靶向H-ras基因的小干扰RNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用

目的:探讨脂质体介导的靶向H-ras基因的小发夹状RNA重组质粒对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖的抑制作用。方法:实验分4组:正常对照组(仅予脂质体处理)、转染psh RNA/H-ras处理24h组、48h组及72h组。分别于转染后不同时间进行MTT实验、软琼脂克隆形成实验、细胞周期检测和AO/EB双染实验,观察各组细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化。结果:FCM显示转染psh RNA/H-ras 24h及48h后的SKOV3细胞均出现细胞周期的抑制,48h后SKOV3细胞有显著的凋亡发生;转染psh RNA/H-ras1和pshRNA/H-ras2对SKOV3细胞克隆形成的抑制率分别为51.5%(P<0.05)和63.3%(P<0.01);MTT检测转染psh RNA/H-ras1和psh RNA/H-ras 272h后对SKOV3细胞增殖抑制率分别为62.5%和64.5%。AO/EB实验显示48h细胞的凋亡率为29.3%(P<0.05)。结论:重组质粒psh RNA/H-ras在人卵巢癌SKOV3细胞中有明显抑制细胞增殖的作用,并介导肿瘤细胞的凋亡。     

Rab25基因siRNA对人卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响

目的:通过RNA干涉抑制Rab25在人卵巢上皮性癌的过表达,观察Rab25基因siRNA对卵巢癌细胞增殖及诱导凋亡的效果。方法:构建针对Rab25基因的siRNA重组质粒,稳定转染A2780细胞,通过RT-PCR检测Rab25的表达;MTT法观察细胞增殖,绘制细胞生长曲线;Hoechst33258荧光染色和透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果:成功构建Rab25的siRNA,稳定转染靶细胞后可显著降低Rab25的表达,细胞生长速度减慢、增殖能力下降;荧光显微镜和电镜观察到细胞胞质浓缩、核凝聚、核碎裂和凋亡小体形成。结论:Rab25基因的siRNA能抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,为卵巢癌基因治疗开辟新途径。     

AKT基因被RNA干扰抑制后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响

目的通过RNA干扰技术阻断卵巢癌SKOV3细胞中AKT基因的表达,研究其对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响。方法人卵巢癌SKOV3细胞体外培养,分为对照组、空白载体组与RNA干扰组三组,采用MTT法与流式细胞仪AnnexinV／PI法检测并评价AKT基因干扰后对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。结果MTF结果显示RNA干扰组细胞增殖能力较对照组与空白载体组明显降低,差异具有统计学意义（P〈0．05）,空白载体组与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）;流式细胞仪AnnexinV／PI法检测结果显示,RNA干扰组细胞凋亡率高达到（79．52±2．31）％,较对照组与空白载体组明显升高,约是空白载体组与对照组的3倍,差别具有统计学意义（P〈0．05）。结论靶向AKT基因的小干扰RNA（siRNA）可有效地抑制卵巢癌细胞的增殖,促进细胞凋亡,是卵巢癌的治疗新方法。     

T7-shRNAs对SKOV3卵巢癌细胞株中C-erbB2基因的RNAi作用

目的:探讨设计含有T7-启动子的Oligo-DNA,继而合成T7发夹RNA,并应用T7-shRNAs对卵巢癌SKOV3细胞株的卵巢癌C-erbB2基因进行RNAi。方法:自行设计并应用体外转录法合成、筛选出3条T7-shRNAs,脂质体转染卵巢癌SKOV3细胞株,分为非转染组、无关RNA组、shRNA(a、b、c)组,免疫细胞、RT-PCR及CCK-8观测干涉结果。结果:体外转录结果,合成后电泳检测shRNA(a、b、c)纯度较高,符合实验标准;转染后免疫细胞爬片结果,非转染组、无关RNA组和shRNAc链24、48、72h可见细胞生长正常,与时相无关,着色为深棕色,无抑制效果;shRNAa链24h可见有一定抑制效果,但48h即开始恢复生长,72h已恢复正常;shRNA b链24、48、72h可见有明显抑制效果,以24~48h最为明显,至72h仍维持相当抑制率;在核酸水平上半定量的RT-PCR结果与上述结果相符合;CCK-8动态观测,经shRNA干涉后不同时间内的抑制曲线显示,shRNAb链的抑制作用最明显,而shRNAa链和shRNAc链的抑制作用不明显(P<0.01),但shRNAa链抑制作用强于shRNAc链(P<0.01),从整个时间段来看,shRNAb在48h的抑制作用最强。结论:研究证实应用发夹RNA对肿瘤细胞可以取得明显干涉效果,发现shRNAb对C-erbB2基因干涉具有明显抑制作用,进一步完善RNA干涉实验来抑制肿瘤细胞生长是存在可能的。     

薏苡仁油对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的作用及机制研究

目的 研究薏苡仁油对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的作用及其机制.方法 采用不同浓度薏苡仁油作用于卵巢癌SKOV3细胞,MTT法观察薏苡仁油对SKOV3细胞存活率的影响.采用Hoechst33342/PI染色、AO/EB染色、DNA Ladder检测、流式细胞仪检测薏苡仁油对SKOV3细胞凋亡的影响.Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Capase 3、8、9的表达情况.结果 与对照组相比,400μg/mL和500μg/mL薏苡仁油浓度可在处理后24 h、48 h和72 h显著降低SKOV3细胞存活率(t值4.635～5.231,P<0.05),其作用随着时间的延长而增加.薏苡仁油低浓度50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L作用于卵巢癌SKOV3细胞48h诱导凋亡效果较好.薏苡仁油作用于SKOV3细胞48h后,Hoechst33342/PI染色、AO/EB染色均可见典型的凋亡小体.不同浓度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL组薏苡仁油作用于SKOV3细胞48h后,与对照组相比较,细胞凋亡均显著增多(t值分别为2.536、3.012、4.908,P<0.05),其中200μg/m L组细胞总凋亡率高达(27.10±5.42)％.与对照组相比较,薏苡仁油浓度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用于SKOV3细胞48h后,Bax、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白表达均显著增高(t值2.436～5.709,P<0.05),Bcl-2蛋白表达显著下降(t值2.357～4.304,P<0.05).结论 薏苡仁油可诱导卵巢癌细胞株SKOV3凋亡,其机制可能与下调抑制凋亡蛋白Bcl-2、上调促凋亡蛋白Bax、Caspase 3、8、9的表达水平有关.薏苡仁油有可能抑制卵巢癌细胞的扩散、转移.     

shSASH1基因对卵巢癌细胞SKOV3生物学功能的影响

目的 探讨SASH1对卵巢癌细胞SKOV3的增殖、凋亡与侵袭方面的影响.方法 标本组织来源于妇产科手术收集的50例卵巢癌组织.通过建立重组质粒pcDNA3.1-SASH1,并借助于脂质体2000转染到SKOV3,采用流式细胞计(FCM)分析实验和细胞侵袭实验,来探索SASH1对卵巢癌细胞SKOV3在细胞扩散、凋亡和侵袭中的影响.结果 pcDNA3.1-SASH1转染组中的s期细胞分值(％)低于正常(未转染的)对照组(x2=26.78,P＜0.01)或空载组(pcDNA3.1) (x2=25.12,P＜0.01).与空载组和正常(未转染的)对照组相比,pcDNA3.1-SASH1转染组中的SKOV3明显降低了癌细胞的生长、增殖和侵袭的能力(x2=31.25,P＜0.01),然而在空载组和正常(未转染的)对照组中没有明显的差异;pcDNA3.1-SASH1细胞组显示更多的凋亡细胞(x2=36.58,P＜0.01).结论 SASH1可抑制卵巢癌细胞SKOV3的生长、增殖和侵袭能力,并促进其凋亡.     

siRNA-STAT3对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

目的:探讨pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒抑制人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。方法:应用人卵巢癌细胞株SKOV3对15只裸鼠构建卵巢癌移植瘤模型,随机分为生理盐水对照组、空质粒对照组、重组质粒组。联合电转染技术向裸鼠移植瘤内注射重组质粒,每隔5天重复注射1次,每4天测量各组裸鼠皮下移植瘤体积。采用TUNEL法检测肿瘤组织细胞的凋亡情况。结果:重组质粒瘤内注射对卵巢癌移植瘤生长有明显的抑制作用,与两个对照组比较重组质粒组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢(P<0.01)。TUNEL染色显示重组质粒组癌组织有大量细胞凋亡。结论:pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能有效诱导人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤组织中细胞凋亡,抑制肿瘤生长。     

黄连素对人卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨黄连素对人卵巢癌细胞株OVCAR3增殖和凋亡的影响,为卵巢瘤的治疗提供实验依据。方法采用不同浓度的黄连素处理人卵巢癌细胞株OVCAR3,等体积培养基培养正常对照组细胞。CCK-8法观察黄连素对卵巢癌细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测黄连素处理后细胞凋亡情况;RT-PCR、Western Blot分别检测卵巢癌细胞中Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白表达情况。结果黄连素抑制人卵巢癌细胞株OVCAR3的增殖且呈时间剂量依赖性,并促进细胞凋亡。RT-PCR、Western Blot结果显示:黄连素作用于OVCAR3细胞株后,细胞Caspase-3、Caspase-8 mRNA及蛋白表达升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论黄连素能够通过抑制人卵巢癌细胞株OVCAR3增殖、促进凋亡发挥抗肿瘤作用,可为临床卵巢癌治疗策略提供新的思路。     

VEGF的RNAi对卵巢癌细胞SKOV3生物学活性的影响

目的检测靶向血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹RNA(shRNA)质粒载体对卵巢癌细胞株SKOV3生物学活性的影响作用。方法构建携带有GFP报告基因的VEGF-shRNA质粒载体,脂质体转染方法转入卵巢癌细胞株SKOV3,通过流式细胞术检测细胞的转染效率,RT-PCR及Western blot检测转染细胞内VEGF-mRNA及蛋白的表达变化,MTT法检测细胞增殖抑制率,人工基底膜侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果VEGF-ShRNA稳定转染后,SKOV3细胞内VEGF-mRNA及蛋白表达水平显著下降;VEGF-ShRNA对SKOV3细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑增殖效应呈时间依赖性;VEGF-CshRNA组可有效抑制SKOV3细胞的人工基底膜体外侵袭能力。结论VEGF在卵巢癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用,通过RNA干扰技术实现VEGF沉默在卵巢癌的生物治疗中具有较好的应用前景。     

细胞增殖和凋亡在卵巢癌发病中的作用

目的为阐明细胞增殖和凋亡在卵巢癌发病中的作用提供依据,选用卵巢肿瘤组织标本进行不同病变中细胞增殖和凋亡分析研究.方法用免疫组化ABC方法对47例卵巢肿瘤包括良性肿瘤、交界性肿瘤和卵巢癌组织中的细胞增殖抗原(PCNA)和凋亡基因bcl-2进行了检测,并用形态学方法进行凋亡细胞分析.结果PCNA增殖指数随着病变加重而增高,且相互病变之间这些标志物的变化经方差分析有显著性差异(P＜0.05),凋亡指数在良性肿瘤和交界性肿瘤均显著高于正常组织和卵巢癌组织.结论细胞增殖指数与卵巢组织病变相一致,细胞增殖是卵巢癌发生发展的一个重要因素.细胞凋亡在癌变中作用需进一步研究.     

过表达PTEN对SKOV3和SKOV3-ADM细胞增殖的影响

目的:研究过表达PTEN对卵巢癌细胞SKOV3和卵巢癌耐药细胞株SKOV3-ADM增殖能力的影响。方法:构建PTEN真核表达载体,采用脂质体转染技术转染入SKOV3及SKOV3-ADM细胞,采用RT-PCR和Western-blot检测PTEN基因及蛋白表达水平的变化,判断转染效果;MTT法检测细胞增殖速率变化。结果:转染PTEN表达载体至SKOV3及SKOV3-ADM细胞后,RT-PCR及Western-Blot实验证实SKOV3和SKOV3-ADM细胞中PTEN基因及蛋白表达水平明显上调。MTT结果显示,上调PTEN表达后的SKOV3和SKOV3-ADM细胞相对于空白和阴性对照组,细胞的体外增殖能力明显减弱(P<0.01)。结论:PTEN蛋白在卵巢癌的发生发展过程中起着抑制作用,可能成为一种新的肿瘤分子治疗手段。     

EGFR基因靶向RNA干扰抑制卵巢癌细胞增殖的研究

目的:利用RNA干扰技术抑制卵巢癌细胞株skov3细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达及细胞的体外增殖活性。方法:根据EGFR mRNA序列设计特异性siRNA插入序列,体外合成该序列后将其定向克隆入线性化质粒pSilencerTM2.1-U6neo,以HifectinII真核转染试剂将重组质粒转染至skov3细胞中,用RT-PCR和免疫细胞化学方法分别鉴定转染前后EGFR基因在mRNA和蛋白水平表达的变化;四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定转染前后细胞增殖活性的改变。结果:DNA测序证实EGFR siRNA表达载体的siRNA插入序列完全正确,该表达载体可特异性抑制EGFR基因的表达;转染后细胞的增殖受到抑制,其中第5天的抑制率达到30%(P<0.05)。结论:靶向EGFR的序列特异性siRNA真核表达载体可有效抑制skov3细胞中EGFR基因的表达和细胞的增殖。     

STAT3信号转导通路调控人宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡的机制

目的:探讨信号传导和转录激活因子3(Stat3)通路与人宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡的关系,明确以Stat3为靶向的信号传导通路调控Hela细胞增殖、凋亡的分子机制。方法:人宫颈癌Hela细胞用酪氨酸激酶(JAK)抑制剂AG490处理,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖;流式细胞仪(FCM)测细胞凋亡及细胞周期;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测JAK2、Stat3、磷酸化Stat3(p-Stat3)、CyclinD1、Survivin的表达。结果:人宫颈癌Hela细胞中Stat3、p-Stat3、JAK2呈阳性表达。AG490呈时间和剂量依赖的方式抑制Hela细胞的增殖,促进其凋亡(P<0.05)。Western blot检测显示p-Stat3、CyclinD1、Survivin的表达水平随作用剂量的增大而逐渐下降(P<0.05),Stat3的表达未见明显变化(P≥0.05)。结论:Stat3信号转导通路与宫颈癌Hela细胞的增殖、凋亡密切相关,可能通过其下游靶基因蛋白CyclinD1、Survivin发挥作用。阻断Stat3信号通路可能为宫颈癌的防治提供一种新的策略。     

靶向hTERT的siRNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖及化疗敏感性的影响

目的:探讨RNA干扰沉默人端粒酶反转录酶(hTERT)的表达后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及化疗药物敏感性的影响。方法:化学合成hTERT siRNA及Control siRNA,用EntransterTM-R转染试剂将hTERT siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞。采用Real time-PCR法及Western blot法检测SKOV3细胞中hTERT mRNA及对应蛋白的表达;流式细胞术(FCS)检测细胞凋亡率;并分别用顺铂、阿霉素作用于SKOV3细胞,WST-1法检测细胞存活率及两种化疗药物的IC50。结果:与对照组相比,转染hTERT siRNA后,hTERT mRNA及蛋白表达量明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),同时该组细胞的顺铂、阿霉素IC50显著下降。结论:hTERT siRNA不仅可以显著抑制卵巢癌SKOV3细胞中hTERT基因的表达,同时提高细胞对化疗药物的敏感性。     

新靶点CDK2干扰RNA对人脑胶质瘤增殖影响

目的构建4个新靶点的人细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)干扰RNA真核表达载体,转染人脑胶质瘤细胞后,检测出干扰效果最好的载体及细胞增殖能力的变化。方法构建4个新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体并用双酶切和测序鉴定;分别转染上述4个载体到人脑胶质瘤细胞株SHG44;通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)比较转染后CDK2 mRNA的表达量,选出干扰效果最好的一个,检测细胞增殖能力的变化。结果成功构建4个新靶点的CDK2干扰RNA真核表达载体P^CDK2-1、P^CDK2-2、P^CDK2-3、P^CDK2-4;CDK2 mRNA表达和细胞增殖明显受到抑制,P^CDK2-1的干扰效果为56%; P^CDK2-1-SHG44细胞与对照组相比增殖能力减弱。结论成功构建并筛选出效果最好的新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体,并使SHG44细胞的增殖水平降低。     

在位与异位子宫内膜细胞凋亡及免疫组化研究

目的:探讨子宫腺肌病与卵巢内膜异位囊肿异位内膜细胞凋亡和增殖特性及发病机制。方法:2004年6月～2008年6月手术病例采用免疫组化EnVision法检测子宫腺肌病和卵巢异位囊肿各60例的在位及异位子宫内膜中凋亡调控基因蛋白Bcl-2、bax及细胞增殖标记物ki-67蛋白表达。结果:Bcl-2蛋白、bax蛋白及ki-67蛋白在两病的在位内膜及子宫腺肌病异位内膜中均呈现周期性改变,而Bcl-2蛋白及ki-67蛋白在卵巢异位囊肿异位内膜中呈持续性增强,较在位内膜差异有统计学意义(P<0.05)。结论:子宫腺肌病异位内膜的细胞凋亡和增殖受卵巢性激素周期性调节,卵巢异位囊肿异位内膜则相反,两者细胞凋亡和增殖特性截然不同,是两种不同的疾病。     

TAM和MPA联合用药对卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV-3/DDP生长的影响

目的:探讨三苯氧胺(tamoxifen,TAM)和甲孕酮(medroxyprogesterone,MPA)联合用药对顺铂耐药的卵巢癌细胞株SKOV-3／DDP生长影响的机制。方法:用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、电子显微镜及流式细胞仪测定用药前后SKOV-3／DDP细胞生长、形态学、周期及凋亡率的变化。结果:低浓度的TAM和MPA联合用药组对SKOV-3／DDP细胞生长无影响。高浓度用药组可抑制卵巢癌细胞生长,电子显微镜可观察到细胞凋亡的形态学变化,1×10-6~1×10-4mol／L的TAM和MPA联合用药组在抑制细胞增殖的同时尚可诱导细胞凋亡,其细胞凋亡率分别为4.06％、11.77％、19.3％,两两比较,差异均有显著性(P<0.05)。结论:TAM和MPA联合用药既对顺铂耐药的卵巢癌细胞有杀灭作用,又因其较小的副作用及肯定的临床意义有可能成为卵巢癌有效的化疗辅助用药。