应用聚合酶单链构象多态技术检测葡萄糖6磷酸脱氢酶基因突变

为了探索一种快速，灵敏及准确的检测红细胞葡萄糖６－磷酸脱氢酶基因点突变方法，我们采用单链构象多态技术，对２０例Ｇ６ＰＤ变异型基因外显子２进行分析。发现有４例患者双链ＤＮＡ中有一条链出现泳动变位，明显慢 于正常人及其他患者，用ＰＣＲ直接测表明在ｃＤＮＡ第９５位核苷酸发生碱基置换。结果说明ＳＳＣＰ技术检测点突变具有广泛的应用前景，比现行的突变检测方的行。作者还对ＰＣＲ－ＳＳＣＰ的优点和所突变的特点进行     

聚合酶链反应技术在腓骨肌萎缩症基因诊断中的应用

目的 探讨应用聚合酶链反应（ＰＧＲ）技术建立中国人腓骨肌萎缩症（ＣＭＴ）基因诊断的方法。方法 分别应用ＰＣＲ－双酶切、聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）、聚合酶链反应－变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）或ＰＣＲ直接测序等方法对３２个确诊的ＣＭＴ家系进行了ＰＭＰ２２、ＭＰＺ、Ｇx３２等致病基因的突变检测。结果 ２１．９％的ＣＭＴ家系患者有Ｇx３２、ＭＰＺ和ＰＭＰ２基因的突变。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测到１０个家系有异常泳带,经ＰＣＲ测序证实有５个为多态;另５个为与疾病相关的致病的点突变,即４个Ｇx３２和１个ＭＰＺ基因的点突变。PCR-双酶切诊断了２个包含ＰＭＰ２２基因在内的大片段重复突变的ＣＭＴ１Ａ型家系。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ仅１个家系患者异常泳带,该结果也可经ＰＣＲ－ＳＳＣＲ方法检出。结论 ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－双酶切可作为Ｇx３２、ＭＰＺ、ＰＭＰ２２基因的点突变和ＣＭＴ１Ａ的大片段重复突变的初筛的方法,而ＰＣＲ－ＤＧＧＥ方法用于Ｇx３２基因的突变检测不理想,点突变应经ＤＮＡ测序证实。     

Crouzon综合征FGFR2基因第9外显子突变的研究

目的：研究Ｃｒｏｕｚｏｎ综合征的病因。方法：应用聚合酶链反应－－单链构象多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）技术结合ＰＣＲ产物直接测序方法对６例Ｃｒｏｕｚｏｎ综合征家系（２１名患者，１５名正常人）的成纤维细胞生长因子受体２（ＦＧＥＲ２）基因第９外显子进行了分析。结果：ＳＳＣＰ检测发现５种异常泳动变位，ＤＮＡ直接测序证实为种突变类型，Ｔｙｒ３４０Ｈｉｓ，Ｃｙｓ ３４２Ｔｒｐ，Ｃｙｓ ３４２ Ｔｙｒ及３４４Ａｌａ     

白血病中P16基因突变的检测

用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）、ＤＮＡ直接测序和多重ＰＣＲ法，检测了１８例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ），１例Ｋ５６２细胞株，９例急性粒细胞性白血病（ＡＭＬ），６例急性淋巴细胞性白血病（ＡＬＬ），２例多发性骨髓瘤（ＭＭ）患者外周血／培养细胞ＤＮＡ中Ｐ１６基因的点突变和基因缺失。用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ共筛查出５例ＣＭＬ中Ｐ１６基因的异常，突变率为２７．８％（５／１８），对其中１例外显子２异常者经测序证实为第１５１密码子ＣＣＣ→ＣＧＣ的转换，导致Ｐｒｏ→Ａｒｇ的错义突变；并检出１例ＭＭ中Ｐ１６基因外显子３的异常；受检的ＡＬＬ，ＡＭＬ，Ｋ５６２细胞株中，未检出突变。各病例中均未检出Ｐ１６基因的缺失。本文探讨了白血病中Ｐ１６基因突变的意义。     

肝豆状核变性基因12号外显子突变特征的研究

目的 研究中国人肝豆状核变性（ＷＤ）基因１２号外显子的突变特征,为建立直接基因诊断的方法提供理论依据。方法 应用聚合酶链反应－单链构象多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）技术,对４４例无亲缘关系的确诊患者和６０名正常对照组进行ＷＤ基因第１２号外显子的突变检测,并用ＤＮＡ测序证实其突变性质和位置。结果 ８例患者在１２号外显子检测到２种错义突变,占１８％（８／４４）,其中６例为Ｔｈｒ９３５Ｍｅｔ突变,２例为Ｇｌｙ     

Rett综合征患者线粒体DNA突变的初步分析

目的 探讨线粒体ＤＮＡ在Ｒｅｔｔ综合征发病中的作用。方法应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、聚合酶链反应（ＰＣＲ）－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析及ＤＮＡ直接测序结合错配ＰＣＲ的方法，对１５例Ｒｅｔｔ综合征患儿及其中１４例的母亲的外周血白细胞线粒体ＤＮＡ的部分片段进行分析。结果１３例患儿及其中１１例的母亲的线粒体ＤＮＡ上，编码１６ＳｒＲＮＡ基因的２６５０－３０００区域ＤＮＡ突变，其中７例患儿及其中６例的母亲存在２８３５位点的点突变（Ｃ－Ｔ），３０例正常对照均未发现有此点突变。结论线粒体ＤＮＡ在Ｒｅｔｔ综合征的发病中起一定作用。     

肝细胞癌患者中p53基因的突变研究

为了解肝细胞癌（ＨＣＣ）中ｐ５３基因的突变情况，收集８６例ＨＣＣ手术切除标本，采用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ／ＳＳＣＰ）、聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（ＰＣＲ／ＲＦＬＰ）和ＤＮＡ序列分析，研究了ｐ５３基因的突变情况。８６例ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变率为３６％，其中，密码子２４９的突变率为３３．７％，１例ＳＳＣＰ和ＲＦＬＰ均提示密码子２４９存在突变者经ＤＮＡ序列分析显示密码子２４９的第三个碱基发生了ＡＧＧ／ＡｒｇＡＧＴ／Ｓｅｒ突变。以上结果提示，ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变主要以点突变为主，主要发生在密码子２４９，其突变率、突变谱和突变方式与启东等ＨＣＣ高度流行区相似     

骨髓增生异常综合征患者N－ras原癌基因突变的研究

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及直接测序法研究ＭＤＳ患者Ｎ－ｒａｓ原癌基因点突变。检测２６例（２８例次），发现Ｎ－ｒａｓ原癌基因第１外显子突变者１４例（５０％），统计表明Ｎ－ｒａｓ原癌基因突变与ＭＤＳ白血病转化及患者生存期缩短均有相关性（Ｐ＜０．０５），对预测ＲＡ、ＲＡＳ转化白血病有参考价值。对１例发现突变的标本进行直接测序证实为１２密码子第２碱基的Ｇ→Ａ转换。     

骨髓增生异常综合征患者N—ras原癌基因突变的研究

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及直接测序法研究ＭＤＳ患者Ｎ－ｒａｓ原癌基因点突变。检测２６例（２８例次），发现Ｎ－ｒａｓ原癌基因第１外显子突变者１４例（５０％），统计表明Ｎ－ｒａｓ原癌基因突变与ＭＤＳ白血病转化及患者自下而上期缩短均有相关性（Ｐ〈０．０５），对预测ＲＡ、ＲＡＳ转化白血病有参考价值。对１例发现突变的标本进行直接测序证实为１２密码子第２碱基的Ｇ→Ａ转换。     

人胰腺腺癌中抗癌基因P53的突变

用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析及ＤＮＡ直接测序法检测了１６例胰腺腺癌的Ｐ５３基因５－８外显子，结果发现３７．５％有Ｐ５３基因点突变，突变分布于外显子５－８，无特殊突变倾向点。６例有Ｐ５３突变者，５例为１个等位基因突变，另１个等位基因丢失；１例同时含有突变型和隆型等位基因。     

昆明地区孕妇夫妇及新生儿6种常见葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变类型分析

初步计算昆明地区孕妇夫妇及新生儿葡萄糖－6－磷酸脱氢酶基因六种基因突变类型（G1376T，G1388A，A95G，C102T，C592T及G392T突变）的频率。应用突变性扩增系统（ARMS）法筛查昆明地区孕妇夫妇及新生儿49例葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PD）基因的G1376T，G1388A，及A95G突变。未定型者应用错配引物介导的PCR／限制性酶切分析法筛查C102T，C592T及G392T突变，所选病例经G6PD／6PGD比值法确证，结果：49例患者（男性20例，女性29例）中，检出G1376T10例，占20．41％，G1388A18例，占36．73％。A95G2例，占4．08％，未检出C1024T，C592T，G392T突变，剩余19例为未定型者，结果表明，ARMS法为一种快速，经济，准确的检测G6PD基因突变的方法，ARMS法与错配引物介导的PCR／限制性酶切分析法相结合，则结果更为可靠。     

云南省重点地区疟疾病例G6PD基因突变研究

目的 通过分析云南省间日疟病例G6PD基因特征,摸清病例G6PD基因分子流行病学分布,为云南省疟疾规范治疗提供技术参考。方法 收集2016年度云南省间日疟病例标本和病例流行病学史等信息,对照G6PD基因特征序列,采用聚合酶链式反应扩增目的基因片段,获得分析片段,对获取的片段进行电泳并进行序列测定。结果 使用MEGA及SPSS进行分析,分析位点突变率、群体间遗传分化指数及地区间突变差异情况。结果共计检测样本188份,基因主要突变类型为点突变（point mutation）,20280 C>T和1311 T>C突变率较高,突变率均为78.1%（147/188）,1311 T>C系沉默突变（silent mutation）,20280 C>T突变表现为单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism）;未发现A95G、G1376T和G1388A突变。通过比对,云南间日疟病例G6PD基因与GenBank G6PD基因遗传距离为0.00~0.028,1311突变型（T>C）与1311野生型遗传距离为0.021。腾冲市1311 T>C突变率为92%（23/25）,盈江县1311 T>C突变率为77.8%（102/131）,两者差异无统计学意义（P>0.05）。结论 云南省间日疟病例G6PD基因主要突变位点地区间差异不明显,现有的疟疾治疗方案不需要调整,但治疗时应密切关注药物性溶血的发生。     

贵阳地区新生儿G6PD缺乏症分子筛查结果分析

目的：了解贵阳地区葡萄糖‐6‐磷酸脱氢酶（G6PD ）缺乏症的发生率及基因突变分布情况。方法选取新生儿脐血DNA样本515例,采用基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱系统检测G6PD基因15种突变类型和1种多态位点。结果515份样本检出G6PD基因突变10例,检出率为1．94％。检出5种突变类型：1388G＞ A 4例（40．0％）,1024C＞ T 和519C＞ T各2例（20．0％）,1376G＞ T和95A＞G各1例（10．0％）。多态位点1311C＞T的等位基因频率为12．79％。结论贵阳地区是G6PD缺乏症的高发区,1388G＞A是该地区最常见的G6PD基因突变类型。     

海南省新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因突变型分析

[目的]通过对新生儿疾病筛查中确诊的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患儿进行基因检测,确定海南省新生儿G6PD缺乏症的分子生物学基础.[方法]通过荧光斑点法在新生儿群体中筛查出可疑或阳性者,经G6PD/6GPD比值法确诊.将G6PD缺乏症患儿静脉血做DNA直接扩增法(PCR)、PCR-等位基因特异的寡核苷酸探针(PCR-ASO)分析、PcR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析和PCR-单链构型多态性(PCR-SSCP)分析,检测基因突变.[结果]G6PD缺乏症新生儿51例中属于G1 376T的16例(31.37%)、属于G1 388A的11例(21.57%)、属于A95G的4例(7.84%)、属于G392T的2例(3.92%)、属于G871A的2例(3.92%)、属于A835T的1例(1.96%),属于T517C的1例(1.96%);余14例没有发现上述突变.[结论]海南省新生儿G6PD缺乏症的基因突变型与我国该遗传病其他高发地区的基因突变谱相似;未发现A835G-G6PD-海口突变型.     

G6PD缺陷症基因型分析：一种新的错义突变

目的 对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷症患者进行G6PD基因型分析,分析基因突变类型.方法 选取经G6PD活性测定确诊为G6PD缺陷症的49例患者和100名G6PD活性正常的体检者的全血标本,PCR和DNA测序法对G6PD基因外显子2～13进行序列分析.结果 49例G6PD缺陷症患者中,共发现12种错义突变,其中常见的三种为G6PD G1388A(26.5%)、G1376T(28.6%)和A95G(14.3%),此三类基因型患者G6PD活性仅为正常人群的5%～18%.临床主要表现为新生儿黄疸、进食蚕豆后发生急性溶血性贫血等.其余突变类型包括C1024T(4.1%)、C1225T(2.0%)、C1159T(2.0%)、G487A(4.1%)、G392T(4.1%)、G1160A(6.1%)、G871A/C1311T(4.1%)和C406T/C1311T(2.0%);在外显子7上发现了一种新的错义突变即G691C,该突变造成G6PD第231位丙氨酸(Ala)被脯氨酸(Pro)替代.正常对照标本未发现相同的基因改变.结论 G6PD基因G1388A、G1376T和A95G是G6PD缺陷症患者最常见的三种突变类型.新发现的G691C突变导致Ala231Pro,是引起红细胞G6PD活性降低,患者临床出现溶血症状的主要原因.     

G6PD缺陷症基因型分析：一种新的错义突变

目的对葡萄糖-6磷-酸脱氢酶（G6PD）缺陷症患者进行G6PD基因型分析,分析基因突变类型。方法选取经G6PD活性测定确诊为G6PD缺陷症的49例患者和100名G6PD活性正常的体检者的全血标本,PCR和DNA测序法对G6PD基因外显子2~13进行序列分析。结果 49例G6PD缺陷症患者中,共发现12种错义突变,其中常见的三种为G6PD G1388A（26.5%）、G1376T（28.6%）和A95G（14.3%）,此三类基因型患者G6PD活性仅为正常人群的5%~18%。临床主要表现为新生儿黄疸、进食蚕豆后发生急性溶血性贫血等。其余突变类型包括C1024T（4.1%）、C1225T（2.0%）、C1159T（2.0%）、G487A（4.1%）、G392T（4.1%）、G1160A（6.1%）、G871A/C1311T（4.1%）和C406T/C1311T（2.0%）;在外显子7上发现了一种新的错义突变即G691C,该突变造成G6PD第231位丙氨酸（A la）被脯氨酸（Pro）替代。正常对照标本未发现相同的基因改变。结论 G6PD基因G1388A、G1376T和A95G是G6PD缺陷症患者最常见的三种突变类型。新发现的G691C突变导致A la231Pro,是引起红细胞G6PD活性降低,患者临床出现溶血症状的主要原因。     

Prevalence of beta-thalassemia trait and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in Iranian Jews

BACKGROUND: beta-thalassemia is the most common inherited single gene disorder worldwide, and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is the most common human enzyme deficiency. The goal of this study was to compare the frequency of beta-thalassemia trait and G6PD among the Moslem and Jewish populations in Shiraz, southern Iran. METHODS: We examined 201 Moslems and 187 Jewish subjects who were selected by random sampling. For diagnosis of thalassemia, complete blood count and hemoglobin electrophoresis were carried out and for G6PD deficiency, fluorescent spot test methods were used as a screening test. RESULTS: Among Moslem subjects, 14 cases (7.0%) were diagnosed as carriers of beta-thalassemia minor, whereas no carriers were detected among Jewish subjects. Seven Moslems (7%) and eight Jewish subjects (7.5%) were found to have G6PD deficiency. Among both groups the most common mutation was the Mediterranean type (563 C>T). In one Moslem subject, the detected mutation was 1003 (G>A) and in two Jewish subjects the mutations were 1376 (G>T) and G6PD A-. CONCLUSIONS: Whereas the frequency of beta-thalassemia minor among Moslems is higher than in the Jews in Shiraz, the frequency of G6PD deficiency was not significantly different in the two populations. These findings suggest that obligatory premarital beta-thalassemia screening for Jews in the community is not necessary, whereas neonatal screening for G6PD could be useful for both Jews and Moslems.     

帕金森病患者线粒体DNA突变位点G1719A、G4580A、C7028T分析

目的研究有关线粒体DNA（mtDNA）点突变与我国人群散发性帕金森病（Parkinson disease,PD）的关系。方法采用经典的酚／氯仿抽提法对88例PD患者（研究组）和60例健康体检者（对照组）的全血基因组DNA进行抽提,针对与PD发病有关的mtDNA突变位点G1719A、G4580A、C7028T设计特异的引物,经过PCR鉴定和基因测序,在NCBI基因库上进行BLAST比对分析,发现突变位点。结果PD患者有10例在C7028T位点发现突变,8例在G1719A位点发现突变,3例在G4580A位点发现突变,对照组未发现突变位点。结论散发性PD患者存在线粒体基因的点突变,线粒体基因的点突变可能参与PD的发病过程。     

一种新的G6PD基因突变型的鉴定

目的:鉴定1例葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者的基因突变。方法:用聚合酶链反应、限制性内切酶筛查葡萄糖-6-磷酸酶基因1388G→A、1376G→T、1360C→T、1024C→T、592C→T、517T→C、493A→G,487G→A、392G→T、95A→G突变,用单链构象多态性筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的所有外显子,用核苷酸序列测定确定基因突变。结果:该患者未存在1388G→A、1376G→T、1360C→T、1024C→T、592C→T、517T→C、493A→G、487G→A、392G→T、95A→G突变,但在外显子8发现了一种新的G6PD基因突变———835A→G突变,此突变导致第279位的苏氨酸被丙氨酸取代,将其命名为G6PD-海口,其酶活性约是正常的10%,比835A→T突变型的活性低,后者的酶活性约是正常的40%;分析人G6PD的三维结构模型表明,第279位苏氨酸残基的羟基对于维持G6PD亚基的相互作用具有非常重要的作用。结论:835A→G突变是一种新的G6PD基因突变型,G6PD的第279位苏氨酸残基的羟基是维持G6PD亚基相互作用及酶活性的必需基团。     

利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T细胞, 为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点靶向设计4对向导RNA （sgRNA）,构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的 细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1（T7E1）酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测 G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的Cas9-sgRNA外 源PX458 质粒,T7E1 酶切检测四对sgRNA 的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD 基因 c.392G>T（p.131G>V）突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生 素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T稳定细胞模型, 为后期研究基因的修复奠定了基础。