材料可再造出组织工程化平滑肌组织,为多种含平滑肌组织空腔脏器的组织工程研究奠定基础。     

全反式维甲酸联合细胞因子诱导无血清培养的骨髓基质干细胞向神经细胞分化

目的研究全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子等细胞因子联合诱导体外无血清培养的骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经细胞分化的作用。方法用含2%Utroser G的UltraCULTURE无血清培养体系体外扩增大鼠BMSCs，免疫细胞化学染色鉴定其表面标志，用以全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子为主要成分的复合诱导液诱导BMSCs向神经细胞方向分化，镜下观察细胞形态学变化，用抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体和抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体进行免疫细胞化学染色鉴定诱导后的神经细胞。结果经全反式维甲酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合诱导后的BMSCs表现为神经细胞形态特征，诱导后的细胞可存活14 d以上，免疫细胞化学染色显示NSE和GFAP均有阳性表达，前者阳性率为65.6%，后者阳性率为12.5%。结论全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合应用可在体外高效、稳定地诱导无血清培养的BMSCs分化为神经细胞。     

致敏树突状细胞介导CTL抗骨髓瘤免疫的实验研究

目的比较两种树突状细胞(骨髓瘤致敏DC和未致敏DC)诱导的细胞毒T淋巴细胞抗自身骨髓瘤的细胞免疫：方法用多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓CD34^ 细胞诱生DC,将MM患者骨髓瘤冻融物冲击致敏DC。MTT法检测骨髓瘤抗原致敏和未致敏DC诱导的自身T细胞对患者骨髓瘤细胞的杀伤率。结果骨髓瘤冻融物致敏DC诱导的自身T细胞对患者骨髓瘤细胞的杀伤率远大于非致敏DC。结论患者骨髓瘤冻融物致敏的DC能有效诱导自身T细胞抗骨髓瘤免疫。     

小鼠脑垂体TSH细胞和ACTH细胞的体视学研究

用免疫组织化学PAP法,对小鼠脑垂体TSH细胞、ACTH细胞进行双重染色,在同一切片上同时显示两种细胞,观察细胞形态,并用体视学方法对两种细胞进行定量测定。结果显示,TSH细胞体积较大,呈多边形;ACTH细胞体积略小,呈不规则形。TSH细胞的体积密度、面数密度、数密度均高于ACTH细胞的相应数值,而TSH细胞的相邻细胞百分比则低于ACTH细胞的相应数值。     

携带SV40T/HSV-tk基因永生化正常成人肝细胞的构建

目的构建永生化正常成人肝细胞为生物型人工肝提供安全有效的人肝细胞源。方法转染包装细胞,获得逆转录病毒;将该病毒感染正常成人肝细胞HL-7702;更昔洛韦毒性实验检测转染后肝细胞内HSV-tk基因;RT-PCR法检测转染后细胞内SV40T的mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色检测转染后细胞内SV40T基因的蛋白表达。结果更昔洛韦检测转染后的肝细胞存活良好,而转染前的肝细胞死亡。RT-PCR法显示转染后的肝细胞内存在SV40T mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色法显示转染后肝细胞内存在SV40T蛋白。结论转染后的正常成人肝细胞中含有SV40T和HSV-tk基因,并表达相关蛋白。