真菌病

20 0 3 0 679　耐特比萘芬的白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因开放读框的克隆及序列分析 /刘伟 (北京大学一院皮肤科 )…∥北京大学学报 . 2 0 0 2 ,3 4(6) . 73 5～ 73 6从 1例病程 2 4年以上 ,用过多种药物治疗的慢性粘膜皮肤念珠菌病患者口腔中分离到一株白念珠菌BMU 0 0 65 7,药物敏感性试验发现特比萘芬对其MIC >2 5 6mg/L ,表现出该分离株对特比萘芬显著耐药的特性。为探讨该分离株对特比萘芬发生耐药的可能机制 ,将其作用靶酶 ,角鲨烯环氧化酶基因 (ERG1 )的开放读框进行克隆 ,并作序列分析。结果该读框有 1 0处发生改变 ,分别引起相…     

拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌

目的：探讨拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR～RFLP法鉴别常见皮肤癣菌的可行性。方法：用真菌拓扑异构酶Ⅱ基因区通用引物dPsD1、dPsD2，先后对6种34株临床常见皮肤癣菌和2株白念珠菌以及4株曲霉的DNA进行巢式PCR（nested PER）扩增，扩增后的阳性产物分别用限制性内切酶HincⅡ和HinfⅠ酶切，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，根据结果来鉴定皮肤癣菌并在种的水平上区分这6种常见皮肤癣菌。结果：通用引物dPsD1对6种皮肤癣菌均能扩增出3390bp、dPsD2能扩增出2380bp的片段，而白念珠菌和曲霉则未见阳性扩增条带。扩增出的产物分别经HincⅡ和HinfⅠ酶切后表现为58—1670bp长短不等的片段组合，根据这些特异性条带谱可以区分这6种临床常见皮肤癣菌。结论：拓扑异构酶Ⅱ基因区的巢式PCR—RFLP方法，是鉴定和区分常见皮肤癣菌的有效方法。     

阴道非白念珠菌的PCR-RFLP鉴定

目的对分离自外阴阴道念珠菌病(VVC)患者阴道的常见致病性非白念珠菌进行聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法的鉴定。方法首先采用芽管试验、厚壁孢子试验、法国科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基及API20CAUX酵母菌鉴定系统将分离自VVC患者阴道内的念珠菌菌株鉴定到种,然后采用真菌通用引物将4种常见非白念珠菌(包括光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌)进行PCR扩增,并选用MspⅠ和HaeⅢ两种内切酶对扩增产物进行酶切分析。结果在4种非白念珠菌中光滑念珠菌15株(7.50%),近平滑念珠菌7株(3.50%),克柔念珠菌5株(2.50%),热带念珠菌2株(1.00%);PCR扩增后均产生稳定、清晰的条带,扩增产物经MspⅠ,HaeⅢ酶切后分别产生4种和2种特异性带型。结论外阴阴道念珠菌病非白念珠菌中以光滑念珠菌为主;PCR-RFLP方法在鉴定常见致病性非白念珠菌中比较可靠、稳定、特异,但仍有方法繁琐等不足之处。     

拓扑异构酶II基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌

目的:探讨拓扑异构酶II基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌的可行性。方法:用真菌拓扑异构酶II基因区通用引物dPsD1、dPsD2,先后对6种34株临床常见皮肤癣菌和2株白念珠菌以及4株曲霉的DNA进行巢式PCR(nested PCR)扩增,扩增后的阳性产物分别用限制性内切酶Hinc II和Hinf I酶切,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,根据结果来鉴定皮肤癣菌并在种的水平上区分这6种常见皮肤癣菌。结果:通用引物dPsD1对6种皮肤癣菌均能扩增出3 390 bp、dPsD2能扩增出2 380 bp的片段,而白念珠菌和曲霉则未见阳性扩增条带。扩增出的产物分别经Hinc II和Hinf I酶切后表现为58~1 670 bp长短不等的片段组合,根据这些特异性条带谱可以区分这6种临床常见皮肤癣菌。结论:拓扑异构酶II基因区的巢式PCR-RFLP方法,是鉴定和区分常见皮肤癣菌的有效方法。     

简并PCR结合RACE法克隆希木龙念珠菌CDR1基因

目的克隆希木龙念珠菌中药外排泵基因(CDR1),为探讨希木龙念珠菌的耐药机制奠定基础。方法首先从NCBI基因数据库中找到已知的白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌Cdr1蛋白的氨基酸保守序列,并设计简并引物,PCR扩增获得希木龙念珠菌CDR1c DNA部分片段,接着使用RACE方法分别扩增其5'和3'端序列得到完整的CDR1编码序列(CDS)。结果简并PCR扩增得到预期2 210bp大小的片段;5'RACE和3'RACE分别得到CDR1c DNA 5'和3'端片段,经纯化、克隆、测序、比对和拼接分别得到两株菌完整的CDR1c DNA序列;其编码的蛋白序列经比对发现与其它念珠菌的Cdr1蛋白高度同源。结论利用简并PCR联合RACE方法能够有效、准确地克隆出希木龙念珠菌CDR1基因。     

微孔板双探针杂交法快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌

目的 建立微孔板双探针杂交法,快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌,并应用于临床分离株的快速鉴定。方法 利用真菌保守区核糖体基因和可变区内转录间隔区基因为靶序列,应用生物素标记的通用引物进行念珠菌DNA的PCR扩增,并将该PCR产物分别与固定在微孔板上的都柏林念珠菌和白念珠菌特异性探针杂交,经酶联显色反应测其A值。结果 能特异地鉴别白念珠菌和都柏林念珠菌标准菌株。对108株常规培养方法从临床标本分离的白念珠菌检测,结果显示106株菌株仅白念珠菌探针检测阳性,另2株菌株仅都柏林念珠菌探针阳性。结论 微孔板双探针杂交法能快速、特异地鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌。     

白念珠菌菌丝相和酵母相ERG11基因部分序列差异性的探讨

目的 研究白念珠菌菌丝相和酵母相细胞ERG11基因碱基序列上的差异，探讨两相细胞之间的差异性。方法 分别抽提从同—HIV阳性患者体内分离到的7株对氟康唑敏感程度不同的白念珠菌菌丝相和酵母相的DNA，此系白念珠菌经染色体水平及DNA水平证实来源于同一亲本。根据ERG11编码序列设计一对引物，对ERG11的近3’端的310bp的碱基序列进行PCR扩增，引物序列为：上游引物5’-GGGAAAGTTTCTAAAGGGG-3’：下游引物5’-TATGrITAATCCAACTAAGTAA-3’。经PCR产物直接测序比较两相细胞ERG11基因碱基序列上的差异。结果 1株氟康唑剂量依赖性敏感和2株氟康唑耐药白念珠菌的菌丝相与酵母相细胞间均出现ERG11基因1547位点、1587位点和1617位点的不一致。结论 白念珠菌的菌丝相和酵母相ERG11基因的部分序列存在差异。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-RFLP比较分析

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因限制性片段长度多态性分析,比较两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提来自同一亲本、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌(CA-1,CA-2,CA-4,CA-6,CA-7,CA-9,CA-11,CA-13~CA-17)菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计一对引物,对其进行PCR扩增(包括部分上游和下游非编码区),扩增产物分别用AccⅠ和MunⅠ消化、琼脂糖凝胶电泳后观察。结果各株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出约1 734bp大小的目的片段,CA-7,CA-14,CA-16和CA-17株两相细胞ERG11基因RFLP图谱存在差异,其余受试菌株未见差异。结论从DNA全貌来看,白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因存在差异。     

常见致病性念珠菌的PCR-RFLP鉴定研究

目的 研究常见致病性念珠菌的分子鉴定方法,为深部念珠菌病的分子诊断奠定基础。方法 对常见9种致病性念珠菌的11株标准株和39株临床株的核糖体DNA内转录间隔区进行聚合酶链反应扩增,对扩增产物进行MspⅠ、HaeⅢ和DdeⅠ三种内切酶的酶切分析。结果 9种念珠菌聚合酶链反应扩增后产生5种不同分子量的条带,扩增产物经MspⅠ、DdeⅠ和HaeⅢ酶切后分别产生8种、5种和4种特异性带型。结论 聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性方法在鉴定常见的致病性念珠菌中稳定、可靠、特异,是传统方法的有益补充。     

麻风病患者皮损中分离出的分枝杆菌的分子鉴定

目的：在分子水平上鉴定麻风病患者皮损中分离培养出的抗酸杆菌。方法：首先对麻风病患者皮损中分离出的9株分枝杆菌的hsp65基因进行PCR扩增;其次,对其PCR扩增产物进行酶切,然后,对该9株菌的PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）分析的酶切带型进行分析;最后,再据上述初步鉴定结果,用特异性引物进行PCR扩增予以证实。结果：PCR-RFLP获得的酶切带型皆与细胞内分枝杆菌的酶切带型一致;用细胞内分枝杆菌的特异性引物分别对该9株临床分离株的模板DNA进行PCR扩增后,均获得271bp大小的特异性阳性条带。结论：麻风病患者皮损中分离出的9株分枝杆菌,其基因型表现属于细胞内分枝杆菌。     

Effects of antifungal agents on ergosterol biosynthesis in Candida albicans and Trichophyton mentagrophytes: differential inhibitory sites of naphthiomate and miconazole

The effects of naphthiomate and miconazole showing ergosterol biosynthesis inhibition on Candida albicans and Trichophyton mentagrophytes were investigated by measuring [14C]acetate incorporation into sterols and its precursors. Naphthiomate, like allylamine compounds, was found to interfere with fungal ergosterol biosynthesis by preventing the conversion of squalene into squalene epoxide which is mediated by squalene epoxidase. This metabolic inhibition resulted in a considerable decrease of ergosterol with a corresponding increase of squalene, which is more distinct in T. mentagrophytes than in C. albicans. This indicates that naphthiomate blocks the utilization of squalene by inhibition of squalene epoxidation; unlike N-substituted imidazole, miconazole has been known to inhibit ergosterol formation by inhibiting C14-demethylation. In addition, it is of interest to note that miconazole causes a great accumulation of lanosterol in C. albicans cells, while in T. mentagrophytes cells there was instead a drastic increase of 24-methylenedihydrolanosterol but not lanosterol. The results obtained from this study indicate that repression of ergosterol synthesis by naphthiomate and miconazole is due to inhibition of squalene epoxidation for the former and C14-demethylation for the latter.     

简并PCR结合RACE技术克隆马尔尼菲青霉未知基因

目的寻找高效克隆马尔尼菲青霉新基因的方法。方法从生物信息库中找出已知的酿酒酵母、白念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、构巢曲霉SKN7氨基酸保守序列,设计简并引物,PCR扩增获得部分马尔尼菲青霉SKN7 cDNA片段,随后应用RACE技术分别扩增其5′端和3′端未知序列。结果简并PCR扩增可产生多个条带,以预期大小1100bp处条带最清晰。5-′RACE得一约900bp大小产物,无非特异性扩增。3-′RACE扩增产物为多条片段,其中以700bp,400bp和200bp条带相对较清晰,纯化、克隆、测序、比对分析后证实700bp大小产物为目的片段。将上述产物序列进行对位拼接,获得一全长约为2.5kb的序列,它编码的蛋白与其他物种Skn7蛋白高度同源,为马尔尼菲青霉SKN7 cDNA。结论简并PCR结合RACE技术是一种高效、简单、有效的克隆马尔尼菲青霉新基因的方法。     

应用聚合酶链反应检测某些机会致病真菌的初步探讨

目的 探讨快速检测某些机会致病性直菌的方法。方法 以源于医学机会致病性真菌１８ｓｒＲＮＡ保守区的一对寡核苷酸序列为引物,利用聚合酶链反应对医学上重要机会致病性真菌ＤＮＡ进行扩增。结果 ３属７种２９株重要机会致病性直菌,经扩增均出现一条１９７ｂｐ的ＤＮＡ片段,而对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、人白细胞则不扩增。以溴化乙啶染色,该ＰＣＲ方法对白念珠菌ＤＮＡ的最低检出限为１ｐｇ。３０份临床标     

PCR检测部分病原真菌的实验研究

为探讨和评价ＰＣＲ技术在检测和鉴定病原真菌方面的作用,重点是引物的选择。首先比较了来自ｒＤＮＡ基因序列的通用引物的通用性,并用３对种特异性引物进行２次套式扩增。结果表明３对通用引物均能扩增出预期的靶ＤＮＡ带,平均大小分别为６２０ｂｐ,４８５ｂｐ和５８０ｂｐ;３对种特异性引物分别扩增出白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉ＤＮＡ,并提高了敏感性。说明用通用引物和种特异引物进行ＰＣＲ扩增可以用于病原真菌的检测和     

PCR方法快速检测一些常见医学真菌

目的 为选择一种快速、敏感和特异的方法来检测临床感染的真菌。方法 选取真菌１８ＳｒＤＮＡ序列中两个片段设计引物,对１２种菌株进行ＰＣＲ扩增,均扩增出长约３１０ｂｐ产物。对一些临床常见细菌扩增均无反应。对酶母相真菌白念珠菌、新生隐球菌进行敏感性实验检测。结果 发现二者ＰＣＲ最小检出量均为菌体数达每个反应体系１０＾３。本实验过程总耗时３６ｈ以内。结论 本实验方法可快速特异性检测一些常见医学真菌。     

念珠菌对唑类药物耐药机理的探讨

文献报道念珠菌对唑类药物耐药机制有三，即膜通透性降低、靶酶改变及靶酶产生过多。本文对２６株分离自艾滋病患者的耐氟康唑白念珠菌及通过诱变获得的白念珠菌ＡＴＣＣ１４０５３五个氟康唑耐药突变菌落的耐药机制进行了初步探讨。根据唑类药物靶酶编码序列设计六对上下之间交叉重叠的引物，分六段（包括相当于调控序列所在部位）将目的基因扩增出来，采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、限制性片段多态性分析及聚合酶链反应－单链构象多态性分析等方法对所获目的片段进行了分析。结果排除了所有受试菌株因靶酶编码基因缺失而耐药的可能，单链构象多态性分析结果呈阳性，且耐药株之间也存在差异。故此，推测耐药性系因为靶酶编码序列多位点突变造成，这一点尚有待进一步证实。另外，本实验结果不能排除另两条耐药机理的存在     

Rapid identification of Candida albicans and its related species Candida stellatoidea and Candida dubliniensis by a single PCR amplification using primers specific for the repetitive sequence (RPS) of Candida albicans

BACKGROUND: Candidiasis is caused by several Candida species, of which Candida stellatoidea and C. dubliniensis are phenotypically close to C. albicans. Although current molecular biology-based techniques can distinguish between C. albicans and C. dubliniensis, a convenient tool that can distinguish C. stellatoidea from C. albicans has not yet been developed. OBJECTIVE: To develop a system that can simply, rapidly and specifically distinguish C. albicans from the related Candida species C. stellatoidea and C. dubliniensis. MATERIALS: Genomic DNAs were purified from various yeast species and amplified by primers specific for the repetitive sequence (RPS) of C. albicans. The PCR products were purified and sequenced in order to test the specificity of the PCR amplification. RESULTS: The PCR primers only amplified several products from C. albicans, C. stellatoidea and C. dubliniensis. Sequence analysis of the products revealed that C. stellatoidea and C. dubliniensis both had RPSs including alt repeats, similar to C. albicans. After the PCR amplification, each of the three Candida species showed a unique amplification profile. Furthermore, RFLP analysis of the PCR products using EcoRI and ClaI produced species-specific restriction profiles. CONCLUSIONS: This PCR-based technique targeting the alt repeats in the RPS is useful as a tool for the rapid identification and distinction of C. albicans, C. stellatoidea and C. dubliniensis.     

四对孢子丝菌引物的特异性和敏感性评价

目的 筛选对孢子丝菌特异且敏感的引物。方法 以50株不同地区来源的孢子丝菌临床分离株及标准株的基因组DNA作为研究样本,以毛霉、烟曲霉、念珠菌临床分离菌株基因组DNA作为对照,通过特异引物PCR扩增的方法筛选国内外文献中报道的4对孢子丝菌引物。所有受试孢子丝菌菌株均出现同一扩增产物,而对照菌株未出现者记为特异性引物,随后将基因组DNA模板倍比稀释后依次行PCR扩增,记录各引物出现阳性扩增结果时的最小模板浓度,检测敏感性。结果 在相同PCR条件下,引物S2-R2、SSHF31-SSHR97及ITS3-SSP具有较好特异性,而引物SS3-SS4对孢子丝菌及念珠菌菌株均可扩增出同样大小的PCR产物。引物S2-R2的敏感性最好,基因组DNA模板浓度为5 pg/μL时即可被检出。结论 针对几丁质合成酶1基因的引物S2-R2为孢子丝菌特异且敏感的引物。     

PCR结合基因扫描分析技术对几种深部真菌病致病菌的快速检测及鉴定

目的 用PCR法快速鉴定22种(23株)深部真菌病致病菌种。方法 应用荧光标记的真菌通用引物ITS4与ITS86对22种(23株)深部真菌病致病菌种的菌悬液进行PCR扩增，扩增产物经ABI PRISM^TM377测序仪及基因扫描分析软件精确测定片段大小，与对照组——相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果 ①17种致病菌种菌悬液经ITS4、ITS86扩增出单一的片段(除了构巢曲霉和黑曲霉、白念珠菌和类星形念珠菌、裴氏着色真菌和皮炎外瓶霉片段长度相同)。②菌悬液扩增片段的扫描分析结果与其DNA扩增结果相近，差异无显著性。③整个检定过程仅需6h。结论 采用ITS通用引物及菌悬液PCR检测法，结合基因扫描分析技术可准确、特异、快速、敏感地检测并鉴定出22种深部真菌病致病菌种，这将有望成为快速诊断深部真菌病的一种方法。     

应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定

目的　探索一种简单、快速的申克孢子丝菌的鉴定方法。方法　应用真菌通用引物ITS1和ITS4对来源于不同地区及不同临床型别孢子丝菌病的 2 8株申克孢子丝菌以及 9种其他临床上重要的真菌进行PCR扩增 ,利用限制性内切酶HaeⅢ对PCR产物进行酶切分析鉴定。结果　所有 2 8株申克孢子丝菌和其他 9种真菌均扩增出一条约 3 5 0bp的片段 ,其中 2 8株申克孢子丝菌RFLP带型一致 ,与 9种其他临床上重要的真菌RFLP带型差异较明显。 结论　PCR RFLP可以为建立一种简单、快速鉴定申克孢子丝菌的方法提供依据。