大鼠海马神经元原代培养方法及缺糖缺氧再灌注损伤模型的建立

目的 探讨大鼠海马神经元原代培养方法,并建立缺糖缺氧再灌注损伤模型.方法 取新生48h内的大鼠海马组织进行体外原代培养,并进行神经元鉴定.神经元培养第8天,分为对照组、缺糖缺氧组及再灌注损伤组.对照组换Earle＇s液正常培养;缺糖缺氧组换无糖Earle＇s平衡盐缓冲液培养并放入缺氧盒内,持续3h缓慢通入95％的N2.再灌注损伤组经过与缺糖缺氧组相同处理后,换以完全培养基置入CO2培养箱孵育,模拟体内缺血再灌注的过程.倒置相差显微镜进行一般形态学的动态观察,采用MTT法测定神经元存活率.结果 经过分类计数,神经元约占97.35％,可认为是较纯的神经细胞培养.对照组神经元存活率为100％,缺糖缺氧组为75.25％士3.12％,再灌注损伤组再灌注12、24 h的神经元存活率分别为63.64％±2.25％、55.37％±1.04％;再灌注损伤组再灌注12、24 h的神经元存活率与对照组和缺糖缺氧组比较,P均＜0.05.结论 成功体外培养海马神经元,并建立大鼠缺糖缺氧再灌注损伤模型.     

大鼠心肌缺血及再灌注诱发凋亡与脊髓中神经元型一氧化氮合酶和N-甲基-D-天门冬氨酸受体1表达的关系

目的:探讨脊髓中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和N-甲基-D-天门冬氨酸受体l(NMDAR1)含量变化与心肌缺血及再灌注诱发的心肌细胞凋亡的关系.方法:将入选的70只大鼠随机分成假手术对照组(C组)、缺血Ⅰ组(Ⅰ/I组)、缺血Ⅱ组(Ⅱ/I组)、缺血Ⅲ组(Ⅲ/I组)、缺血再灌注Ⅰ组(Ⅰ/IR组)、缺血再灌注Ⅱ组(Ⅱ/IR组)和缺血再灌注Ⅲ组(Ⅲ/IR组)共7组,每组10只.C组只在冠状动脉左前降支埋线持续2 h.Ⅰ/I,Ⅱ/I和Ⅱ/I组分别结扎左前降支1 h,2 h和3 h.Ⅰ/IR,Ⅱ/IR和Ⅲ/IR组都先结扎左前降支2 h,然后分别松扎0.5 h,1.5 h和3 h.测定各组大鼠心肌凋亡指数、脊髓中nNOS与NMDAR1的阳性率.结果:与C组比较,Ⅰ/I、Ⅱ/I、Ⅲ/I、Ⅰ/IR、Ⅱ/IR、Ⅲ/IR组的心肌凋亡指数、脊髓中nNOS与NMDAR.的阳性率均升高(P＜0.05).分别与Ⅰ/I、Ⅱ/I、Ⅲ/I组比较,Ⅰ/IR、Ⅱ/IR、Ⅲ/IR组的心肌凋亡指数、脊髓中nNOS与NMDAR.的阳性率均升高(P＜0.05).脊髓中nNOS与NMDAR1的阳性率间呈正相关(r＝0.98,P＜0.01).结论:心肌缺血及再灌注诱发心肌细胞凋亡时,脊髓中nNOS与NMDAR1的阳性率明显升高,脊髓中nNOS和NMDAR1可能共同促进心肌缺血及再灌注诱发的心肌细胞凋亡.     

盐酸戊乙奎醚预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

将雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I／R组）、东莨菪碱组（Sco组）和盐酸戊乙奎醚组（PH组）。观察测定各组脑梗死体积、大鼠海马神经细胞形态的变化及海马组织N-甲-D-天门冬氨酸（NMDA）受体NR1亚基mRNA的表达水平。结果显示,与I／R组比较,再灌注后PH组脑梗死体积显著减少,海马神经元细胞损伤显著减轻,NMDA受体mRNA表达水平显著降低。认为盐酸戊乙奎醚预处理可以显著改善大鼠局灶脑缺血再灌注后海马神经细胞损伤,从而对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。     

丹皮酚对心肌缺血再灌注损伤大鼠模型肿瘤坏死因子-α和Toll样受体4表达的影响

目的探讨丹皮酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护中肿瘤坏死因子(TNF)-α及Toll样受体(TLR)4表达的影响。方法清洁级成年雄性SD大鼠36只随机分为假手术组、缺血再灌注组、丹皮酚低剂量组和丹皮酚高剂量组每组9只;通过结扎左冠脉前降支30 min再灌注2 h建立大鼠心肌缺血再灌注模型。通过TTC染色法检测大鼠梗死心肌体积;ELISA法检测血液中TNF-α的含量;通过免疫组化法检测缺血坏死心肌组织TLR4的表达。结果与缺血再灌注组相比,丹皮酚低剂量组和丹皮酚高剂量组心肌梗死体积减小,TNF-α表达减少;心肌组织TLR4水平明显降低;其中丹皮酚高剂量组更明显。结论丹皮酚能够明显降低大鼠心肌缺血再灌注损伤,这种作用可能与减轻缺血再灌注中大鼠心肌TNF-α及TLR4表达有关。     

黄芪注射液与缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的关系

目的探讨黄芪注射液与缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因caspase-3表达的关系。方法取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5h再复氧复糖。各组于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、48、72 h和120 h采用Western印迹检测caspase-3蛋白的表达,采用RT-PCR方法检测caspase-3 mRNA的表达。结果除0 h和0.5 h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元caspase-3蛋白的平均灰度值均较正常对照组明显增加(P0.05),复氧复糖24h平均灰度值最高;与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点caspase-3蛋白的平均灰度值无明显变化(P0.05),而黄芪注射液组除0h和0.5h外,在各个时间点caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P0.05)。RT-PCR结果显示:除0h和0.5h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元caspase-3 mRNA的平均光密度值均较正常对照组明显增加(P0.05),24h平均光密度值最高;与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点caspase-3 mRNA的平均光密度值无明显变化(P0.05),而黄芪注射液组在除0 h和0.5 h外的各个时间点caspase-3 mRNA的平均光密度值均明显降低(P0.05)。结论黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡作用,是通过抑制海马神经元凋亡相关基因caspase-3的表达来实现的。     

黄芪注射液减轻缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的机制

目的探讨黄芪注射液减轻缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的作用机制。方法取体外无血清原代培养8 d的大鼠海马神经元,采用随机数表法分为A组:正常对照组、B组:模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、C组:黄芪注射液溶剂对照组、D组:黄芪注射液组、E组:二甲基亚砜(DMSO)组、F组:Bax抑制剂组、G组:Bax激动剂组、H组:Bax抑制剂+黄芪注射液组、I组:Bax激动剂+黄芪注射液组。各组除A组均经0.5 h缺氧缺糖,分别采用免疫组化法和RT-PCR法对复氧复糖后0、0.5、2、6、24、72、120 h的Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA的表达进行检测和比较。结果各组海马神经元除0 h外,其他时间点的Bcl-2水平均高于A组,且各组Bcl-2水平均随时间延长而增高,2 h达到顶峰。除0 h外,其他各时间点H组大鼠海马神经元的Bcl-2水平均显著高于其他组(P<0.05),其次为F组、D组、I组、G组、E组、B/C组、A组,且B组与C组无显著差异(P>0.05)。各组大鼠海马神经元除0 h外,其他各时间点的Bax水平均低于A、B组,且各组均随时间延长而增高,6 h达到顶峰,各组大鼠海马神经元除0 h外,其他各时间点的Caspase-3 mRNA阳性神经元百分率均高于A组,且各组均随时间延长而增高,24 h达到顶峰。除0 h外,其他各时间点B组Bcl-2水平和Caspase-3 mRNA阳性神经元百分率均显著高于其他组(P<0.05),其次为E组、G组、I组、D组、F组、H组,且B组与C组各时间点比较无显著差异(P>0.05)。结论黄芪注射液能够抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bax蛋白的表达,提高Bcl-2蛋白表达,抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡;且Bax激动剂能够加速缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡,Bax抑制剂能够减轻缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡。     

黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的自由基机制

目的 观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响及其抑制神经元损伤的机制.方法 原代培养8 d的大鼠海马神经元随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组.除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖.各组于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、48、72 h和120 h测定SOD活力、MDA含量,Western印迹检测caspase-3蛋白的表达,采用原位杂交检测海马神经元caspase-3 mRNA的表达.结果 各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元SOD活性均较正常对照组明显降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点SOD的活性、MDA含量无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组在各个时间点SOD的活性明显升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05).原位杂交结果显示:与正常对照组相比,除0 h和0.5 h之外,缺氧缺糖/复氧复糖组各时间点海马caspase-3阳性神经元数目、占神经元总数的百分率及平均光密度值均明显增多(P<0.05),于24 h达到高峰.黄芪注射液溶剂对照组以上指标的变化趋势与缺氧缺糖/复氧复糖组相一致.黄芪注射液组除0 h和0.5 h之外,各时间点以上指标均比缺氧缺糖/复氧复糖组显著减少(P<0.05).Western印迹检测结果显示:除0 h和0.5 h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元caspase-3蛋白的平均灰度值均较正常对照组明显增加(P<0.05),24 h最高;与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点caspase-3蛋白的平均灰度值无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组除0 h和0.5 h外,在各个时间点caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05).结论 黄芪注射液可通过减少自由基生成,抑制caspase-3的表达,进而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡.     

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2、bax及cyt-c蛋白形态学表达的影响

目的 观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2、bax及cyt-c蛋白表达的影响,探讨黄芪注射液防治海马神经元凋亡的作用机制.方法 取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组.除正常对照组外,各组均进行缺糖缺氧0.5 h,再分别于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、72和120 h采用细胞免疫化学法检测海马神经元bcl-2、bax、cyt-c蛋白的表达.结果 与正常对照组比,模型组bcl-2、bax、cyt-c蛋白表达明显升高,而bcl-2/bax比值下调(P＜0.05).与模型组相比,黄芪注射液组bcl-2蛋白表达及bcl-2/bax比值升高,cyt-c、bax蛋白表达明显降低(P＜0.05);而黄芪注射液溶剂对照组bcl-2、bax、cyt-c蛋白表达及bcl-2/bax比值则无显著变化(P＞0.05).结论 黄芪注射液可提高缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2蛋白表达及bcl-2/bax比值,抑制bax、cyt-c蛋白表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖引起的海马神经元凋亡.     

麦芽醇对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马 C-fos表达及神经元凋亡的影响

目的研究麦芽醇(MT)对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用.方法 Wistar大鼠双侧颈总动脉夹闭30 min,造成全脑缺血,松开动脉夹再灌注.夹闭动脉前后静脉注射150 μmol/L麦芽醇生理盐水,动物均于再灌注1 h后行C-fos原位杂交,再灌48 h行TUNEL染色,观察海马神经元的凋亡情况.结果缺血再灌注后,大鼠海马CA1区C-fos基因表达增强,与对照组相比有统计学意义(P<0.01).MT治疗后,C-fos基因表达减弱,与缺血再灌注大鼠比较,C-fos高表达受到明显抑制(P<0.01);缺血再灌注大鼠的TUNEL染色可见CA1区有大量阳性细胞,MT治疗后,CA1区锥体细胞凋亡值明显减少(P<0.01).结论麦芽醇能使脑缺血导致的C-fos基因表达和细胞凋亡受到抑制,从而减轻海马组织缺血再灌注损伤.     

淫羊藿甙对原代培养神经元缺氧缺糖损伤的保护作用

目的 探讨淫羊藿甙对体外原代培养神经元缺氧缺糖损伤的作用。方法 原代培养大鼠乳鼠皮质神经元,在缺氧缺糖4、6、8 h时检测正常对照组、损伤模型组、淫羊藿甙处理组的神经元细胞噻唑蓝、乳酸脱氢酶(LDH)病理学指标变化。结果 模型组在缺氧缺糖4、6、8 h后噻唑蓝值明显低于相应对照组(P<0.01),LDH漏出率明显高于对照组(P<0.05或<0.01)。淫羊藿甙组与相应模型组比较,可提高缺氧缺糖的神经元生长能力,使噻唑蓝值有所上升;LDH漏出率有所下降;改善细胞形态。 结论 淫羊藿甙对体外原代培养神经元具有保护作用,可减轻神经元缺血性损伤。淫羊藿甙有利于缺血性脑血管疾病的治疗。