靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化。结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率。分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因。结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础。     

APRIL shRNA表达载体的构建与筛选

目的 构建并筛选有效的、编码短发夹RNA(shRNA)的增殖诱导配体(APRIL)基因特异性真核表达裁体.方法 分别设计、合成4对寡核苷酸单链,经退火、连接得到APRIL-shRNA双链,定向克隆至带有H1启动子、绿色荧先蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和Neo基因的pGCsi-H1/Neo/GFP质粒裁体中,柏建4条含APRIL基因shRNA的pGCsi-H1/Neo/GFP-APRIL-shRNA真核表达裁体,转染高表达APRIL的结直肠癌细胞株SW480.G418筛选,荧光显微镜下现察转染效率,FQ-RT-PCR检测APRIL mRNA水平,Western印迹分析APRIL蛋白表达.结果 测序证实pGCsiH1/Neo/GFP-APRIL-shRNA(APRIL shRNA)构建成功,无碱基突变,4种不同shRNA质粒转染细胞后APRIL mRNA和蛋白表达差别有统计学显著性意义(P＜0.01).结论 成功地构建APRIL shRNA真核表达裁体,敲低效率85%以上,可用于后续的实验研究.     

靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究EZH2基因在肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

血管内皮生长因子表达载体的构建及在内皮祖细胞中的表达

背景：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有很强的促进血管生成作用，但构建其真核表达质粒是否可转染缸管内皮祖细胞并完整表达还不清楚。目的：构建VEGF表达载体，并观察其在内皮祖细胞中的表达情况。设计、时间及地点：观察性试验，于2007-12／2008-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心实验室完成。材料：质粒PDC315-VEGFl65自备，质粒pIRES2-EGFP由美国国立卫生研究院Stanko Stojilkovic教授惠赠。方法：运用DNA重组技术构建VEGF表达载体pIRES2-EGFP-VEGF，应用脂质体包裹的方法将载体转染猪外周血血管内皮祖细胞。主要观察指标：采用荧光显微镜观察VEGF在内皮祖细胞内的表达，反转录．聚合酶链反应法检测VEGFmRNA表达水平，ELISA检测VEGF165蛋白表达情况。结果：成功构建VEGF真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF。转染重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF后，在内皮祖细胞内有VEGF的表达，VEGFmRNA和VEGF165蛋白表达水平均明显增加。结论：VEGF表达载体转染猪外周血血管内皮祖细胞后能有效增加VEGF基因的表达，能够获得较高水平的VEGF蛋白。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

血管内皮生长因子反义基因真核表达载体构建的研究

微血管的生成与肿瘤的生长、发展与转移密不可分,抑制血管生成已成为近年来抗肿瘤治疗研究的重要课题和热点问题.结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康,探索治疗结肠癌新技术、新方法具有重要的临床价值.本实验将血管内皮生长因子反义基因成功克隆构建了真核表达载体,为下一步结肠癌细胞体外培养干预实验和临床抗肿瘤应用试验做好了前期工作.     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞☆

背景:血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义.目的:克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建 pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性.方法:采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和 DNA 测序的方法对提取和重组 DNA 进行鉴定.pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定.结果与结论:构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段.提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性.     

靶向血管内皮生长因子基因的微小RNA真核表达载体的构建

背景:有研究表明微小RNA及潜在靶基因在肝癌中起重要作用,但具体机制仍不清楚。目的:构建靶向血管内皮生长因子基因微小RNA真核表达载体,评估其转染人肝癌细胞株HepG2后血管内皮生长因子基因的干扰效果。方法:根据血管内皮生长因子序列设计合成4对微小RNA不同干扰片段,克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-微小RNA真核表达载体上,测序分析鉴定插入序列的完整性;并将其转染至HepG-2细胞株中。采用实时荧光定量聚合酶链式反应分析血管内皮生长因子微小RNA干扰效果,蛋白印迹技术测定重组体对血管内皮生长因子基因蛋白表达情况。结果与结论:构建的4组重组体插入片段的碱基序列完全正确,重组体能干扰肝癌细胞HepG2细胞血管内皮因子基因的表达,4组重组体基因的mRNA的表达水平和蛋白表达水平与阴性对照组相比明显降低(P<0.05),其中血管内皮生长因子微小RNA-3表达水平最低,抑制率87%。结果证实,实验成功构建血管内皮生长因子微小RNA表达载体,在体外能有效抑制HepG2细胞血管内皮生长因子基因表达。     

靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒，为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并连接入pGenesil-2载体，并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中，经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体，为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

有利于创伤修复愈合的人血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的真核表达质粒pcDNA3-VEGF.方法采用PCR技术和DNA重组技术,将编码人VEGF的cDNA序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)上,挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.结果从HepG2细胞中克隆出VEGF121基因的cDNA片段,该序列由Kozak序列,翻译起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.DNA测序表明,VEGF121基因的cDNA序列正向插入到pcDNA3.1(+)的多克隆位点上.结论本研究获得了VEGF121基因的真核达质粒pcDNA3-VEGF,为进一步研究VEGF的转基因治疗奠定基础.     

重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定

目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体,为进一步的基因转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165,并克隆入穿梭质粒pAdTraek CMV.构建的质粒pAdTrack CMV-VEGF165经酶切及测序鉴定正确后,通过pAdeasy 1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrack CMV.VEGF165共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrack CMV.VEGF165.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,测定病毒滴度.结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF,病毒滴度为0.5×10"pfu/ml.结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础.     

整合稳定靶向高迁移率族蛋白B1基因shRNA载体的人脐静脉内皮细胞株建立

目的 构建针对高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)基因的特异性RNA干扰载体,建立稳定转染该干扰载体的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC).方法 根据HMGB1基因的编码序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计并合成针对HMGB1基因的特异性shRNA,将其定向克隆到pRNA-u6.1/Neo载体中,同时设立阴性对照,重组载体经脂质体转染HUVEC;转染细胞经类氨基糖抗生素样物质G418筛选,采用实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测HMGB1mRNA表达,蛋白质免疫印迹法检测HMGB1蛋白表达.结果 酶切鉴定和测序证实,重组质粒shRNA序列与设计的片段完全一致.HMGB1基因特异性RNA干扰载体能够显著抑制HMGB1在HUVEC细胞中的表达(mRNA:0.4635±0.0342比1.0340±0.0352,蛋白:0.4510 ± 0.0200比1.0210±0.0110,均P＜0.05).结论 成功构建了靶向HMGB1基因的shRNA真核表达载体pRNA-HMGB1,并获得了稳定表达靶向HMGB1基因的shRNA的HUVEC细胞株,为进一步研究HMGB1在HUVEC细胞株中的生物学功能和作用机制奠定了基础.     

表皮生长因子受体和血管内皮生长因子在乳腺癌中的表达及临床意义

目的:观察表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子(VEGF)在乳腺癌组织中的表达特点及临床意义。方法:应用免疫组织化学方法观察EGFR和VEGF在59例乳腺癌组织中的表达情况。结果:59例乳腺癌组织中,EGFR阳性率为93.2%(55/59),VEGF染色全部呈阳性(59/59),EGFR表达在乳腺癌组织分级和淋巴结是否转移之间比较差异有显著性(均P<0.05)。PR阳性组中VEGF表达水平较高(P<0.05),EGFR和VEGF两者的表达呈正相关(P<0.05)。结论:EGFR和VEGF在乳腺癌的生物学行为中起着一定的作用,研究两者联合表达有一定的临床意义。     

携带入VEGF165的腺病毒载体的构建及鉴定

目的　构建携带人血管内皮生长因子 (VEGF) 16 5基因的重组腺病毒载体 ,用于治疗重症冠心病。方法　将人VEGF16 5cDNA正向插入到穿梭质粒 pHCMVSP1A的CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,即pAd hVEGF16 5 ,通过脂质体与pJM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人VEGF16 5基因的重组腺病毒载体Ad hVEGF16 5。通过PCR扩增法鉴别Ad hVEGF16 5 ,根据A2 60nm计算病毒滴度。结果　人VEGF16 5cDNA成功地正向插入到 pHCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了 5 76bp的VEGF16 5cDNA基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad hVEGF16 5的正确性。测病毒滴度为 1.94× 10 12 pfu/ml。结论　携带人VEGF16 5的腺病毒载体的成功构建为用VEGF16 5基因治疗冠心病奠定了基础。     

血管内皮生长因子在乳腺癌中的表达及临床意义

目的 研究血管内皮生长因子(VEGF)在乳腺癌中的表达及临床意义.方法 应用S-P免疫组化方法检测60例乳腺癌组织(乳腺癌组)和20例乳腺良性病变组织(乳腺纤维腺瘤组)中VEGF的表达情况,结合临床及病理形态学资料进行统计分析.结果 乳腺癌组中VEGF阳性表达49例;乳腺纤维腺瘤组中VEGF阳性表达4例;2组VEGF阳性率比较差异有统计学意义(81.67％与20.00％,u=4.39,P=0.000).VEGF的表达与淋巴结转移、肿瘤大小、组织学分级和临床分期呈正相关(rs =0.357、0.594、0.680、0.540,P均＜0.05),与患者年龄、雌激素、孕激素受体情况无相关性(P均＞0.05).结论 VEGF可能与乳腺癌的进展、转移及预后有关,作为独立的指标对判定预后具有参考意义.     

人表皮生长因子真核表达载体的鉴定

目的：鉴定人表皮生长因子的真核表达载体。方法：重组体进行限制性酶切及PCR可见目的片段。结果：pCDDA3.1—hEGF真核表达载体已成功构建。结论：已成功构建hEGF真核表达裁体，为进一步研究hEGF的功能奠定了基础。     

靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。 目的：利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。 方法：选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定,应用蛋白质印迹和免疫荧光技术,在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。 结果与结论：蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明,重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实,实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体,此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。     

血管内皮细胞生长因子反义RNA抑制人食管癌血管生成及生长和转移作用的研究

目的探讨血管内皮细胞生长因子反义RNA在调节食管癌血管生成及生长、转移中的作用。方法用脂质体法将血管内皮细胞生长因子反义RNA转染到人食管癌TE-1细胞,噻唑蓝还原法检测细胞增殖情况;免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应技术检测血管内皮细胞生长因子蛋白和mRNA的表达水平,并将转基因肿瘤细胞接种于裸鼠体内,应用免疫组化法检测肿瘤内微血管密度,探讨微血管密度与肿瘤生长及转移的关系。结果反义血管内皮细胞生长因子基因的转染,使肿瘤细胞血管内皮细胞生长因子分泌减少,反义组裸鼠的肿瘤组织微血管密度(11.0±7.6)明显低于对照组及空载体组(50.8±11.7、48.9±7.0)(均为P<0.01)。结论血管内皮细胞生长因子反义RNA可使肿瘤细胞分泌血管内皮细胞生长因子减少,血管生成能力降低,有望成为食管癌基因治疗的靶基因之一。     

卵巢肿瘤的血管内皮生长因子表达和肿瘤微血管密度计数的意义

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达和肿瘤微血管密度(MVD)与卵巢恶性肿瘤预后的关系。方法采用免疫组织化学染色的方法检测94例卵巢上皮性肿瘤患者(其中良性上皮性肿瘤患者17例,交界性上皮性肿瘤患者13例,上皮性卵巢癌患者64例)中VEGF表达情况及MVD计数。结果在上皮性卵巢癌、交界性上皮肿瘤、良性卵巢肿瘤中VEGF阴性分别为:2例(3%)、4例(31%)、16例(94%);VEGF低度表达分别为:31例(48%)、7例(54%)、1例(6%);VEGF高度表达分别为:31例(48%)、2例(15%)、0例。VEGF蛋白高度表达与肿瘤的临床分期、细胞分化程度及患者预后有明显的相关性。MVD与肿瘤的临床病理特征无明显的相关性。VEGF蛋白高度表达者的生存率比VEGF无或低度表达者差。结论VEGF蛋白表达的测定可以帮助判断卵巢上皮癌患者的预后,在指导临床治疗方面有重要意义。