内皮抑素质粒联合顺铂对上皮性卵巢癌细胞株A2780增殖和凋亡的影响

目的:探讨内皮抑素质粒联合顺铂对上皮性卵巢癌细胞株A2780增殖和凋亡的影响。方法:通过瞬时转染内皮抑素质粒到卵巢癌细胞A2780后,采用MTT法和流式细胞术检测内皮抑素以及内皮抑素和顺铂联合应用对细胞增殖和凋亡的影响。结果:MTT法检测发现转染内皮抑素质粒后,A2780细胞的增殖明显减慢,顺铂对其生长抑制作用明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测发现与空白组相比,转染内皮抑素质粒后A2780细胞的G0/G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少,细胞的凋亡率由(1.59±0.86)%增加到(8.66±1.27)%;内皮抑素质粒联合顺铂治疗后,上述差异更加显著(P<0.01)。结论:内皮抑素联合顺铂可通过抑制A2780细胞的生长和增加其凋亡而产生协同抗瘤作用。     

MDR1及MDR3基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

目的:探讨MDR1(Multidrug resistance gene-1)及MDR3(Multidrug resistance gene-3)基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系。方法:两种质粒一起瞬时转染A2780/DDP细胞,空载体组及未转染组作为对照。Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术、MTT法、RT-PCR、western blot分别检测A2780/DDP细胞早晚期凋亡、细胞增殖活性、MDR1和MDR3 mRNA表达及caspase-3蛋白水平。结果:两种质粒(pSuppressorNeo MDR1 siRNA,MDR3 siRNA)均未能逆转A2780/DDP细胞顺铂耐药:①流式显示转染MDR1 siRNA组、MDR3 siRNA组和pSuppressorNeo空载体组后相比较未转染A2780/DDP细胞凋亡率无显著改变(P>0.05);②在一定药物浓度范围内,转染MDR1和MDR3小分子干扰RNA均未能增强顺铂对A2780/DDP细胞的细胞毒作用;③与空载体组和未转染细胞相比,A2780/DDP细胞的MDR3及MDR1 mRNA表达均低下(P>0.05);④Caspase-3蛋白表达未见增加。结论:顺铂所致的卵巢癌细胞多药耐药与MDR1及MDR3基因过度表达均无关,卵巢癌细胞顺铂耐药为非P-gp     

抑制自噬基因Beclin 1的表达对耐药卵巢癌细胞A2780/DDP顺铂敏感性的影响及相关机制研究

[目的]观察抑制自噬基因Beclin1的表达对卵巢癌耐药细胞A2780/DDP顺铂敏感性的影响并探讨其中机制。[方法]利用脂质体将自噬基因Beclin1RNA干扰质粒pSUPER-Beclin1和对照质粒pSUPER-non分别转染耐药卵巢癌细胞A2780/DDP,筛选稳定表达株,检测顺铂作用下各组细胞(pSUPER-Beclin1组、pSUPER-non组和未转染组)生长抑制率、半数抑制浓度(IC50)、自噬和凋亡率的变化。[结果]A2780/DDP细胞转染干扰质粒pSUPER-Be-clin1后,细胞内Beclin1蛋白的表达明显下降;比较3组细胞顺铂48hIC50,pSUPER-Beclin1转染组最低(P﹤0.01);对3组细胞自噬与凋亡水平的检测显示,抑制Beclin1蛋白表达,在顺铂作用下,细胞自噬水平明显下降,而凋亡细胞比例明显升高,凋亡蛋白Caspase-3的表达亦明显上调,实验组与对照组相比差异有统计学意义(P﹤0.01)。[结论]抑制耐药细胞A2780/DDP自噬基因Beclin1的表达,可通过抑制自噬,增强凋亡提高耐药细胞对顺铂的敏感性。     

siRNA-STAT3对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

目的:探讨pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒抑制人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。方法:应用人卵巢癌细胞株SKOV3对15只裸鼠构建卵巢癌移植瘤模型,随机分为生理盐水对照组、空质粒对照组、重组质粒组。联合电转染技术向裸鼠移植瘤内注射重组质粒,每隔5天重复注射1次,每4天测量各组裸鼠皮下移植瘤体积。采用TUNEL法检测肿瘤组织细胞的凋亡情况。结果:重组质粒瘤内注射对卵巢癌移植瘤生长有明显的抑制作用,与两个对照组比较重组质粒组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢(P<0.01)。TUNEL染色显示重组质粒组癌组织有大量细胞凋亡。结论:pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能有效诱导人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤组织中细胞凋亡,抑制肿瘤生长。     

丙戊酸钠联合顺铂对HO-8910细胞增殖的影响及机制

目的:探讨丙戊酸钠(VPA)联合顺铂(DDP)对体外培养的人卵巢癌细胞HO-8910细胞增殖抑制和凋亡作用及机制。方法:3 mM浓度的VPA、1μg/m l的DDP及VPA联合DDP分别处理人卵巢癌细胞株HO-8910不同时间(24、48、72 h)后,采用MTT法检测细胞的增殖活性;Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡形态学改变;RT-PCR检测p53基因mRNA水平表达变化;W estern b lot法检测p53及Stat3蛋白表达变化。结果:VPA对卵巢癌HO-8910细胞株有生长抑制作用,且VPA联合DDP优于单独用药(P<0.05);Hochest 33258荧光染色结果显示,用药后细胞呈现明显的核碎裂、核固缩等典型凋亡改变,VPA联合DDP组细胞凋亡改变较单独用药组明显(P<0.05);RT-PCR检测显示VPA单独用药及联合DDP用药均能提高p53基因的mRNA表达水平;W estern b lot结果显示VPA联合DDP显著增强卵巢癌HO-8910细胞中p53蛋白表达,降低Stat3蛋白的表达,联合用药组效果更明显。结论:VPA单独用药在体外可有效杀伤卵巢癌HO-8910细胞株,与DDP联合应用具有明显的协同作用,推测其可能的作用机制是诱导p53表达水平上调及Stat3表达水平下调。     

特异性沉默hTERT基因表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡及p53、p21的表达的影响

目的探索特异性沉默hTERT基因表达对卵巢癌细胞增殖凋亡及p53和p21表达的影响,为临床诊治提供参考依据。方法采用分子克隆技术构建表达hTERTshRNA的载体,特异性沉默hTERT基因表达;WestenBlot法、MTT比色法、流式细胞仪检测抑制hTERT基因表达对卵巢癌细胞p53表达及其增殖和凋亡的影响。结果pSIREN-hTERTshRNA转染有效阻抑A2780细胞中hTERT蛋白表达,抑制率为77%;随着A2780细胞中hTERT蛋白表达降低,p53和p21表达均明显增加;与空白对照及转染pSIREN-Con对照质粒相比,pSIREN-hTERT转染的A2780细胞生长速度明显降低;pSIREN-hTERT转染48hA2780细胞凋亡率为(26.76±7.42)%,明显高于对照质粒pSIREN-Con转染组(3.73±0.78)%及空白对照组(1.33±0.15)%。结论hTERTshRNA重组质粒可特异性抑制卵巢癌细胞hTERT的表达,诱导细胞增殖抑制和凋亡,且可能与上调p53和p21的表达有关。     

靶向EZH2基因的shRNA干扰对人卵巢癌细胞Drosha基因表达的影响

目的:探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因对卵巢癌细胞株A2780的Drosha基因表达的影响。方法:获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的人卵巢癌细胞株A2780-shEZH2,实时定量PCR法(qRT-PCR)和免疫印记法(Western blot)检测转染株的Drosha基因表达。结果:以未转染组A2780细胞Drosha的表达水平为100%,EZH2-shRNA转染组A2780-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.02±4.32)%和(51.26±1.35)%,与未转染组比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论:沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达。     

Rab25基因siRNA对人卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响

目的:通过RNA干涉抑制Rab25在人卵巢上皮性癌的过表达,观察Rab25基因siRNA对卵巢癌细胞增殖及诱导凋亡的效果。方法:构建针对Rab25基因的siRNA重组质粒,稳定转染A2780细胞,通过RT-PCR检测Rab25的表达;MTT法观察细胞增殖,绘制细胞生长曲线;Hoechst33258荧光染色和透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果:成功构建Rab25的siRNA,稳定转染靶细胞后可显著降低Rab25的表达,细胞生长速度减慢、增殖能力下降;荧光显微镜和电镜观察到细胞胞质浓缩、核凝聚、核碎裂和凋亡小体形成。结论:Rab25基因的siRNA能抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,为卵巢癌基因治疗开辟新途径。     

自噬基因Beclin1过表达诱导人卵巢癌细胞SKOV3自噬和凋亡的研究

目的:探讨自噬基因Beclin 1在人卵巢癌SKOV3细胞中过表达对其体外生长活性的影响。方法:构建自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1,将其稳定转染SKOV3细胞,实现Beclin 1在SKOV3中的过表达;用MTT法分析Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,用流式细胞仪检测凋亡和自噬情况,电镜和荧光显微镜下观察自噬现象。结果:pcD-NA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后Beclin 1在mRNA和蛋白水平均高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组。Beclin 1在SKOV3中的稳定过表达后G1期细胞明显增多,S期细胞比例明显减少,细胞增殖受到抑制,凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后MDC标记的自噬囊泡平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组。pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后在电镜下可见大量自噬囊泡形成。在荧光显微镜下见pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞中MDC标记的自噬囊泡明显增加。结论:自噬基因Beclin1过表达可诱导人卵巢癌细胞SKOV3自噬和凋亡,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性。     

NF-κB抑制剂对于人卵巢癌裸鼠移植瘤及其血管生成的影响

目的:初步探讨IκBα磷酸化抑制剂BAY 11-7082对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响。方法:选用人卵巢癌细胞系COC 1建立裸鼠皮下移植瘤模型,腹腔注射BAY 11-7082,测量移植瘤的重量、体积,并用TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况。同时应用免疫组化染色,检测瘤组织内的NF-κB p 65、血管内皮生长因子(VEGF)和FⅧ蛋白表达,并计数微血管密度(MVD)。结果:BAY 11-7082组移植瘤重量显著低于阴性对照组(P<0.05),抑制率为47.60%;BAY 11-7082组AI值高于对照组(P<0.05);PI值小于对照组(P<0.05),BAY 11-7082组NF-κB p 65、VEGF与MVD均显著低于对照组(P<0.05)。结论:BAY 11-7082能明显抑制人卵巢癌细胞系COC 1裸鼠移植瘤的生长,通过影响VEGF表达对抗化疗药物。     

人卵巢癌荷瘤裸鼠两种皮下移植瘤模型的构建及生长特性的比较

目的:构建人卵巢上皮癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,并对实体瘤组织块移植及细胞悬液移植的肿瘤模型及其生长特性进行了一系列比较研究,以期为研究卵巢癌的发病机制及靶向治疗措施确定体内实验的最佳模型,并提供充分的理论依据。方法:随机选择10只6～8周龄的裸鼠,分为实体瘤组织块移植组和细胞悬液移植组,每组各5只。通过显微外科手术将瘤体小块接种到裸鼠腋下皮肤,将另一部分瘤体碾碎制成细胞悬液,将1×107个/ml的细胞悬液0.2 ml裸鼠腋下皮肤内注射。动态追踪两组肿瘤模型的生长情况及体内肿瘤的转移情况,处死荷瘤鼠取出肿瘤组织后做病理学检查。结果:全部裸鼠均皮下成瘤,成功率为100%。组织块接种的裸鼠肿瘤生长速度比细胞接种的裸鼠明显快,接种21天后处死裸鼠,组织块接种组比细胞接种组明显增大,两组肿瘤平均体积差异有统计学意义(P<0.05)。通过尸检发现所有裸鼠均未出现淋巴及其他器官的转移,病理学检查提示两组裸鼠移植瘤都具有人卵巢癌组织学特征。结论:构建了人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,两种方法建立的动物模型均可用于从整体水平对卵巢癌进行相关研究,是理想的卵巢癌动物模型。人卵巢癌组织块接种法构建的动物模型更适合用于周期较短的实验研究。     

顺铂作用下卵巢癌敏感细胞A2780与耐药细胞A2780/DDP凋亡与自噬水平的变化及意义

目的:通过分析自噬对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响,探讨自噬与卵巢癌顺铂耐药性的关系,为卵巢癌治疗提供依据。方法:培养卵巢癌细胞株A2780和A2780/DDP,进行卵巢癌细胞系A2780及A2780/DDP顺铂敏感性的测定,流式细胞仪测定顺铂作用下A2780和A2780/DDP细胞的凋亡率;将10μM顺铂作用48h的A2780细胞和40μM顺铂作用48h的A2780/DDP细胞经处理,采用Western blot法检测Beclin1蛋白的表达;电镜下观察10μM顺铂作用48h的A2780细胞和40μM顺铂作用48h的A2780/DDP细胞经固定染色处理的自噬细胞活性。结果:顺铂主要通过诱导凋亡对卵巢癌耐药细胞A2780/DDP及敏感细胞A2780发挥细胞毒效应;顺铂作用下,耐药细胞的自噬活性明显增强,而敏感细胞自噬活性无明显增强。结论:顺铂诱导耐药卵巢癌细胞发生凋亡的能力较亲代敏感细胞降低,在其发生过程中,反应性自噬活性增强可能与其顺铂耐药性的形成有关,提示对肿瘤细胞的自噬水平进行监测及调控可能为逆转卵巢癌铂耐药提供新的思路。     

卵巢肿瘤细胞DNA倍体分析及Fas表达研究

目的:通过检测卵巢肿瘤细胞DNA倍体及Fas蛋白表达情况,探讨其临床意义及其于卵巢细胞增殖与凋亡的关系。方法:应用流式细胞术(FCM)和荧光免疫技术,对34例卵巢癌组织和19例良性卵巢肿瘤及9例正常卵巢组织的卵巢细胞进行DNA倍体分析及Fas蛋白的表达测定。结果:①卵巢癌患者组中,卵巢组织细胞内DNA异倍体率明显高于良性卵巢肿瘤患者组及正常组。②卵巢癌异倍体率与组织学分级呈正相关。③卵巢癌Fas表达低于良性卵巢肿瘤。④卵巢癌Fas表达与临床分期组织学分级无关。结论:应用FCM进行卵巢癌细胞中的DNA倍体分析在临床上具有重要的诊断价值。卵巢癌组织中Fas表达下调与肿瘤细胞长期存活有关。     

miR-100抑制胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长及机制的研究

目的：探究miR-100抑制胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤的生长及机制。方法将实验裸鼠随机分成miR-100组和阴性对照组,将用GFP-miR-100或GFP-miR-negative control 转染的胃癌SGC7901细胞通过裸鼠腋窝注射分别转染到两组裸鼠中去,建立人胃癌SGC7901胃癌miR-100模型和阴性对照组模型,通过GFP图像观察体内miR-100的表达情况,HE染色观察肺转移及基质浸润情况,免疫组织化学和western blot检测miR-100靶基因蛋白表达情况。结果 miR-100在miR-100组裸鼠中稳定地高表达;在阴性对照组的8只裸鼠中,有6只裸鼠的肿瘤细胞浸润肿瘤周围的基质,miR-100组的9只裸鼠中,只有2只出现了基质浸润,其余7只裸鼠中,肿瘤结节被周围的纤维组织完好地包绕。 western blot和免疫组织化学显示在裸鼠异种移植肿瘤中,miR-100显著抑制了ZBTB7A 蛋白的表达。结论 miR-100通过抑制ZBTB7A靶点基因抑制胃癌细胞裸鼠移植瘤的转移和生长。     

COX-2在上皮性卵巢肿瘤的表达及塞来昔布对卵巢癌A2780细胞株增殖的影响

目的:探讨环氧化酶-2(COX-2)在上皮性卵巢肿瘤的表达及环氧化酶-2抑制剂塞来昔布(celecoxib)在体外对人卵巢癌A2780细胞株增殖的影响。方法:①采用免疫组化SP法检测COX-2在65例上皮性卵巢癌、18例交界性与18例良性上皮性卵巢肿瘤及9例正常卵巢组织中的表达;②采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察塞来昔布在体外对A2780细胞增殖的影响;③流式细胞仪(FCM)测定塞来昔布在体外对A2780细胞周期的影响。结果:①COX-2在上皮性卵巢癌组(73.80%)及交界性卵巢肿瘤组的表达(66.70%)显著高于良性卵巢肿瘤组(16.70%)及正常卵巢组(11.10%),均P<0.05;②MTT显示,塞来昔布在体外以时间-剂量依赖方式抑制A2780增殖(P<0.05);③塞来昔布作用72 h后A2780细胞周期呈剂量依赖方式出现G0/G1期阻滞(P<0.05)。结论:①COX-2在交界性及恶性上皮性卵巢肿瘤中的表达明显增强,COX-2可能在交界性及恶性上皮性卵巢肿瘤的发生、发展中起一定作用;②体外特异性COX-2抑制剂(塞来昔布)能够抑制卵巢癌A2780细胞株增殖,有可能成为卵巢癌化疗的有效药物。     

PAB和顺铂联用抑制HO-8910裸小鼠移植瘤生长作用研究

目的:探讨土荆皮酸(PAB)和顺铂联用对人卵巢癌细胞株HO-8910裸鼠皮下移植瘤的生长及其血管生成的影响。方法:将20只荷人HO-8910卵巢癌的裸小鼠随机分成4组:①PAB组(60 mg/kg,腹腔注射治疗5天);②顺铂组(5 mg/kg,腹腔注射治疗5天);③联合用药组(PAB 60 mg/kg+顺铂5 mg/kg,腹腔注射治疗5天);④阴性对照组(给予同体积的含有6%聚乙二醇、3%乙醇、1%Tween 80的水溶液);计算瘤质量、瘤体积;同时应用CD34免疫组化染色,观测瘤组织内的微血管密度。结果:统计学分析表明:在抑瘤率和微血管密度方面,PAB组、顺铂组和阴性对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),联合用药组和其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:PAB、顺铂对人卵巢癌移植瘤的生长具有抑制作用;PAB和顺铂联用能起增效作用。     

人WWOX基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆人WWOX基因并构建其真核表达载体。方法:从人正常卵巢组织中提取总RNA,经逆转录聚合酶链反应扩增人WWOX基因,并构建其真核表达载体,经测序鉴定后转染人卵巢癌细胞系A2780。结果:成功克隆了人WWOX基因,与Genbank提供的序列(NM-016373)对比显示完全一致。真核表达载体pCMV-WWOX转染人卵巢癌细胞系A2780后,癌细胞的WWOXmRNA的表达水平显著增高(P<0.01)。结论:从人正常卵巢组织中成功克隆了人WWOX基因,为进一步研究WWOX在卵巢癌发生和进展中的作用及其靶向基因治疗奠定了实验基础。