PCR介导化学合成广谱细胞生长因子基因半分子

目的建立一种通过PCR介导的单链法人工合成基因的新方法.方法采用固相亚磷酰胺法,化学合成广谱细胞生长因子基因5′端半分子各寡核苷酸片段,其间按搭桥方式相接,通过重叠PCR扩增的方法以获得全长半分子基因,再通过带酶切位点的两端引物扩增,以获得大量特异的半分子基因,而后克隆,测序,筛选阳性重组子.结果随机检测4个阳性重组子,有3个序列完全正确,一个有一位点突变.结论 PCR介导的单链化学合成法是一种简单、有效的人工合成基因的新方法.     

中线T细胞淋巴瘤的TCR—γ基因重排研究

目的 对中线Ｔ细胞淋巴瘤的克隆性进行研究。方法：用一组针对Ｔ细胞受体γ链基因Ｖ区片段的家族特异性引物和ＰＣＲ方法，对１１例（２２个标本）中线Ｔ细胞淋巴瘤病例进行了Ｔ细胞受体γ基因重排的检测，结果：２２个标本中的２１个有Ｔ细胞受体γ链基因的克隆性重排（９４．４５％），在９例原发灶的连续活检和１例原发灶及其转移灶的标本中未发现曾生的克隆家族的改变。结论：中线Ｔ细胞淋巴瘤的病变组织中存在Ｔ细胞的单克隆性     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

不同孕期人滋养层细胞表皮生长因子受体及其mRNA表达的研究

目的：了解不同孕期人滋养层细胞表皮生长因子受体（EGFR）及EGFR mRNA的表达，进而探讨其在胎盘分化及发育中的作用。方法:采用免疫组织化学方法测定不同孕期滋养层细胞EGFR的表达，应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术对EGFR mRNA进行分析。结果：EGFR存在于妊娠各期滋养层细胞的细胞膜，核膜及胞质内，既表达于合体滋养层细胞（ST），也表达于细胞滋养层细胞（CT），孕早期EGFR的表达强于妊娠中期和晚期，EGFR mRNA在各期滋养层细胞的表达从强到弱依次是孕早期，中期，晚期。结论：EGFR及其mRNA在不同孕期滋养层细胞表达的强度不同，其中孕早期较妊娠中期，晚期表达明显增强。     

淋巴瘤T细胞受体δ基因重排的研究

本文应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法对１７例淋巴瘤患者骨髓细胞Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）Ｖδ１－Ｊδ１基因重排进行了检测。１１例Ｔ细胞淋巴瘤中５例发生ＴＣＲＶδ１－Ｊδ１基因重排，６例Ｂ细胞淋巴瘤和１０例正常骨髓细胞无ＴＣＲＶδ１－Ｊδ１基因重排。研究表明：ＴＣＲＶδ１－Ｊδ１基因重排显示细胞系列的特异性，是Ｔ细胞恶性肿瘤的克隆标志。     

应用PCR技术检测急性淋巴细胞白血病T细胞受体γ基因重排

寻找可作为急性淋巴细胞白血病恶性克隆的基因标记。     

PCR扩增CD23全基因

参照国外发表的ＣＤ２３全基因序列，自行设计并合成一对ＤＮＡ引物（２５个碱基和１８个碱基），ＵＣＤ２３阳性细胞株ＨＦＢｄ２／ＳＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ技术，在国内首次成功地扩增了ＣＤ２３全基因（９８６ｂｐ），为今后克隆和表达ＣＤ２３基因以及进一步在基因水平上探讨ＣＤ２３的生物学功能研究中提供了物质基础。     

T细胞淋巴瘤T细胞受体γ链基因重排的检测

目的 探讨T细胞淋巴瘤T细胞受体γ链基因重排的情况。方法 用免疫组化标记筛选30例T细胞淋巴瘤、2例高度可疑为T细胞淋巴瘤和10例淋巴结反应性增生，采用聚合酶链式反应扩增方法检测T细胞受体7链基因重排。结果 30例T细胞淋巴瘤中27例和2例高度可疑为T细胞淋巴瘤均出现T细胞受体γ链基因重排．10例淋巴结反应性增生均无T细胞受体γ链基因重排。结论 T细胞淋巴瘤病变中存在T细胞单克隆增生，支持肿瘤单克隆起源学说；T细胞受体γ链基因重排检测是区分T细胞淋巴瘤和淋巴结反应性增生的有效方法，且对T细胞淋巴瘤疑难病例的诊断有帮助。     

血管内皮生长因子和细胞间黏附分子-1在胸腔积液细胞中的表达

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在不同性质胸腔积液细胞中的表达,为临床胸腔积液的诊治提供实验依据。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测胸腔积液VEGF、ICAM-1基因的表达水平,对聚合酶链反应(PCR)产物条带图像进行半定量分析,并对胸腔积液VEGF、I-CAM-1的表达水平和临床病理学因素作了相关性分析。结果恶性胸腔积液组VEGF和ICAM-1mRNA相对含量为0.447±0.112和0.481±0.103,明显高于良性胸腔积液组相对含量0.302±0.119和0.337±0.152,两组差异有统计学意义(t=4.77,P<0.01;t=4.23,P<0.01);ICAM-1在恶性胸腔积液中表达与血清癌胚抗原(sCEA)、胸腔积液癌胚抗原(pCEA)表达分别呈正相关(r=0.400,P<0.05;r=0.502,P<0.05)。结论VEGF和ICAM-1水平对于良恶性胸腔积液鉴别具有一定的价值。     

Chemical Synthesis and Cloning of Overlapping Concatenated Human Atrial Natriuretic Factor Gene with Gene Engineering

Eight oligonucleotide fragments were designed with the aid of a computer and synthesizedaccording to the amino add sequcnce of human atrial natriuretic factor(ANF).By means of an-nealing and ligation,these fragments were assembled into an overlapping concatenator consisting oftwo ANF genes ligated by TGATG for termination and initiation of translation.Theconcatenator was omserted into plasmid pRC23 and the recobinant DNA was transformed into E.coli strain TAP106.Analysis by restriction enzyme mapping,hybridization and DNA sequenongshowed that the orientation and reading frame of the gene were correct.     

人碱性成纤维细胞生长因子在昆虫细胞sf9中的表达

将人碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)基因cDNA克隆到pFastBacI转移载体中 ,重组质粒转化到感受态细胞DH1 0Bac中 ,使目的基因转座入BacmidDNA中 ,纯化DNA后 ,利用病毒噬斑实验筛选重组的杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞 ,在Sf9细胞中进行表达。Western印迹结果表明 :表达产物为相对分子质量约 1 70 0 0的蛋白 ,与预计的重组蛋白相对分子质量相同 ,并具有较好的免疫学活性。MTT检测证实表达产物能明显促进人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的分裂增生 ,具有hbFGF的生物学活性     

内皮细胞生长因子的分离和纯化

参照 Lobb 和 Fett 方法,用肝素亲和层析法从牛脑组织中提取出纯度较高的内皮细胞生长因子,后者能明显促进体外人脐静脉内皮细胞增殖。     

胃癌细胞产生的一种新型内皮细胞生长因子的分离

人胃癌细胞株 NUGC 2的培养上清液对内皮细胞及纤维细胞有生长刺激作用.收集 NUGC 2的培养上清液,然后经硫酸铵盐析。等电聚焦(IEF)、Mono Q 阴离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱(TSK Gel G3000 SW)等方法分离蛋白,得到一种只对内皮细胞有生长刺激作用,对纤维细胞没有生长刺激作用化学不均一的内皮细胞生长因子,其等电点(PI)为2.07～2.90,分子量在45 000～66 000范围,盐洗脱浓度为0.1～0.25M NaCl.它不同于酸性纤维细胞生长因子,也不同于碱性纤维细胞生长因子.     

人神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的：构建携带人神经生长因子（ｈ Ｎ Ｇ Ｆ） 基因的真核细胞表达载体,为应用 Ｎ Ｇ Ｆ 进行老年性痴呆（ Ａ Ｄ） 等疾病基因治疗打基础。方法：应用基因重组技术将ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,用限制性内切酶酶切分析重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 中ｈ Ｎ Ｇ Ｆ基因的插入方向,用 Ｐ Ｃ Ｒ、斑点杂交和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交对重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 作进一步鉴定。结果：ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ已正确地克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,而构建成重组逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ。结论：真核细胞表达载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 的成功构建,为进一步开展 Ｎ Ｇ Ｆ基因治疗 Ａ Ｄ 等中枢神经系统疾病奠定了基础。     

EGFR mRNA和COX-2 mRNA在NSCLC组织中表达的临床意义

目的　探讨表皮生长因子受体 (epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)mRNA及环氧合酶 2 (cyclooxygenase 2 ,COX 2 )mRNA在非小细胞肺癌 (non smallcelllungcancer,NSCLC)组织中表达的临床意义。 方法　抽取 4 8例NSCLC组织中的RNA ,应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测其中EGFRmRNA及COX 2mRNA的表达。结果　在 2 8例肿瘤组织中存在EGFRmRNA的表达 ,T3 4期的患者的EGFRmRNA表达率显著高于T1 2期的患者 (P <0 .0 5 ) ;在 36例肿瘤组织中存在COX 2mRNA的表达 ,肺腺癌COX 2mRNA的表达率显著高于肺鳞癌(P <0 .0 5 ) ,COX 2mRNA的表达率与 pTNM分期关系密切 (P <0 .0 5 ) ,COX 2mRNA的表达强度与原发肿瘤、淋巴结转移及 pTNM分期的关系密切 (P <0 .0 5 )。COX 2mRNA阳性表达的患者其EGFRmRNA表达率显著高于COX 2mRNA阴性表达的患者 (P <0 .0 5 ) ;EGFRmRNA与COX 2mRNA两者有显著相关性 (相关系数rs=0 .380 7,P <0 .0 5 )。结论　NSCLC中EGFRmRNA和COX 2mRNA的表达在NSCLC的发生、发展和转移中具有重要意义 ,二者可能有协同作用 ,可作为评估NSCLC进展及判断预后的重要指标。     

表达反义N-myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

目的研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＲｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱导分化。同时用ＴＵＮＥＬ原位凋亡检测技术及超微结构技术研究表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系凋亡的情况。结果表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系经单链ＲＮＡ探针杂交,证实其Ｎ－ｍｙｃ的表达明显降低。用神经生长因子处理这些转化细胞系,细胞出现明显的形态学分化。ＴＵＮＥＬ技术及超微结构研究表明,经反义Ｎ－ｍｙｃ转染的细胞系细胞凋亡增多。结论反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能有效抑制Ｎ－ｍｙｃ的表达,进而促进神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞的分化。反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能使神经母细胞瘤细胞凋亡增多。     

血小板源性生长因子对于培养内皮细胞血管内皮细胞生长因子水平的影响

通过免疫组织化学的方法,观察血小板源性生长因子（PDGF）对于培养脐静脉内皮细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）水平的影响,揭示PDGF促进新生血管形成的机制。实验结果：缺氧培养时内皮细胞胞浆VEGF水平上升;不同剂量的PDGF在常规或缺氧培养条件下均能增加内皮细胞VEGF水平,且呈剂量依赖性,提示PDGF可能通过直接促血管形成生长因子的介导作用间接促进新生血管的形成。     

角质细胞生长因子及其受体在CaSki细胞中的表达及其作用

目的 确定角质细胞生长因子(KGF)及受体(KGFR)在CaSki细胞中的表达及KGF对CaSki 细胞增殖、迁移的影响.方法 取对数增长期的CaSki细胞,ELISA和Western blot确定KGF及KGFR在CaSki细胞中的表达;3H-TdR掺入试验测定KGF、KGF抗体对CaSki细胞增殖的影响;Millicell测定KGF、KGF抗体对CaSki细胞迁移的影响.结果 ①KGF、KGFR 在CaSki细胞中有表达;②人重组KGF因子对CaSki细胞的增殖、迁移有促进作用(P＜ 0.05);③用KGF抗体中和CaSki细胞自分泌的KGF 后,CaSki细胞的增殖、迁移减弱(P＜0.05).结论 KGF和KGFR在CaSki细胞中有表达;人重组KGF及CaSki细胞自分泌KGF对CaSki细胞的增殖、迁移均有促进作用.