Wistar大鼠乳鼠与成年鼠心室肌细胞的分离与性质鉴定

目的 探索和优化稳定的适于电生理实验研究的乳鼠及成年大鼠心室肌细胞分离方法。方法 切碎乳鼠心室肌,胰蛋白酶消化,差速贴壁2 h纯化心室肌细胞,台盼蓝染色判定心肌细胞活力,体外培养48 h后分别行倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化鉴定,微电极阵列记录细胞搏动频率和场电位。采用Langendorff灌流成年大鼠心脏,主动脉逆行插管,胶原酶域反复灌流消化约30 min,无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心室肌组织,台氏液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,将细胞悬液用逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,用于膜片钳记录。结果 经4 -6次消化后,乳鼠心室组织消化完全,细胞存活率大于80%。倒置显微镜下观察,细胞呈梭形、多角形。 12 h有少部分细胞搏动,48 h细胞交织成网,搏动呈同步性,搏动频率30 - 80次/分。 琢鄄辅肌动蛋白（琢鄄actin）经免疫组化检测,纯度达96%。 Langendorff灌流酶解法可获得形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整、立体感强的单个成年鼠心肌细胞,存活率85%,复钙后存活率50%,可用于膜片钳记录。结论 采用本方法可以获得高产量与高质量的用于电生理检测的心室肌细胞。     

大鼠心肌细胞急性分离方法及影响因素探讨

目的探讨酶解法急性分离大鼠心肌细胞的相关影响因素。方法采用改良Langendorff主动脉逆行灌流法对大鼠全心工作细胞进行酶解分离,分析分离过程中的诸多条件,从中优化最佳的分离方案,为膜片钳实验提供合格细胞。结果分离所用灌流液pH值为7.35~7.40,分离细胞的存活率最高。不同复钙方法对后续细胞存活有明显影响。三步梯度复钙后的细胞存活率明显高于一步、二步复钙法。细胞分离时,灌流速度对细胞存活率有较大影响,3mL/min流速时细胞存活率最高,不同灌流流程对分离细胞的质和量较大影响。采用钙-无钙台氏液先后灌流后再行酶解分离方式可获得长杆状、棱角分明、立体感强的心肌细胞,该细胞复钙后存活率为(56.8±2.6)%;直接使用无钙台氏液灌流后再行酶解分离方法获得(57.2±3.3)%的心肌细胞,其复钙后存活率为(36.7±3.5)%,前述方法明显优于后者。结论灌流液的pH值、灌流速度、细胞分离后的复钙方法及不同的灌流流程等因素可对大鼠心肌细胞的急性分离结果产生显著影响。     

改良成年小鼠心室肌细胞分离方法

目的 小鼠是优良的背景基因动物,分离成体原代心肌细胞可以真实地从细胞和分子水平反映单个心室肌细胞的功能。小鼠心室肌细胞的分离和大鼠相比较困难,分离获得的细胞存活率较低,为提高小鼠心室肌细胞的成活率和收获量,本研究团队通过艰苦的摸索,改进了小鼠成体心肌细胞的分离方法。方法 该方法采用心脏在体主动脉插管,行独创的前加压灌流法冲洗心脏后接入改进的langendorff装置,用胶原酶液II灌流、消化心脏后,将心脏剪碎并用吸管吹打,经200目滤网过滤后获得单个小鼠心室肌细胞。本研究检测并对比了在体和离体主动脉插管获得的心肌细胞的状态：梯度复钙后,在倒置显微镜下观察细胞的形态和杆状心室肌细胞的数目。结果 研究结果显示：改良的主动脉逆行灌流法在缩短手术时间的同时,提高了小鼠心室肌细胞收获量和存活率。本课题组利用医用三通管,独创倒置灌流排气法,可以迅速排空灌流装置中的气体;利用注射器和灌流针结合,独创前加压灌流法,可以快速彻底地冲洗心脏中的血液;并采用实验室常规眼科镊和血管钳巧妙组合成协助装置,可以单人独立完成插管,不需要助手协助,节约人力,节省经费开支。结论 这一方法的改进使整个实验流程简化,缩短了实验时间,操作简便易学;同时该分离方法稳定、可靠、有效,可以为同类型实验提供思路和借鉴。     

犬心房肌细胞分离的方法学探讨

目的建立稳定的适于膜片钳实验研究的犬心房肌细胞分离方法。方法取健康成年犬心脏12个,采用Langendorff灌流,行回旋支插管,正常台式液灌流10 s,使心脏自主收缩排除残留余血。持续高钾液灌流,同时结扎其他血管及分支,剪去其余心脏组织,待左房及左心耳充盈,无钙台氏液灌流5 min,125 U/ml胶原酶Ⅱ200ml反复灌流消化约30~45 min,后用无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心房肌组织,KB液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,应用于膜片钳记录。结果分离的活性心肌细胞比率约90%,形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整。结论采用本方法可以获得高产量与高质量的用于膜片钳离子流检测的心房肌细胞。     

成年大鼠心室肌细胞的急性分离方法

目的介绍一种新型的成年大鼠心肌细胞的急性分离方法。方法麻醉大鼠后快速取心脏,为心脏先循环灌流无钙台氏液,后循环灌流酶液,酶解完成后取左心室,迅速置于含0.5 mg/ml BSA的KB液(恒温37℃)中拉碎,吹打数次后离心,去上清,温育在含0.5 mg/ml BSA的KB溶液中35 min,梯度复钙。结果首次分离细胞存活率在80%~90%,复钙完成仍有40%~50%的细胞维持杆状,横纹清晰且90%以上细胞处于静止状态。结论通过该方法可获得稳定、高比例的存活心肌细胞,能够为成年大鼠心肌细胞原代培养及电生理学研究提供高品质细胞。     

基于密度梯度法分离纯化的改良培养新生小鼠心肌细胞方法研究

目的基于Percoll不连续密度梯度法分离纯化心肌细胞,建立一个快速稳定提取新生小鼠心肌细胞的原代培养方法。方法在无菌状态下取C57BL/6乳鼠心室,用低浓度Ⅱ型胶原酶消化,通过调整温度、消化方式、离心时间及转速,采用Percoll密度梯度法分离纯化心肌细胞。观察不同时间心肌细胞形态;用0.4%台盼蓝染色检测细胞存活率及细胞数量;采用免疫荧光染色法检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达情况,鉴定心肌细胞及其纯度。结果 5次培养结果显示,心肌细胞的平均存活率为(93.12±0.75)%,纯度为(96.36±0.60)%,细胞生长状态良好,可以贴壁自发搏动。结论采用本方法能获得产量、存活率及纯度很高的新生小鼠原代心肌细胞,耗时较短,是一种理想的分离纯化原代心肌细胞的方法,可满足后续各种实验要求。     

SD大鼠心肌细胞分离方法探索

目的:探索一种稳定、简单、成功率高的,分离成年SD大鼠心肌细胞的方法。方法:采用Langendorff灌流法及二步酶解法获取单个心肌细胞,并与四步法进行比较。结果:二步法可获得横纹清晰、立体感强的单个心肌细胞,初步存活率(79.1±2.9)%,复钙后存活率(46.8±2.8)%,分别显著高于四步法的[(75.2±4.2)%,(40.2±2.2)%,P均0.05]。与四步法相比,二步法酶解所需时间和平均试验成本明显减少[(40.2±3.3)min:(30.1±3.4)min,(115.2±5.7)元:(100.6±7.6)元,P均0.05]。结论:该法快捷、简单、经济、重复性好,为心肌细胞的电生理研究打下良好基础。     

新生大鼠右心室心肌细胞的原代培养及鉴定

目的:建立一种简便、重复性好的新生大鼠右心室心肌细胞原代培养方法,为右心疾病及肺循环右心相关研究提供可靠的细胞工具。方法:采用出生1～3 d无特定病原体级,SD新生大鼠12只,无菌操作开胸取心脏后,在体视显微镜下分离右心室,用胰蛋白酶与Ⅱ型胶原酶联合消化法消化右心室心肌组织,差速贴壁法纯化右心室心肌细胞。用0.4%台盼蓝染色检测右心室心肌细胞存活率,在倒置显微镜下观察右心室心肌细胞的生长特点并记录细胞搏动频率。利用cTnT对右心室心肌细胞进行免疫荧光染色鉴定细胞纯度。结果:采用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化右心室心肌组织及差速贴壁法分离所得右心室心肌细胞存活率为(94.96±2.13)%。培养的心肌细胞24 h大部分贴壁并伸出伪足,少数细胞出现自发性搏动;48 h后细胞基本全部贴壁,伪足延长,出现局部同步化搏动;72 h后细胞伪足继续延长并形成细胞簇,搏动基本同步化;96 h后细胞连接成片,呈现完全同步化搏动,搏动频率为(121.2±10.7)次/min。用cTnT染色培养的细胞纯度达(96.71±2.66)%。结论:体视显微镜下分离右心室结合复合酶消化法能成功培养出纯度高、功能较好的新生SD大鼠右心室心肌细胞。     

新生大鼠心肌细胞的分离与培养

目的探讨新生大鼠心肌细胞分离与培养的条件和方法,建立简单、可靠的原代心肌细胞培养方法。方法新生SD乳鼠10只,开胸取心剪碎后,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化心肌组织,差速贴壁法纯化心肌细胞。倒置荧光相差显微镜下连续观察15 d心肌细胞形态特征及变化。用0.4%锥虫蓝染色测心肌细胞存活率,记录心肌细胞搏动次数。结果心肌细胞24 h基本贴壁并伸出伪足,出现自发性搏动,72 h后心肌细胞逐渐形成细胞簇,并呈现部分同步搏动,之后心肌细胞连接成片生长。心肌细胞存活率为96.5%,培养72 h至第15天内心肌细胞搏动次数无差异(P>0.05)。结论用该法分离与培养新生大鼠心肌细胞,操作简单且稳定可靠,心肌细胞存活率较高。     

成年小鼠心肌细胞的分离及电生理特性

目的 :摸索成年小鼠心肌细胞分离方法并观察其电生理特性。方法 :采用酶消化法分离单个心肌细胞 ,应用膜片钳全细胞记录技术记录钙电流和钾电流。结果 :本法分离所得心肌细胞横纹清晰 ,一次性复钙 ,可获得 5 0 %～6 0 %的耐钙细胞 ;并具有正常电生理活性 ,易于形成高阻封接 ,可用于钙电流和钾电流记录。结论 :本实验所采用的分离方法经济、简便、成功率高 ,所获细胞具有正常的电生理活性     

性别对成年小鼠心肌细胞收缩力的影响

目的研究性别对成年C57BL/6小鼠心肌细胞收缩力和钙瞬变的影响。方法采用Langendorff逆行灌流、Ⅱ型胶原酶消化方法分离不同性别成年C57BL/6小鼠心肌细胞,比较两组心肌细胞的形态学差异;运用Ion Optix细胞收缩及离子浓度同步测量系统,同步记录不同性别小鼠心肌细胞肌节长度及钙瞬变随电刺激的变化,比较两组间心肌细胞收缩力(肌节缩短幅度、肌节缩短率、肌节最大收缩速度和最大舒张速度)和心肌细胞钙瞬变(钙瞬变峰值、钙瞬变幅度和钙离子消除时间常数)的差异。结果成年雄性C57BL/6小鼠心肌细胞收缩力指标:肌节缩短幅度[(0.14±0.02)μm比(0.08±0.01)μm]、肌节缩短率(7.47%±0.93%比4.60%±0.59%)、肌节最大收缩速度[(-3.25±0.37)μm/s比(-2.11±0.38)μm/s]和肌节最大舒张速度[(2.45±0.29)μm/s比(1.57±0.31)μm/s]明显高于雌性小鼠(均为P<0.05)。此外,成年雄性C57BL/6小鼠心肌细胞钙瞬变指标钙瞬变峰值和钙瞬变幅度亦显著高于雌性小鼠(均为P<0.05),而雄性小鼠心肌细胞钙离子消除时间常数低于雌性小鼠[(122.40±22.99)ms比(189.20±19.54)ms,P<0.05]。结论成年雄性C57BL/6小鼠的心肌细胞收缩力及钙瞬变均高于雌性小鼠。     

溶血磷脂酸对幼年大鼠心肌细胞收缩和钙瞬变的影响

目的我们前期的研究发现LPA受体在幼年大鼠心脏的表达显著高于成年的表达,提示LPA信号在心脏收缩功能尚未成熟时可能具有更为重要的调节作用。本研究通过观察LPA对此未成熟阶段心肌细胞钙瞬变和收缩力的作用,探讨LPA信号对幼年心肌兴奋-收缩耦联的影响。方法 Langendorff装置逆向灌流胶原酶分离获得不同发育阶段大鼠心肌细胞;采用IonOptix细胞收缩和钙离子浓度同步测定系统进行心肌细胞收缩力和钙瞬变的测定;Western blot检测不同发育阶段心肌细胞LPA受体的表达。结果 LPA对出生后14天和21天大鼠心肌细胞的收缩和钙瞬变均没有显著影响,表明LPA信号并不参与出生后14-21天大鼠心肌细胞的兴奋-收缩耦联过程和心肌细胞收缩。在大鼠出生后发育过程中,LPA受体在心肌细胞的表达在出生后14天已显著下调,不同于在整体心脏表达下调的时间点(P21d),这可能是LPA对此发育阶段心肌细胞的收缩和钙瞬变均不产生影响的原因,提示在出生后14天LPA信号对心肌细胞的发育调节功能可能即已减弱或消失。结论 LPA信号对出生后14天及之后心肌收缩和钙瞬变无显著影响,但尚不能排除LPA对出生后更早期的未成熟心肌细胞收缩和兴奋-收缩耦联的作用。     

乳兔单一左心房肌细胞原代培养及鉴定

目的探讨分离、纯化、培养并鉴定乳兔单一左心房肌细胞的实验方法。方法取出生48 h内乳兔左心房,用0.1%胰酶加0.1%Ⅱ型胶原酶混合消化,将消化的细胞经两次差速贴壁,再加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷抑制成纤维细胞生长进行纯化。计算酶消化后细胞存活率;倒置显微镜下观察左心房肌细胞贴壁生长状况、形态学变化等;绘制细胞生长曲线;鉴定左心房肌细胞纯度。结果消化后细胞存活率平均为85.2%;在倒置显微镜下观察,证实培养的左心房肌细胞能在较长时间内保持较高的活力;2~5 d为左心房肌细胞对数生长期,5 d后进入平顶期;左心房肌细胞经鉴定纯度达95%。结论采用混合酶消化法可以获得纯度高,在一定时间内具有较高活力的单一左心房肌细胞。     

新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,培养存活率高和纯度高的心肌细胞。方法：无菌条件下取出出生1~2 d的SD大鼠心脏,用2.5 g/L胰蛋白酶和 2.0 g/L Ⅱ型胶原酶等量混合液在37℃条件下分次消化心肌组织。以差速贴壁并将时间延长至90 min纯化心肌细胞,48 h后换液。结果： 将心肌细胞24 h贴壁生长,于2~3 d心肌细胞伸出伪足,形成细胞簇,同步搏动,频率约80~130次/min,存活率为（93.9±2.8）%,纯度为（91.9±2.2）%。结论：以本实验的方法培养的心肌细胞存活率高、纯度高,是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。     

新生大鼠心肌细胞培养方法的改进

目的:建立便捷,成熟的新生大鼠心肌细胞体外培养方法。方法:本实验对常用的培养方法加以改进,采用胰蛋白酶及Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶共同消化法,分离新生大鼠心肌细胞,并对体外培养的心肌细胞的存活率、活力及纯度进行鉴定。结果:分离的心肌细胞存活率为96%,培养3 d后有60%~80%的细胞开始搏动,搏动频率平均50次/min,心肌细胞纯度在75%以上。结论:本实验建立的新生大鼠心肌细胞体外培养方法是成熟,可靠的。     

成年家兔心房肌细胞的分离和电生理记录

目的建立一种简单稳定的成年家兔心房肌细胞的分离、培养方法并进行电生理记录。方法麻醉后取出成年家兔心脏,采用Langendorff灌流装置及急性酶裂解法分离心房肌细胞,差速贴壁法进行纯化后培养于DMEM培养基。在倒置显微镜下观察细胞形态,利用透射电镜观察细胞超微结构,用免疫荧光染色法对心房肌细胞进行鉴定,利用全细胞膜片钳技术记录动作电位和内向钙电流和外向钾电流。结果本方法分离的心房肌细胞纯度和细胞存活率较高,并使用膜电钳技术成功记录了L-型钙电流和瞬时外向钾电流。结论该方法简便有效,细胞存活率高且为进一步进行各种电生理实验打下了基础。     

膜片钳实验中心肌细胞快速分离方法分析

目的介绍一种膜片钳实验中简便、快速分离大鼠和豚鼠心肌细胞的方法,探讨影响细胞分离产量和质量的原因。方法迅速取出动物心脏,挂在Langendorff装置上,分别用无钙台式液和酶液进行灌流一段时间,然后剪取心室部分,置于KB液中将其剪碎吹打分散,筛网过滤将滤液放置在2℃～6℃冰箱中冷藏4h后可进行膜片钳实验。结果用此方法分离出的心肌细胞存活率高,结构完整,具有良好的耐钙性和较长的存活时间。结论控制好分离心肌细胞分离中的各种实验条件和熟练的实验操作,是分离出适合于膜片钳实验的心肌细胞的重要因素。     

小鼠肝组织经胶原酶Ⅳ不同时长原位消化后Kupffer细胞的分选效果及其肿瘤细胞吞噬功能观察

目的 观察小鼠肝组织经胶原酶Ⅳ不同时长原位消化后Kupffer细胞的分选效果及其肿瘤细胞吞噬功能。方法 用0.04%胶原酶Ⅳ进行小鼠肝脏原位灌注及肝脏组织消化,根据消化时间长短（5、10、20 min）分为5 min消化组、10 min消化组、20 min消化组。Percoll密度梯度离心后获取肝脏非实质细胞（NPC）,通过台盼蓝染色计算细胞活率;免疫细胞磁珠分选（MACS）分选Kupffer细胞后通过台盼蓝染色计数Kupffer细胞总数,除以NPC总数,获得Kupffer细胞MACS分选后占比;光学显微镜观察Kupffer细胞形态学变化;流式细胞术分析Kupffer细胞在MACS分选前占NPC总数的比例,再用Kupffer细胞MACS分选后占比除以分选前占比得到MACS分选得率。体外共培养MACS分选所得Kupffer细胞与肿瘤细胞,流式细胞术检测Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬功能。结果 胶原酶Ⅳ灌注后的肝组织在0.04%胶原酶Ⅳ中于37℃继续消化5 min时NPC总活率、MACS分选的Kupffer细胞数目及Kupffer细胞占NPC的比例、MACS分选得率和细胞形态分析都显示...     

趋化素样因子2(CKLF2)mRNA在不同发育期大鼠心肌中的表达

目的检测趋化素样因子(CKLF2)mRNA在大鼠从胚胎到成年的各个不同时期的表达。方法应用竞争PCR方法,检测CKLF2mRNA在大鼠胚胎12,18d和出生即刻,3,7和21d乳鼠及成年鼠心室肌的表达。结果与成年大鼠相比,胚胎12d大鼠心肌CKLF2mRNA显著高表达,此后下降,出生时降到较低水平,生后有所增高,成年时表达水平最低。结论CKLF2可能参与大鼠胚胎期心肌细胞的增殖过程和出生后心脏发育过程。     

成熟心肌细胞的培养技术

成熟心肌细胞的培养 ,首先要成功地无菌分离成熟的心肌细胞 ,这比单纯地分离成熟心肌细胞或单纯地培养胚胎期和新生期心肌细胞较困难。一般可作典型的L angandorff装置 ,配合无菌操作要求来得到用于培养的无菌成熟心肌细胞。实验动物等都经消毒灭菌 ,分离仪器保存在分层的通风橱中 ,以免在分离过程上空气传播的污染物污染溶液。其它预防污染的方法有 :1用 70 %酒精彻底清洗分离装置 ,用无菌去离子水冲洗 ,在心脏灌流之前至少要进行两次冲洗 ;2在即将开始分离之前 ,对易于拆卸的装置进行灭菌 ,然后重新装好。分离用灌流液、酶液、保存液及培…