类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库的构建

目的构建类风湿关节炎(RA)滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选和鉴定RA特异性基因的研究奠定基础。方法取确诊RA患者的滑膜组织,用Trizol试剂提取总RNA,Oligotex离心柱分离mRNA,电泳检测其质量,逆转录合成双链cDNA,经末端修平、接头连接、酶切后去除过多接头,收集>300bp的cDNA片段,与T7Select10-3载体连接,体外包装并扩增得到类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库。最后,通过铺平板滴度测定及PCR技术鉴定文库质量。结果所构建原始文库重组克隆数为2×107pfu,扩增滴度8.9×1010pfu/ml。PCR法检测片段插入率为90%,插入片段在300～2000bp之间。文库噬菌体裂解液PCR扩增得到BiP基因片段。结论成功构建了高质量的RA滑膜T7噬菌体展示cDNA文库,为下一步RA自身抗原的筛选奠定了基础。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库的构建

目的 :构建白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。方法 :抽提、纯化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫总RNA ,进行反转录合成第 1链cDNA ;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒进行长距离PCR ,合成全长双链cDNA ;PCR产物经蛋白酶K消化、提纯后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,然后经 1 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,回收 40 0bp以上的组分 ,并与λTriplEx2载体连接 ;连接产物经体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度 ;随机挑取 9个噬菌体 ,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增 ,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 :经检测 ,未扩增文库滴度达 2 0× 10 7pfu mL ,重组效率在 10 -4 稀释度时每块平板约 2 10～ 2 5 5个噬菌斑中均未发现任何蓝色噬斑 ,扩增文库滴度达 1 75× 10 9pfu mL ;用载体克隆位点两端的引物进行PCR鉴定 ,结果显示 :所选 9个噬菌体中均含有重组的cDNA ,并且均在 5 0 0bp以上 ,其中 1kb以上的有 2个、 70 0bp的有 5个、 5 0 0bp的有 2个。结论 :已成功地获得一高质量的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。     

高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。方法:在高温致神经管畸形动物模型上,提取高温致畸金黄地鼠胚胎神经管总RNA,用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成cDNA第1链,经LD-PCR合成全长双链cDNA,去除小于500 bp的片断后与λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成未扩增cDNA文库,再进行文库扩增。测定未扩增和扩增文库的滴度及重组率;随机挑取噬菌斑,经PCR扩增,电泳检测所构建cDNA文库的质量。结果:未扩增文库滴度为2.03×106pfu/ml,重组率为98.4%,文库扩增后滴度达2.503×109pfu/ml,重组率为97.6%。插入片段长度分布于500~3 000 bp之间。结论:成功地构建了高质量的高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。     

鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建与鉴定

目的:构建鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库并对文库质量进行鉴定。方法:利用oligo(dT)-纤维素亲和层析从SPF雏鸡法氏囊细胞制备mRNA,合成的双链cDNA定向克隆到T7EcoR I/HindIII载体臂,包装并构建cDNA表达文库。对文库进行滴度测定和重组子测定。扩增文库并进行PCR鉴定插入序列的长度及分布。结果:文库初始滴度为5×107pfu/mL,扩增后滴度达到1.88×1010pfu/mL。插入片段平均长度1440bp,主要分布在750～2000bp之间。结论:构建的鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库具有很高的质量,为进一步研究鸡B细胞发育以及传染性法氏囊病毒(IBDV)的分子致病机制奠定了实验基础。     

金仓鼠神经管cDNA文库的建立

目的　构建金仓鼠神经管cDNA文库,以筛选与神经管发育及神经管畸形发生相关的基因。　方法 　用TRIZOLReagent提取金仓鼠神经管总RNA;用LD PCR法反转录合成双链cDNA;经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、 CHROMASPIN 400柱分离去除小于500bp的片段;将cDNA与载体λTriplEX2按一定比例连接;经体外包装,建立 cDNA的噬菌体表达文库。　结果　cDNA文库容量为1.5×106pfu ml,重组率为99%,平均插入片段大于1kb。　 结论　我们初步构建的金仓鼠神经管cDNA文库为高效的cDNA文库。     

藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的:构建藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库,并进行初步鉴定.方法:用TRIzol试剂抽提藜草花粉总RNA并分离mRNA.以纯化的mRNA为模板,以含有Xho I内切酶位点和18 by的Poly(dT)序列的引物,用ZAP Express cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA.将cDNA修饰、分级纯化后,获得大于400 by的cDNA片段.将带有黏性末端的双链ds cD-NA与Uni-ZAP XR载体连接,采用ZAP Express cDNA文库合成试剂盒利用λ噬菌体构建藜草花粉λ噬菌体cDNA表达文库,用包装蛋白对合成的ds cDNA进行体外包装,以包装产物感染宿主菌XL1-Blue MRF即获得cDNA表达文库.用PCR方法检测cDNA表达文库的滴度和插人片段的大小.结果:构建的藜草花粉变应原λ噬菌体表达文库的滴度为9.7×10(8)pfu/L,重组率为100%,库容量为4.85pfu.插人片段的长度平均约为1.0 kb.结论:构建的cDNA表达文库的容量及插人片段的大小合适,适用于藜草花粉变应原cDNA克隆的筛选,为制备基因重组藜草花粉变应原疫苗奠定了基础.     

人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的:构建骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,为筛选骨肉瘤特异性抗原创造条件。方法:从9901细胞中提取总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,末端削平,和EcoR I适配子连接。磷酸化EcoR I适配子5’端,过Sephacryl一S400柱除去小于400 bp的cDNA片段,与噬菌体λgt11(载体)连接,用包装蛋白体外包装后形成初级cDNA文库。取适量包装体系倍比稀释后感染E.coli Y1090,测定文库克隆数、重组率,用PCR法测定cDNA插入片段的大小。最后扩增cDNA文库。结果:建成含1.5×106个重组子的骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,重组率为94.3％。重组子中插入的外源片段不小于 0.5 kb,平均长约1.4 kb。结论:达到良好文库的质量标准,适合进一步筛选目的cDNA克隆。     

藏羚羊大脑皮质cDNA文库的构建

目的:构建藏羚羊大脑皮质组织的cDNA文库并鉴定文库质量。方法:提取藏羚羊大脑皮质组织总RNA,经oli-gotex试剂盒纯化得到mRNA。利用SMART技术,使用含有SfiIB酶切位点的oligo(dT)引物和含有SfiIA酶切位点的SMARTIV寡核苷酸在PowerScript逆转录酶作用下运用mRNA5′末端的模板转换方法合成cDNA第1链。利用LDPCR扩增cDNA,经SfiI(ⅠA和ⅠB)酶切后,通过CHROMASPIN-400柱进行分级分离去除<500bp的片段,再同经SfiI酶切的λTripIEx2载体连接,体外包装后转染到大肠杆菌XL1-Blue宿主菌中,进行文库滴度和重组率的测定,然后扩增文库并随机挑取10个噬菌斑行PCR反应鉴定插入片段大小。结果:构建的cDNA文库滴度为1.8×109pfu/L,重组率>98%,文库扩增后滴度达8×1012pfu/L,插入片段长度在750～6000bp之间,平均长度为4250bp。结论:文库具有良好的质量,为进一步筛选、克隆藏羚羊大脑皮质组织特异表达基因奠定了基础。     

人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.方法:从2株人大肠癌细胞CCL-187和CX-1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、Xho Ⅰ酶切、过柱分级分离,除去＜400 bp片段.收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.结果:构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109 pfμ/L,重组率97%.重组子插入cDNA片段平均大小1 kb以上.结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础.     

云南个旧肺鳞癌YTMLC-90细胞株cDNA文库构建和鉴定

目的 :构建云南个旧肺鳞癌YTMLC 90细胞株的cDNA文库。方法 :从培养的人肺鳞癌YTMLC 90细胞株中提取总RNA ,利用经修饰的oligo(dT)引物 (含SfiⅠB酶切位点 )合成cDNA第1链。同时 ,根据真核生物mRNA 5′端帽子结构的特点 ,利用SMART核苷酸 (含SfiⅠA酶切位点 )作为cDNA第 1链在mR NA 5′端延伸出去的模板。以此序列为引物 ,利用LD PCR(long distancePCR)合成双链cDNA。双链cDNA经SfiⅠ (ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后 ,克隆入经SfiⅠ酶切的载体λTripIE× 2 ,经体外包装即为cDNA文库。结果 :人肺癌细胞株YTMLC 90的cDNA文库中 ,含有 1.0 1× 10 9pfu/L个重组子 ,重组率为 93.2 %。将该文库扩增后 ,克隆数可达 5 .2 4× 10 12 pfu/L ,插入cDNA的长度为 75 0～ 30 0 0bp。结论 :所构建的cDNA文库具有较好的质量 ,为进一步筛选、克隆肺癌特异性表达基因奠定了基础。     

Cleavage maps of human cytomegalovirus genome (strain towne) determined by the use of cosmid cloning system

Summary Virion DNA of human cytomegalovirus strain Towne was partially digested with endonuclease Hind III and fragments larger than 29 kbp were ligated to cosmid pHC79. The whole viral DNA sequence has been cloned in large overlapping segments carried by 32 recombinant cosmid clones (a pIT series). A whole set of Hind III fragments has also been cloned (a pHI series). By using these, we have constructed corrected cleavage maps of strain Towne DNA for Hind III, Bam H I, EcoR I and Xba I.With 4 Figures     

Construction and quality examination of murine naive T7 phage display antibody library

A naive single-chain variable fragment (scFv) antibody library of BALB/c mouse was constructed using T7 phage and the quality was examined. Fifty-five primers were designed to clone variable regions of light (440 bp) and heavy (450 bp) chains of antibody genes from non-immune mice. After overlap extension PCR, scFv fragments about 820 bp were obtained. Primary antibody library which titer reached 1.74×10⁷ pfu was constructed after package. After amplification the titer reached 1.78×10¹¹ pfu/ml. Ten random clones were amplified and five clones were sequenced to determine the quality of the library. Random PCR indicated that 90% phages contained desired fragments. Distinct difference among the five sequenced scFv fragments indicated good quality of the library. Phosmet conjugated with carrier protein was used as ligand to screen the library and specific plaques could be isolated. These results demonstrated that the library could be used as an effective platform to screen specific antibodies against certain molecules.     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标记的人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni2+-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍(第4轮与第1轮回收量分别为5.2×108、7.0×106 pfu),随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标记的人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni^2＋-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍（第4轮与第1轮回收量分别为5.2×10^8、7.0×10^6 pfu）,随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.     

噬菌体呈现抗体库的构建及抗Fas—Fab抗体的研究

目的构建噬菌体抗体库,获得具有功能的抗Fas-Fab噬菌体抗体。方法以Fas重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠。取其脾细胞提取mRNA,采用RT-PCR方法扩增抗体基因,构建重链和κ链基因库,用重组Fas抗原对所构建的抗体库进行4轮筛选,并以ELISA法鉴定其功能。结果获得抗体重链Fd基因和κ链基因长度约700bp。构建的重链Fd基因为3.5×106的抗体重链基因库。构建的重链和κ链基因库的容量均为3.1×106。经VCSM13感染得到噬菌体的滴度为8.9×1016cFu/L的噬菌体抗体库,含有抗体重链和κ链基因的噬菌体占27％。用重组人Fas抗原进行4轮筛选,得到100％的富集,说明Fas重组抗原富集了抗Fas-Fab噬菌体抗体,经ELISA检测均有抗Fas抗体的特异性。结论制备的可溶性抗Fas-Fab抗体具有抗Fas抗体的特异性,为进一步的研究奠定了基础。     

针对单克隆抗体MGb1的重组抗独特型抗体的筛选与鉴定

目的 利用噬菌体呈现技术筛选针对抗胃癌单克隆抗体（简称单抗）MGb1的重组抗独特型抗体（抗-Id）,为研制胃癌重组抗-Id瘤苗提供候选分子。方法 以单克隆抗体MGb1免疫Balb／c小鼠,取脾分离mRNA。RT-PCR分别扩增抗体VL和VH cDNA,经linker DNA连接形成ScFv DNA。将scFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv文库。以单抗MGb1对文库进行4轮淘选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现抗-Id scFv的噬菌体单克隆,进而经竞争ELISA对其所属抗-Id类型进行初步鉴定。结果 VL和VH cDNA分别约为320和340bp,ScFv DNA约为750bp。抗体ScFv文库经四轮淘选后,在随机筛检的50个克隆中得到18个呈现抗-Id ScFv的噬菌体单克隆。在18个克隆中,有4个呈现β或γ型抗-Id ScFv。结论 经重组噬菌体抗体技术成功地筛选到了针对单抗MGb1的噬菌体呈现型抗-Id ScFv,从而为进一步获得能诱导抗胃癌免疫的抗-Id ScFv奠定了基础。     

小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达文库的构建与鉴定

目的 采用Gateway技术构建适合酵母表达的小鼠巨噬细胞cDNA文库并进行鉴定.方法 将小鼠巨噬细胞的mRNA分离纯化后,以生物素标记的寡聚胸苷酸Oligo(dT)为引物反转录后连接attB衔接子(attB Adapter),层析柱纯化,通过BP重组反应将500 bp以上的片段克隆到含attP衔接子的pDONRTM222载体,电转化入ElectroMAXTM DH10BTMT1 Phage Resistant Cells,构建Gateway入门cDNA文库,并完全随机挑取单菌落,提取质粒酶切鉴定重组子插入片段大小.构建Gateway目的 载体,通过LR重组反应将入门文库转入此目的 载体成为酵母表达文库,挑取单克隆鉴定重组子插入片段大小.结果 经鉴定,入门文库平均滴度为(6.80±0.10)×105 cfu/ml,文库总容量为7.48×106 cfu,平均插入片段为(2.20±0.20)kb,重组率为100%.酵母表达文库平均滴度为(3.24±0.10)×106 cfu/ml,文库总容量为3.89×107 cfu,平均插入的片段为(2.27±0.15)kb,重组率为95.83%(23/24).结论 构建的小鼠巨噬细胞cDNA入门文库和酵母表达文库都符合高质量文库的要求,可用于进一步的研究.     

噬菌体抗体库技术筛选结肠癌单抗MC3的抗独特型抗体

目的：获得结肠癌单抗MC3的噬菌体呈现型抗独特型抗体（anti-Id）。方法：分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA,经RT－PCR分别扩增抗体VH和VLDNA,进而连接形成ScFv DNA。将ScFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库。以MC3对文库进行四轮筛选后,随机挑取克生经ELISA筛选呈现anti-Id ScFv的噬菌体克隆。结果：VH、VL和ScFv DNA分别约为340、320和750bp。抗体ScFv文库经四轮筛选后,在随机筛检的50个克隆中得到15个呈现antii-Id ScFv的菌体单克隆。结论：用噬菌体抗体库技术成功地获得了单抗MC3的anti-Id ScFv,从而为进行结肠癌重组anti-Id疫苗作用的研究提供了候选分子。     

多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析

从甘肃景泰羊源脑多头蚴原头节提取总RNA,以Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,利用Lambda ZAP II XR文库构建试剂盒构建了脑多头蚴cDNA表达文库.从构建的原始文库随机挑选单个噬菌斑进行PCR,确定文库重组率和插入外源基因片段大小,鉴定文库质量.结果表明脑多头蚴cDNA表达文库的原始库容量为1.0×1...