重组痘苗病毒为载体表达脊髓灰质炎病毒（Ⅰ型）及甲型肝炎病毒双价抗原

本文报道含有脊髓灰质炎病毒Ⅰ型中和抗原位点及甲型肝炎病毒中和抗原位点重组痘苗病毒的构建，用重组痘苗病毒感染１４３ＴＫ－细胞后成功地表达了脊髓灰质炎病毒Ⅰ型和甲型肝炎病毒的抗原。免疫荧光显示，两种抗原的荧光颗粒均分布在胞浆内。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，重组痘苗病毒所表达的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原和甲型肝炎病毒抗原为一融合蛋白。用此重组痘苗病毒免疫动物，可诱导脊髓灰质炎病毒Ⅰ型和甲型肝炎病毒的中和抗体产生。     

人免疫缺陷病毒I型外膜糖蛋白gp^120和gp^160在重组痘苗…

人免疫缺陷病毒Ｉ型（ＨＩＶ－１）是严重威胁人类健康的病原体，其主要抗原是病毒外膜糖蛋白ｇｐ＾１６０（ｇｐ＾１２０＋ｇｐ＾４１）。本文报道运用遗传工程技术，在噬菌体Ｔ７启动子或痘苗病毒启动子ｐ７．５控制下，在重组痘苗病毒系统中构建和表达ＨＩＶ－１ｇｐ＾１２０和ｇｐ＾１６０。进一步研究表明，在此系统中表达的重组ＨＩＶ－１ｇｐ＾１２和ｇｐ＾１６０以糖蛋白形式存在，保留着病毒在自然状况下的抗原表位构象，可     

表达人癌胚抗原重组痘苗病毒的构建

用痘苗病毒作载体，成功构建了高效表达人癌胚抗原（ＣＥＡ）的ＣＥＡ－重组痘苗病毒，用１４３ＴＫ－细胞作主宿主细胞，表达的蛋白质只在细胞膜上的能检测到，而胞质内和细胞上清液中均未能检测到，可见所表达的蛋白保持了其原有特性，再次证实痘苗病毒是真核表达扔效载体，本结果为进一步研究ＣＥＡ－重组痘苗病毒能否激活机体的免疫系统杀伤表达ＣＥＡ的肿瘤提供了物质基础。     

流式细胞术检测重组痘苗乙型脑炎病毒抗原的表达

流式细胞术检测重组痘苗乙型脑炎病毒抗原的表达ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＪａｐａｎｅｓｅｅｎｃｏｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎｓｅｎｐｒｅｓｓｅｄｏｎｔｈｅＢＨＫ２１－１５ｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｉｒｕｓｂｙｆｌ...     

表达人癌胚抗原重组痘苗病毒的构建

用痘苗病毒作载体，成功构建了高效表达人癌胚抗原（ＣＥＡ）的ＣＥＡ－重组痘苗病毒，用１４３ＴＫ－细胞作为宿主细胞，表达的蛋白质只在细胞膜上能检测到，而胞质内和细胞上清液中均未能检测到，可见所表达的蛋白质保持了其原有特性，再次证实痘苗病毒是真核表达的有效载体。本结果为进一步研究ＣＥＡ－重组痘苗病毒能否激活机体的免疫系统杀伤表达ＣＥＡ的肿瘤提供了物质基础。     

以痘苗病毒为辅助病毒生产慢病毒载体的探究

目的建立新型、高产量的慢病毒衍生载体的生产体系。方法构建主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG。通过脂质体将这三个质粒共转染至BHK21细胞,再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4d后,收集培养上清,0.22μm滤膜过滤。结果将培养上清进行RT-PCR反应,结果能扩增出96bp长度的目的条带,将培养上清感染BHK21细胞,检测到BHK21细胞中GFP的表达,测定病毒载体滴度为(1.45±0.30)×107tu/ml。结论已初步生产出慢病毒载体,为下一步生产系统建立,系统产量优化奠定良好基础。     

抗原嵌合性（Ⅰ／Ⅱ型）脊髓灰质炎病毒小鼠神经毒力的实验观察

为探讨脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Lansing株中和抗原位点1(N-Ag1)在对小鼠适应能力和神经毒力中的意义和作用,本实验采用DNA重组技术构建的2株抗原嵌合性(Ⅰ/Ⅱ型)PVXF414和XF324,对小鼠适应性和神经毒力进行研究。证明Ⅰ型Mahoney株中的N-Ag1被LansingⅡ型毒株的N-Ag1肽段取代后,形成的抗原嵌合性PV Ⅰ/Ⅱ型毒株脑内接种能引起小鼠中枢神经系统脊髓灰质炎病变,导致四肢麻痹或死亡。从麻痹小鼠大脑组织中分离到与接种病毒抗原性相同的活病毒,表明N-Ag1上这一小段氨基酸序列在决定PV宿主适应性中起重要作用;N-Ag1可能与病毒吸附和穿入小鼠中枢神经组织细胞有关。     

汉滩病毒S基因-重组痘苗病毒的制备和表达鉴定

目的 :制备和鉴定汉滩病毒 (HTNV)S基因 重组痘苗病毒 ,为进一步建立肾综合征出血热 (HFRS)患者HTNV核衣壳蛋白特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的靶细胞奠定基础。　方法 :用野生型痘苗病毒和HTNVS基因 重组痘苗病毒分别感染Vero细胞 ,进行病毒扩增和滴度测定。用PCR和斑点杂交鉴定重组痘苗病毒基因组中的HTNVS基因 ,用间接免疫荧光和westernblot检测核衣壳蛋白的表达。　结果 :制备了含HTNVS基因的重组痘苗病毒 ,滴度为 4 .0 2× 10 7。该重组痘苗病毒基因组中存在HTNVS基因 ,它在Vero细胞中能有效地表达核衣壳蛋白。　结论 :制备了较高滴度、能有效表达HTNV核衣壳蛋白的重组痘苗病毒。     

痘苗病毒真核表达载体pMJ601的转化与鉴定

目的 对痘苗病毒表达载体ｐＭＪ６０１进行转化与鉴定,为进一步实施痘苗病毒为载体的基因治疗作必要的准备。方法 利用感受态细胞的制备及转化、质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切等多种基因工程技术对质粒ｐＭＪ６０１进行转化及鉴定。结果 琼脂糖凝胶电泳清楚地显示了ｐＭＪ６０１质粒３条带和Ｂａｍ ＨＩ或Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切后的线性条带。结论 痘苗病毒表达ｐＭＪ６０１的转化与鉴定,为痘苗病毒载体系统的基因治     

脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）的Percoll等密度梯度离心分离

如何获取高纯度病毒颗粒作为进一步研究的实验材料,是病毒分子生物学研究中一个需要解决的方法学问题.目前常用的病毒分离方法,如蔗糖梯度离心法和氯化铯平衡密度离心法存在一些不足.硅溶胶作为密度梯度离心介质早已成功地用于细胞及亚细胞结构的分离.70年代末期,新型的经PVF(聚乙烯吡咯烷酮)修饰的硅溶胶-Percoll问世.本文将Percoll梯度离心法用于脊髓灰质炎病毒(以     

复制型重组痘苗病毒TTK-EG特异性T细胞表位研究

目的筛选和确定TTK-EG包含的H-2~d限制的HIV-1特异性T细胞表位。方法 6~8周龄雌性BALB/c小鼠0周时分别经肌肉注射、皮内注射和滴鼻途径免疫5×10~6PFU TTK-EG,间隔4个月进行加强免疫。末次免疫后2周取小鼠脾细胞,采用IFN-γELISPOT方法筛选HIV-1 Env和Gag肽库,反应阳性的肽库进行第二轮单肽筛选。用流式细胞术(胞内因子染色,intracellular cytokine staining,ICS)对筛选出的单肽进行验证(小鼠免疫途径为肌肉注射),确定H-2~d限制的HIV-1特异性T细胞表位。结果经过ELISPOT筛选和ICS验证,确定2条Env多肽(gp140-9,氨基酸位点60~77;gp140-74,氨基酸位点548~565)和3条Gag多肽(Gag-49,氨基酸位点196~210;Gag-64,氨基酸位点256~270;Gag-65,氨基酸位点260~274)包含H-2~d限制的HIV-1特异性T细胞表位,其中gp140-74(IVQQQSNLLRAIEAQQHL)是首次发现的H-2~d限制的HIV-1特异性T细胞表位。Env、Gag优势表位肽与Env、Gag全肽池刺激小鼠T细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α三种细胞因子的能力基本相同。结论 Env多肽gp140-9、gp140-74和Gag多肽Gag-49、Gag-64、Gag-65包含H-2~d限制的T细胞表位,可用于重组痘苗病毒TTK-EG的T细胞免疫研究。     

重组人CEA痘苗病毒实验动物的组织结构观察及免疫组化检测

目的：检测重组人ＣＥＡ痘苗病毒在动物体内应用的安全性与可行性，为肿瘤的基因治疗提供实验依据。方法：将重组人ｒＶ－ＣＥＡ和痘苗病毒野生型及生理盐水分别接种纯各新西兰兔，观察组织结构并用免疫组化方法检测兔体内人ＣＥＡＲ 表达。结果：接种ｒＶ－ＣＥＡ组的第８天，兔血清ＣＥＡ含量明显升高，第１５天后在兔血清中测出ＣＥＡ抗体。光镜观察接种ｒＶ－ＣＥＡ兔的心、肝、脾、肾、淋巴结和皮肤等组织，其结构均无异常变化     

痘苗病毒DNA精制、酶切、重组及筛选

本文报道了痘苗病毒DNA精制、酶切、重组及筛选方法。用影印培养法,根据耐药性变异筛选转化菌菌落,经Lysozyme及RNase 1处理,用Ethanol提取质粒,初步获得两株重组质粒,酶切及电泳证明VV—DNA片段分子量为2.0×10~3bp。     

表达HPV16 L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒的构建和鉴定

目的:构建防治宫颈癌的表达人乳头瘤病毒16型、HPV16)L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒疫苗株.方法:以痘苗病毒为载体,利用同源重组技术筛选共表达HPV16 L1、L2E7蛋白的重组痘苗病毒,用PCR和Western-blot技术进行鉴定.结果:该病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)中连续传代15代,经PCR检测证实病毒基因组中有HPV16 L1、L2E7目的基因插入,Western-blot检测证实病毒可以稳定表达L1、L2E7蛋白.结论:构建的病毒NTVJL1L2E7可以在真核细胞中表达HPV16 L1、L2E7蛋白,可以作为治疗和预防HPV16相关疾病的候选疫苗.     

HBeAg真核表达载体的构建及表达

目的构建HBeAg真核表达载体,观察其在HeLa细胞的表达。方法用PCR方法从质粒PHBV1.5中扩增乙肝病毒前C/C基因,克隆到pCDNA3.1的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建HBeAg表达载体,通过酶切、PCR及测序鉴定,并把载体转染HeLa细胞,用RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA和MEIA检测其表达。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建HBeAg表达载体,该载体可以在HeLa细胞中表达前C/C蛋白,并可分泌表达HBeAg。结论构建了HBeAg表达载体,为运用RNA干扰技术进行HBeAg的抑制研究奠定基础。     

水中脊髓灰质炎病毒感染性,抗原性及核酸指标检测方法的？…

建立水中脊髓灰质炎病毒１型感染性，抗原性及核酸检测指标并比较三种指标的优缺点。方法；分别用蚀斑计数，免疫印迹和逆转录ＰＣＲ三种方法检测病毒感染性，抗原性和核酸片段完整性，并比较各方法的敏感性和特异性。结果；ＲＴ－ＰＣＲ对ＰＶ１有株特异性，ＤＩＢＡ则对ＰＶ１有型特异性，而ＰＦＵＡ对ＰＶ１无型间及株间特异性；     

可溶性白细胞介素6受体β亚基在重组痘苗病毒中的表达及其对动物的免疫效果

目的 :构建可溶性白细胞介素 6受体 ( IL- 6R) β亚基 ( sgp130 )重组痘苗病毒 ,感染动物细胞使其表达 sgp130 ,用重组病毒免疫动物产生特异性抗 sgp130抗体。　 方法 :将 sgp130基因导入痘苗病毒载体 p JSA1175,用脂质体转染法将重组载体与野生型痘苗病毒在 TK-143细胞中发生同源重组 ,用 Bud R和 X- gal双重选择 ,得到带有人 sgp130的重组病毒 ( Vsgp130 )。　 结果 :采用 IDA和 Western Blotting法证实 ,感染 Vsgp130的 TK-143细胞上清中有较强的 sgp130表达 ,表达产物分子量为 10 0 0 0 0左右。用重组病毒免疫家兔和 Balb/c小鼠 ,可刺激抗体产生。　 结论 :sgp130在痘苗病毒载体系统中的表达成功及抗 sgp130多克隆抗体的产生为进一步研究 IL- 6等细胞因子信号传导机理及研制抗 sgp130单克隆抗体奠定了基础     

微电流与低浓度氯对水中脊髓灰质炎I型病毒的协同灭活效应

目的　观察微电流 (low amperage direct current,LDC)与游离氯 (free chlorine,FC)对水中脊髓灰质炎 I型病毒 (PV1 )的协同灭活效果 .方法　用微电流 0 .4～ 1 .2 m A·cm-2 协同氯 0 .2～ 0 .3 mg· L-1 处理污染 PV1水样 ,比较作用前后灭活率 K值评价灭活效果 ,用 Berenbaum方法判断微电流与氯灭活病毒有无协同效应 ,用蚀斑形成试验 (PFUA)和病毒细胞酶联免疫试验 (VELCIA)检测感染性和抗原性变化 .结果　实验观察到微电流达到 0 .4 m A· cm-2 对水中PV1有弱灭活作用 ,电流密度达到 1 .2 m A· cm-2 与 0 .2mg· L-1氯有协同灭活效应 ,微电流 1 .2 m A· cm-2与氯 0 .3mg· L-1协同消毒 30 min,水中病毒减少 4.0 8个对数级 ,而单独用氯仅减少 1 .93个对数级 ;协同作用后病毒感染性灭活增强 ,而抗原性灭活不明显 .结论　微电流协同氯可提高低浓度氯灭活水中病毒的效果