煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞中心体及其调控蛋白的变化

目的 分析煤焦沥青烟提取物诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B恶变过程中细胞内中心体及其调控蛋白的变化,探讨中心体在煤焦沥青烟提取物致肺癌中的作用及机制.方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B的恶性转化模型,作为煤焦沥青烟提取物染毒组(煤焦沥青组),设溶剂对照组和正常对照组平行传代培养,用细胞爬片间接免疫荧光法检测中心体改变,用实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测相关基因的mRNA表达;细胞爬片免疫组化半定量法检测相关蛋白表达.结果 煤焦沥青组第20代细胞中心体总异常率为6.56％±1.01％,明显高于正常对照组(3.40％±0.86％)和溶剂对照组(3.14％±0.59％),差异有统计学意义(P＜0.05).与正常对照组(4.34％±1.04％)和溶剂对照组(4.33％±1.20％)比较,煤焦沥青组第30代细胞中心体总异常比例(22.39％±9.5％)明显增大,差异有统计学意义(P＜0.05).煤焦沥青组第20、30代细胞的P53、P21基因和蛋白表达明显降低,Cyclin E基因和蛋白表达明显升高,与正常对照组相和溶剂对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞恶性转化过程中,中心体异常出现在细胞恶性改变前.中心体异常可能是通过P53/P2 1/CyclinE通路异常而引起.     

煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞BEAS-2B染色体不稳定性研究

目的 建立煤焦沥青烟提取物诱导的人支气管上皮细胞BEAS-2B株的恶化模型;观察不同时期细胞的染色体不稳定性与细胞恶性转化之间的关系.方法用四唑蓝(MTT)法测定煤焦沥青烟提取物的细胞毒性,以煤焦沥青烟提取物诱导并观察BEAS-2B细胞传代转化过程中的形态学改变;软琼脂克隆形成实验检测细胞恶性转化能力,流式细胞术检测细...     

煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞恶性转化细胞端粒损伤研究

目的 探讨煤焦沥青致人支气管上皮细胞(BEAS-2B)恶变细胞的端粒损伤作用.方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化BEAS-2B的恶性转化模型,用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测端粒DNA长度和端粒酶活力变化.结果 煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞后,30代时诱导组细胞能在软琼脂上形成典型的阳性克隆,染色体二倍体核型比例显著降低,形成恶性转化细胞.BEAS-2B恶性转化细胞端粒DNA长度缩短(0.41±0.03),与正常对照组(1.01±0.08)和二甲基亚砜(DMSO)组(0.92±0.04)比较,差异均有统计学意义(P ＜0.001).BEAS-2B恶性转化细胞端粒酶活力增强(1.62:0.07),与正常对照组(1.03±0.08)和DMSO组(1.11±0.03)比较,差异均有统计学意义(P＜0.001).结论 端粒损伤在煤焦沥青致细胞恶性转化中起重要作用.     

煤焦沥青烟提取物致支气管上皮细胞系恶性转化细胞中Bub1和Mad2表达水平改变

目的 检测纺锤体检测点蛋白Bub1和Mad2在煤焦沥青致人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)癌变细胞中的变化,探讨Bub1和Mad2在煤焦沥青接触者肺癌发生中的作用.方法 利用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化BEAS-2B的恶性转化模型,用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bub1和Mad2基因的mRNA表达水平;采用细胞爬片免疫组化半定量法检测蛋白表达改变.结果 与正常对照组和二甲基亚砜(DMSO)组相比较,煤焦沥青烟提取物诱导转化细胞Bub1和Mad2基因mRNA和蛋白表达水平均减低,差异具有统计学意义(P＜0.05).正常对照组和DMSO组之间2种基因的mRNA和蛋白表达水平均没有明显改变,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在煤焦沥青致支气管上皮细胞恶性转化后,纺锤体检测点蛋白Bub1和Mad2表达水平降低.     

煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞端粒蛋白的变化

目的 通过检测端粒保卫蛋白复合体中端粒保卫蛋白1 (POT1)、端粒重复序列结合因子1(TRF1)和TRF2在煤焦沥青烟致永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)癌变细胞中的表达变化,探讨其在煤焦沥青烟致肺癌发生中的作用。方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立BEAS-2B的恶性转化模型,用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测POT1、TRF1和TRF2基因mRNA表达水平;细胞爬片免疫组化半定量法检测其蛋白表达改变。结果 BEAS-2B恶性转化细胞POT1和TRF1基因mRNA表达水平（分别为：0.63-0.04,0.36-0.01）和蛋白表达水平(分别为：0.36±0.05,0.09±0.03)均下调,与正常对照组(mRNA：POT1：1.00±0.04,TRF1：1.01±0.16;蛋白：POT1:0.55±0.07,TRF1：0.27±0.07)和二甲亚砜溶剂对照组(mRNA:POT1:0.89±0.12,TRF1：0.90±0.08;蛋白：POT1:0.55±0.10,TRF1:0.26±0.04)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。BEAS-2B恶性转化细胞TRF2基因mRNA表达水平( 1.45±0.07)和蛋白表达水平(0.88±0.06)均上调,与正常对照组(mRNA:1.00±0.07,蛋白：0.48±0.06)和二甲亚砜溶剂对照组（mRNA:1.00±0.06,蛋白：0.50±0.06）相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论 在煤焦沥青烟致支气管上皮细胞恶性演化过程中,POT1、TRF1和TRF2基因和蛋白表达水平发生变化。     

煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞Nrf2-Keap1/ARE通路的影响

[目的]研究煤焦沥青烟提取物对BEAS-2B细胞Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA和Nrf2蛋白表达的影响,以期探讨对抗煤焦沥青致细胞氧化损伤的分子靶标和通路。[方法]GC-MS检测煤焦沥青烟提取物的主要成分;采用细胞急性毒性实验,根据文献以及以往的实验将煤焦沥青烟提取物分为0.00、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/L五个染毒组,以BEAS-2B细胞为染毒对象进行实验;MTT法检测染毒BEAS-2B细胞生长增殖情况;RT-PCR检测Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的表达量;Western blot测定Nrf2蛋白的表达量。[结果]煤焦沥青烟提取物主要成分中86.02%为多环芳烃类化合物;浓度为1.25 mg/L时促进BEAS-2B细胞增殖,2.5～10 mg/L抑制细胞增殖;染毒组Nrf2 mRNA及蛋白表达量低于对照组,而Keap1 mRNA表达量高于对照组,差别均有统计学意义（P〈0.05）;在1.25～5.00 mg/L浓度范围内,随着染毒浓度的增加,Nrf2 mRNA和蛋白表达呈递增趋势,而染毒浓度为10.00 mg/L时,Nrf2 mRNA和蛋白的表达量均有所减少（P〈0.05）;NQO1 mRNA在2.5～5.00 mg/L浓度范围内随染毒浓度的增加表达水平逐渐升高。[结论]煤焦沥青烟提取物刺激BEAS-2B细胞后,可能通过Nrf2-Keap1/ARE通路来调节细胞抗氧化应激能力。     

人单核细胞对煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞TRAF2 mRNA表达的影响

目的探讨人单核细胞(THP-1)对煤焦沥青烟提取物(CTPE)诱导BEAS-2B细胞肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)mRNA表达的影响。方法构建THP-1细胞和BEAS-2B细胞的共培养模型,用终浓度3μg/m L的CTPE处理共培养模型,细胞培养至第9代时加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)中和抗体和C-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂SP600125,继续培养至第15代(CC15),设立共培养模型CC15组、TNF-α中和抗体组、JNK激酶抑制剂SP600125组,同代培养的BEAS-2B细胞为对照组,用Real-time PCR方法检测各组细胞中TRAF2 mRNA的相对表达水平。结果与CC10组相比,TNF-α中和抗体对共培养细胞作用不同时间时TRAF2 mRNA的相对表达量均降低(P0.001),作用48 h时TRAF2 mRNA相对表达水平达到最低(0.19±0.02)。SP600125抑制剂作用共培养细胞不同时间时c-Jun mRNA的相对表达水平与CC10组相比差异均有统计学意义(P0.001),36 h组表达水平最低(0.03±0.02)。TNF-α中和抗体组和SP600125抑制剂组TRAF2 mRNA相对表达水平(分别为1.73±0.04和1.88±0.05)均高于对照组(1.07±0.06),低于CC15组(2.23±0.09),差异有统计学意义(P0.05)。结论 THP-1可通过TNF-α上调了CTPE诱导的BEAS-2B细胞中TRAF2 mRNA的表达水平,TRAF2和AP-1之间可能存在负反馈作用。     

氡致BEAS-2B细胞早期恶性转化的研究

目的了解氡致BEAS-2B细胞早期恶性转化的特征。方法通过细胞气体染毒装置,将永生化的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)暴露于放射性气体氡,通过测定经氡照射后细胞周期、凋亡率、线粒体膜电位,判断照射后BEAS-2B细胞是否存在早期恶性转化趋势。结果染氡后细胞G1期缩短,S期延长,染氡细胞传代后晚期代数细胞凋亡率相比早期代数细胞降低,线粒体膜电位降低。结论短期染氡后,细胞周期等指标发生变化,出现恶性转化趋势。     

单核巨噬细胞在煤焦沥青烟提取物诱导永生化人支气管上皮细胞恶变中的作用

目的 探讨单核巨噬细胞(THP-1)在煤焦沥青烟提取物(coal tar pitch,CTP)致永生化人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,BEAS-2B)恶变过程中的作用及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)在该过程中的表达.方法 以THP-1和BEAS-2B为研究对象,设立CTP组、苯并(a)芘[B(a)P]组(阳性对照组)、二甲亚砜对照组(溶剂对照组)、BEAS-2B与THP-1共培养组,建立细胞恶性变模型.应用软琼脂集落形成实验、染色体数目畸变分析、流式细胞仪测定细胞周期中不同培养时期(10、20、30代)细胞的恶变情况,利用ELISA方法测定CTP组及共培养组细胞培养上清中TNF-α的含量.结果 染色体数目异常在实验的早期(10代)已经显现,表现为非整倍体和多倍体比例增加,二倍体数目减少.在第20代:共培养组克隆形成率(17.63‰±0.97‰)明显高于CTP组(13.94‰±0.84‰)和阳性对照组组(12.96‰± 1.62‰),差异有统计学意义(P＜0.05);共培养组S期细胞比例(44.49％±0.68％)明显高于CTP组(38.19％±1.26％)和阳性对照组(36.41％±1.19％),差异有统计学意义(P＜0.05).共培养组细胞培养上清中TNF-α含量明显高于CTP组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 THP-1能够加速CTP诱导的BEAS-2B恶变,增加TNF-α的表达水平.     

青石棉诱导BEAS-2B细胞ERK1/2磷酸化表达的研究

目的 了解青石棉在致癌过程中引起信号转导蛋白变化的特点.方法 使用人呼吸道上皮细胞株（human bronchial epithelial cell line,BEAS-2B）体外培养,以终浓度100 μg/ml的青石棉和100nmoL/L表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）分别刺激BEAS-2B细胞30和120min,使用特异性抗磷酸化细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK1/2）、ERK激酶（ERK kinase,MEK1/2）和抗总ERK1/2、MEK1/2抗体进行Western免疫印迹,检测相应的蛋白表达水平.结果 青石棉刺激BEAS-2B细胞30 min后,可诱导磷酸化ERK1/2的快速高表达,且此高表达可持续至120 min,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;EGF作为诱导磷酸化ERK1/2的阳性刺激物,在30和120 min两时段内均可诱导ERK1/2的激活,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;任何时间段刺激BEAS-2B,在对照、青石棉和EGF组间,总ERK1/2表达差异无统计学意义（P＞0.05）.青石棉刺激BEAS-2B细胞30、120 min后,可诱导磷酸化MEK1/2的快速高表达,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 青石棉可快速诱导BEAS细胞产生磷酸化ERK1/2、MEK1/2蛋白的高表达,提示MAPKs参与了青石棉所致疾病的过程.     

多环芳烃受体基因与细胞色素P4501A1/1B1基因表达的调控

目的 在体外人神经细胞瘤细胞株(SK-N-AS)中，以二恶英(TCDD)、三甲基胆蒽(3-MC)作为诱导化合物，探讨多环芳烃受体(AHR、ARNT)基因与细胞色素P4501A1／1B1(CYPlAl、CYPlBl)基因表达的调控，并研究其剂量反应关系和时间反应关系。方法 用常规的细胞培养方法，用二甲基亚砜(DMSO)、5．0、50．0、100．0nmol/L TCDD和0.1、1.0、10．0μmol/L 3-MC处理细胞12h、24h、48h、72h，利用提纯RNA和合成cDNA的药盒，合成cDNA，然后通过逆转录聚合跨反应(RT-PCR)表达AHR、ARNT和CYP1A1,CYP1B1基因，以β-actin作为内对照，分析不同处理剂量、时间时基因表达的强度。结果 4种基因在SK-N-AS中都有基本的表达，TCDD在50．0nmol/L以上，染毒处理48h、72h，对AHR、ARNT及CYPlAl基因表达都有上调作用；5．0nmol/L组在染毒处理72h后对AHR基因表达，50．0和100．0nmol/L组分别在染毒处理72h和48h时对CYPlBl基因表达也有上调作用；3-MCl．0、10.0umol/L在染毒72h后对AHR、ARNT、CYPlAl基因表达有上调作用，其中10．0μmol/L组在染毒48h后就有上调作用，但对CYPlBl基因表达上调仅仅在10．0μmol/L染毒48h组。结论 本研究结果提示，TCDD、3-MC两种多环芳烃类化合物在SK-N-AS中，在一定剂量和一定时间状态下对AHR、ARNT、CYPlAl及CYPlBl都有调控作用。     

IRE1通路在高碘诱导甲状腺细胞凋亡中的作用

目的 观察IRE1通路在高碘诱导甲状腺细胞凋亡中的特征,进一步分析高碘诱导甲状腺细胞凋亡的作用机制.方法 用0(对照)、1、10、50 mmol/L的碘化钾(KI)染毒体外培养的Nthy-ori 3-1细胞,24h后采用流式细胞术检测Nthy-ori 3-1细胞凋亡率,用荧光定量PCR及Western blot检测葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、肌醇需求酶-1(IRE1)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)基因蛋白的表达水平.结果 与0(对照)、l、10 mmol/L KI染毒组相比,50 mmol/L KI染毒组细胞凋亡率升高(P＜0.05);与对照组相比,各染毒组GRP78、IRE1 mRNA表达水平均无统计学差异(P＞0.05),CHOP mRNA表达水平升高(P＜0.05),GRP78、IRE1和CHOP蛋白表达差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 内质网应激中IRE1通路可能没有参与高碘诱导的Nthy-ori 3-1细胞凋亡过程.     

1,25-二羟基维生素D3对大鼠脾辅助性T细胞分化基因表达谱的影响

目的:研究1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]对大鼠脾辅助性T细胞(Th细胞)分化基因表达谱的影响.方法:采用近交系大鼠,随机分成实验组和对照组.实验组以1,25(OH)2D3 1μg/(只·d)连续灌胃14 d;对照组以同等体积赋形剂代替,第15天腹腔注射致死剂量脂多糖(LPS) 10 mg/kg,6 h后处死,用功能分类Th1-Th2-Th3芯片检测脾Th细胞的基因表达谱.用Realtime-PCR法验证差异表达的相关基因的结果.结果:功能分类Th1-Th2-Th3芯片共有99条基因,实验组与对照组对比,共有35条基因差异表达,占芯片基因总数的35.35%,其中12条基因上调,23条下调.差异表达的基因主要是细胞因子(受体)和调控Th细胞分化的转录因子.结论:1,25(OH)2D3抑制大鼠脾Th1型免疫反应,使免疫反应向Th2方向偏移.1,25(OH)2D3主要通过调节细胞因子基因和Th细胞分化信号通路中转录因子基因表达.     

抗氧化剂对黄曲霉毒素染毒的转基因小鼠肝肿瘤的防护

目的研究抗氧化剂２,３叔丁基４羟基茴香醚（ＢＨＡ）对黄曲霉毒素（ＡＦＢ１）染毒的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）转基因小鼠肝肿瘤发生的防护作用。方法对ＡＦＢ１染毒和未染毒的４９只转基因小鼠与４８只非转基因小鼠,测定肝醌还原酶（ＱＲ）和谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）活性、肝丙二醛（ＭＤＡ）含量、肝氧自由基浓度（ＯＦＲ）。结果染毒的转基因小鼠ＢＨＡ组肝腺瘤发生率１７％,癌变率０,显著低于普通饲料组的肝腺瘤发生率（６７％）和癌变率（２２％）。与普通饲料组比较,ＢＨＡ使肝ＯＦＲ和ＭＤＡ含量显著降低;ＢＨＡ组肝ＱＲ和ＧＳＴ活性平均升高３～７倍。结论ＢＨＡ能显著诱导肝脏生物转化Ⅱ相酶活性,清除氧自由基,抑制变异肝细胞生长,可能与抑制或延缓小鼠肝癌的发生、发展进程有关