乳腺癌耐药蛋白(BCRP)高表达耐药细胞系的建立及其耐药机制的初步研究

目的:建立稳定表达乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)的小鼠成纤维细胞系PA317/BCRP,初步探讨其耐药机制.方法:从乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR中克隆BCRP基因.将编码序列克隆导入真核表达载体pcDNA3.1,转化感受态E.Coli DH5α,获得重组质粒pcDNA3.1/BCRP,酶切并测序鉴定.用电穿孔法将质粒转染PA317细胞,同时转染pcDNA3.1/EGFP.G418筛选阳性克隆.阳性转染细胞提取细胞总RNA,RT-PCR检测BCRP的mRNA表达.Western blot检测BCRP蛋白表达.MTT法检测耐药克隆PA317/BCRP细胞对米托蒽醌(Mitoxantrone,MTZ)耐药性,罗丹明123外排实验验证转染后细胞外排罗丹明123功能.Western blot检测P13K-AKT信号转导通路下游靶点AKT表达变化.结果:构建质粒pcDNA3.1/BCRP,转染PA317细胞,G418筛选.RT-PCR和Westem blot,均检测到细胞中BCRP基因转录及蛋白表达.与空质粒转染细胞、未转染细胞时照组相比,PA317/BCRP细胞对MTZ耐药性增强,且外排罗丹明123能力增强.检测P13K-AKT途径下游靶点AKT蛋白磷酸化水平在PA317/BCRP细胞内明显增高.结论:1、成功获得稳定表达BCRP的PA317细胞系-PA317/BCRP,经MTT和罗丹明123外排实验证实,其耐药和外排功能增强.2、检测PA317/BCRP细胞P13K-AKT途径下游靶点AKT的表达,观察到耐药细胞的AKT表达含量明显高于转染空质粒和未转染的PA317细胞.推测BCRP可能通过影响AKT表达上调发挥其耐药作用.     

CA11对胃癌细胞SGC-70901的放疗增敏作用

目的研究CA11基因对人胃癌细胞株SGC7901放疗增敏的作用。方法以pcDNA3.1-CA11质粒转染人胃癌细胞株SGC7901后对细胞株行放射处理,Western blot、RT-PCR检测凋亡相关酶Caspase-3的表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 pcDNA3.1-CA11质粒转染的SGC7901放疗72 h后Caspase-3在mRNA、蛋白水平表达明显上调,CA11转染组细胞增殖抑制率为(35.41±3.78)%,较对照组的(7.32±0.92)%、空质粒转染组的(10.06±1.47)%,明显升高(均P0.05);CA11转染组细胞凋亡率为(42.19±7.17)%,较对照组的(7.79±1.01)%、空质粒转染组的(20.43±6.24)%,明显升高(均P0.05)。结论 CA11基因对胃癌细胞株SGC7901细胞具有放疗增敏作用。     

Sox2对膀胱癌细胞化疗耐药的影响及其分子机制的探讨

摘 要：［目的］ 探讨Sox2对膀胱癌细胞化疗耐药的影响及其分子机制。［方法］ 选用T24人膀胱癌细胞系,采用浓度递增方式建立顺铂耐药细胞系T24/DDP,慢病毒载体转染对应细胞,进行Sox2基因过表达或敲除,得到T24-Sox2细胞和T24/DDP-shSox2细胞系。qRT-PCR和Western blot检测各组细胞中Sox2与多药耐药相关蛋白（MRP）表达水平。MTT实验检测各组细胞在不同浓度顺铂作用下的吸光度值并计算IC50,绘制耐药曲线。流式细胞术检测各组细胞凋亡率,并使用qRT-PCR和Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。［结果］ qRT-PCR和Western blot结果证实Sox2和MRP在膀胱癌顺铂耐药细胞系中高表达,耐药曲线提示Sox2与膀胱癌的顺铂耐药存在一定关联,耐药细胞系的IC50为(15.24±1.12)μg/ml,而非耐药细胞系的IC50为(4.88±0.72) μg/ml,P<0.05。Sox2表达上调能够抑制膀胱癌细胞凋亡,凋亡率从74.62%下降到25.84%,P<0.05。Bax和Caspase-3在Sox2高表达的细胞中呈低表达,而Bcl-2则呈高表达。［结论］ Sox2基因在顺铂耐药膀胱癌细胞系中表达水平显著高于正常非耐药膀胱癌细胞,且Sox2可能是通过抑制细胞凋亡来实现对化疗敏感性的调控。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1(+)-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论:重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

转染Livin基因后骨肉瘤细胞系的多药耐药性研究

目的:探讨转染Livin基因后人骨肉瘤细胞的多药耐药变化.方法:采用基因重组技术构建Livin 基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin ,经酶切和基因测序分析对构建结果进行鉴定;通过脂质体将含Livin基因的表达载体转染人骨肉瘤细胞U-2OS,RT-PCR检测基因转录水平;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞在不同化疗药物作用下的细胞耐药性.结果:经酶切鉴定和基因测序分析证明真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin 构建成功.将该表达载体转染U-2OS细胞后,Livin基因的表达水平与野生型U-2OS细胞和转染空载体的U-2OS/neo细胞相比显著提高(P<0.01) .与U-2OS细胞和U-2OS/neo细胞相比,U-2OS/Livin细胞对ADM、CTX、MMC和DDP等化疗药物的耐药性也明显增强(P<0.01).结论:Livin基因高表达是人骨肉瘤多药耐药的原因之一.     

NDRG2对A549肺癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨NDRG2(N-myc downstream regulated gene 2)对于肺癌细胞系增殖的抑制作用。方法:将NDRG2基因转染进肺癌细胞系A549,采用G418筛选出稳定高表达NDRG2的亚克隆细胞系A549/NDRG2-flag并将仅转染载体的A549/pcDNA3.1(+)作为阴性对照。Western blot检测NDRG2在转染细胞中的表达水平。MTT、平板克隆形成试验检测转染前后细胞增殖作用的差异,流式细胞仪检测转染后细胞的周期分布状态。结果:成功构建高表达NDRG2的亚克隆细胞系A549/NDRG2-flag。证实了NDRG2的高表达能够抑制肺癌细胞系的增殖(P<0.01),使肺癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期。结论:NDRG2高表达后能够有效抑制肺癌细胞系A549增殖并阻滞细胞周期滞留在G0/G1期。     

抑制人高迁移率族蛋白1基因表达对胰腺癌细胞凋亡影响的研究

目的:探讨反义人高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因转染对人胰腺癌细胞的凋亡诱导作用及对Bcl-2/bax mRNA表达水平的影响.方法:应用分子克隆技术构建反义HMGB1基因真核表达栽体pcDNA3.1/anti-HMGB1,脂质体介导转染人胰腺癌细胞pane1,G418筛选获得阳性克隆.RT-PCR方法检测HMGB1、Bcl-2和Bax表达水平,MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡及细胞周期情况.结果:成功构建pcDNA3.1/anti-HMGB1真核表达裁体,转染pcDNA3.1/anti-HMGB1可使pancl细胞HMGB1和Bcl-2 mRNA表达水平显著降低,P<0.01;Bax mRNA的相对表达量明显升高,P>0.05;与对照组相比,Bax/Bcl-2 mRNA的比值显著升高,P<0.05.肿瘤细胞增殖能力明显受到抑制,P<0.01;并出现G1期阻滞和凋亡细胞百分率增加.结论:反义HMGB1基因转染能抑制胰腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,是胰腺癌基因治疗的策略之一.     

Mda-7/IL-24基因转染对肝癌细胞生长的影响

目的研究Mda-7/IL-24基因对肝癌细胞系Hep3B生长的影响。方法构建Mda-7/IL-24基因的真核表达载体pcDNA3.1/Mda-7/IL-24,用脂质体介导的基因转染法分别将真核重组体pcD-NA3.1/Mda-7/IL-24和pcDNA3.1空载体质粒导入人肝癌细胞系Hep3B细胞中,经G418筛选获得细胞克隆。通过聚合酶链式反应（PCR）、免疫组织化学等方法检测基因和蛋白的表达、细胞生长增殖情况。结果将pcDNA3.1载体和pcDNA3.1/Mda-7/IL-24重组体转染肝癌细胞系Hep3B中,RT-PCR结果显示pcDNA3.1/Mda-7/IL-24克隆中有680bp的扩增条带,而pcDNA3.1空载体转染的克隆未见的扩增条带,未转染的Hep3B细胞亦未见680bp的条带;转染Mda-7/IL-24的Hep3B细胞与空白质粒载体转染的Hep3B细胞和Hep3B细胞的生长速度相比,后两者生长速度较快。结论将外源性Mda-7/IL-24基因导入Hep3B细胞后,可以抑制细胞生长。     

稳定转染HBx基因的HepG2细胞株的建立及其对p53-p21途径的影响

目的 将构建的乙型肝炎病毒X基因的真核表达载体稳定转染HepG2细胞株, 并研究转染后对p53-p21途径的影响。 方法 用基因转染的方法将已构建的载体pcDNA3.1-HBx 转染入肝癌细胞HepG2中, G418筛选出稳定转染X基因的细胞株。细胞生长曲线、平板克隆形成实验检测转染后肝癌细胞的恶性表型,流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,Western blot检测p53蛋白的表达,RT-PCR检测p21基因。结果 成功筛选出pcDNA3.1-HBx稳定转染的HepG2细胞株;细胞生长实验、平板克隆形成实验显示稳定转染乙型肝炎病毒X基因的肝癌细胞恶性表型增高;流式细胞仪结果显示,转染后的细胞株凋亡率增高,G₁/G₀期细胞减少,G₂期细胞增多;Western blot 和RT-PCR分别显示,转染株p53蛋白表达增高,且下调p21基因水平。 结论 乙型肝炎病毒X蛋白可刺激肝癌细胞生长, 稳定转染X基因的细胞株可能通过p53-p21途径增加肝癌细胞的恶性表型。