实时荧光RT-PCR及RT-PCR快速检测肠道病毒71型和柯萨奇A16病毒

肠道病毒71型(Enterovirus 71,简称EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,简称CA16)是引起手足口病的两种主要的病原体,常相伴造成手足口病的暴发流行,每次流行中两种病毒中所占的比例有所不同[1].EV71感染引起HFMD常有严重的神经系统并发症发生,CA16感染引起自限性的手足口病,极少发生严重并发症和死亡[2～6].2008年安徽、广东(包括深圳市)、浙江等28个省市出现手足口病暴发流行,因此,亟须一种特异性强,灵敏度高的方法对这两种病毒进行快速区分检测.     

北京市儿童手足口病与肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型感染有关

目的了解2007年5-6月北京市儿童中流行的手足口病的病原。方法于2007年5、6月间采集来首都儿科研究所附属儿童医院门诊就诊的手足口病患儿咽拭子标本6份和1份病情危重的手足口病并发神经系统症状而急诊收住院患儿（编号F4243，年龄9岁8个月，女性）的经气管插管呼吸道抽吸液、脑脊液及血清标本。将咽拭子和气管插管抽吸液标本接种Hep-2、MDCK和Vero细胞进行病毒分离。同时设计位于肠道病毒5^＋非编码区（UTR）的通用引物2对（巢式PCR）、肠道病毒71型（EV71）VPl基因不同位置的特异性引物2对半（PCR和半巢式PCR）和柯萨奇病毒A组16型（CAl6）的特异性引物1对检测标本中的病毒核酸。首先用随机引物将标本中的RNA逆转录成cDNA，然后分别用上述引物进行PCR扩增肠道病毒5^＋UTR和EV71／CAl6的VPl基因片段；对EV71阳性的标本还扩增了VPl全基因，扩增产物直接进行序列测定和分析。结果6例门诊就诊的普通手足口病患儿和F4243的呼吸道标本中均扩增到肠道病毒5^＋UTR基因片段，有2例门诊患儿和F4243的标本中还扩增到EV71的VPl基因片段，提示该组手足口病患儿均为肠道病毒感染，其中3例为EV71感染。序列测定和分析表明有1例普通手足口病患儿（F4211）和F4243标本确定为EV71。所有标本接种Hep-2和MDCK细胞均未出现病变，说明常见的呼吸道病毒为阴性。除1份咽拭子标本（F4283）外，其余6份接种Vero细胞的标本均出现细胞病变。用肠道病毒通用引物和EV71特异性引物对分离到的病毒株核酸的扩增结果显示这6株病毒均为肠道病毒，其中F4211和F4243为EV71，与直接从呼吸道标本中扩增的结果相符；其余4株为CAl6。结论北京市儿童中流行的手足口病与肠道病毒EV71和CAl6感染有关；EV71可以在5岁以上儿童中引起严重的神经系统并发症，应引起注意。     

多重荧光逆转录PCR同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型

目的建立多重荧光逆转录PCR（RT-PCR）同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的方法。方法在肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型VP1基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化多重荧光RT-PCR反应体系,评价所建多重荧光RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于临床样品检测。结果该方法对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型检测具有高度特异性,检出限分别为0.1 TCID50和1 TCID50,具有较好的稳定性,可直接应用于临床样品的检测。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR可以同时准确检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的新方法。     

肠道病毒71型与柯萨奇病毒16型病原体检测在手足口病流行中的意义

目的探究肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒16型(Cox A16)病原体RT-PCR检测在预防手足口病传播中的意义。方法对70例疑似手足口病患儿和30例健康儿童的粪便进行EV71和Cox A16及肠道病毒(EV)RT-PCR检测。结果 70例有发热、口腔黏膜疹、手足皮疹的患儿粪便中EV病毒全阳性,EV71病毒阳性25例占35.71%,Cox A16病毒阳性22例占31.43%,二者均阳性的10例占14.29%,30例体检儿童粪便中EV病毒阳性5例,EV71和Cox A16全阴性。结论手足口病以EV71和Cox A16病原体感染为主,检测EV71和Cox A16病原体可以早期诊断手足口病,对预防和治疗手足口病具有重要临床意义。     

实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

目的通过对2010年4～8月北京市怀柔区手足口病病原学监测数据的分析,了解北京市怀柔区手足口病流行趋势,为该地区手足口病防治提供科学依据,同时探讨实时荧光RT-PCR在检测手足口病毒核酸中的应用价值。方法采集2010年4～8月怀柔区疑似肠道病毒感染者咽拭子和疱疹液标本,用实时荧光RT-PCR方法对人肠道病毒(包括EV71、CoXA16)进行核酸检测。结果 2010年4～8月共采集121例标本,检出肠道病毒EV71型87例,CoXA16型19例,肠道病毒通用型6例,阴性9例。结论 2010年4～8月怀柔区手足口病毒以肠道病毒EV71型为主。实时荧光RT-PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的,该方法对手足口病的治疗及疫情的有效控制提供有力的病原学支持。     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型实验室检测研究进展

肠道病毒71型（Enterovirus,EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus,CoxA 16）是引起手足口病的主要病原体,因此,快速准确地检测这2种病原体对于手足口病治疗和控制有着至关重要的作用。该文介绍了这2种病原体实验室检测技术的研究进展,主要包括病毒分离培养、血清学检测、分子生物学方法包括RT—PCR法、实时荧光RT—PCR法等。     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型抗体筛查在手足口病中的应用及相关性

目的 探讨肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)抗体筛查在手足口病中的应用及相关性.方法 采用酶联免疫吸附法对确诊的281例手足口病患儿进行血清EV71-IgM抗体和CA16-IgM抗体检测.结果 EV71-IgM抗体阳性144例(51.2％,144/281),CA16-IgM抗体阳性90例(32.0％,90/281),EV71-IgM和CA16-IgM双阳性17例(6.0％,17/281),即抗体阳性确切例数为217例,抗体阳性率为77.2％(217/281).EV71-IgM抗体阳性率与CA16-IgM抗体阳性率比较差异有统计学意义(x2=21.35,P＜0.01),总体男性与女性抗体阳性率[95.1％(135/142)比71.2％(99/139)]比较差异有统计学意义(x2=8.22,P＜0.01).结论 早期进行EV71-IgM和CA16-IgM抗体联合检测,对临床诊断手足口病及监控治疗具有重要意义.     

北京地区柯萨奇病毒A组6型、肠道病毒EV71型和柯萨奇病毒A组16型手足口病流行特征及临床特点比较

目的 了解柯萨奇病毒A组6型、肠道病毒71型和柯萨奇A组16型手足口病流行特征、临床特点,为指导临床诊断,调整手足口病防控策略提供科学依据.方法 采用前瞻性调查的方法,采集2013年8月至2015年9月在北京市儿童医院诊断的手足口病临床确诊病例的咽拭子,将手足口病原核酸检测阳性的病例分为CA6、EV71、CA16 3组,分析比较3组的临床特点、流行特征、预后及影响因素.结果 共采集HFMD临床诊断病例574例患儿咽拭子,CA6入组122例,EV71入组107例,CA16入组124例.①3组年龄、性别分布一致,差异无统计学意义.②不同年份流行主要毒株不同,但3种病原体引起的手足口病高峰均在夏季.③CA6组发热比例高达78.69％,明显高于EV71组(35.51％)和CA16组(37.90％) (P ＜0.001),平均体温约为38.78℃.CA6组表现大疱疹(9.01％)、结痂(8.20％)、皮疹部位疼痛(29.51％)、恢复期脱皮(38.52％)、脱甲(35.25％)、色素沉着(11.47％)比例高于EV71组、CA16(P ＜0.001).④3组在卫生学指标方面差异无统计学意义.结论 CA6、EV71和CA16感染所致的HFMD发病高峰季节一致;与EV71、CA16感染相比,CA6感染引起的高热比例较高,部分病例可表现为大疱疹,疼痛、脱皮、脱甲、色素沉着、结痂发生率高,预后较好.     

EV71和CoxA16型肠道病毒RT-PCR检测方法的研究

目的建立咽拭子标本中EV71和Cox A16型肠道病毒逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。方法根据GENBANK数据库中EV71和Cox A16型肠道病毒的基因序列,利用CLUSTAL软件进行序列比对分析,选择基因组的保守序列,并借助引物设计生物信息学软件,设计筛选出一套针对EV71和Cox A16型肠道病毒的RT-PCR扩增的引物。从特异性、最低检测限、重复性等方面进行评估,建立了EV71和Cox A16型肠道病毒RT-PCR检测方法。结果RT-PCR方法对EV71和COXA16病毒的最低检测量分别为63 TCID50/ml和32 TCID50/ml。其他病原微生物及人类基因组在该系统无反应信号,显示方法特异性良好。结论RT-PCR对手足口病病原体检测准确性高、特异性强,具有快速、经济等特点,适合手足口病的早期诊断。     

北京市入托体检健康儿童肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型感染状况及就诊行为调查

目的 了解北京市入托儿童肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)感染状况及其相关的就诊率,为估算手足口病疾病负担参考。方法 2013年8月20－31日对北京市东城区、朝阳区和怀柔区进行入托体检的健康儿童开展血清学调查,采用ELISA方法检测血清中EV71和Cox A16的IgG和IgM抗体。结果 共调查813名儿童,平均年龄为(3.5±1.0)岁。Cox A16 IgG阳性率为61.9%,IgM阳性率为4.4%;EV71 IgG阳性率为9.3%,IgM阳性率为1.1%;各种抗体阳性率在不同性别中的分布差异无统计学意义(P>0.05),在不同年龄组中的分布差异有统计学意义(P<0.05)。Cox A16抗体阳性者中7.8%有皮疹,EV71抗体阳性者中10.7%有皮疹。Cox A16或EV71抗体阳性者中,仅7.1%在父母陪伴下到医院就诊,而有皮疹的抗体阳性病例中,80.5%去医院就诊。结论 北京市健康入托儿童中,既往感染Cox A16的比例较大,EV71抗体阳性率明显低于Cox A16,提示托幼儿童对EV71普遍易感,应是手足口病防控重点人群。     

实时荧光定量RT-PCR技术在手足口病疫情监测中的应用

[目的]对手足口病患者标本进行病毒核酸检测,探讨实时荧光定量RT-PCR方法在手足口病疫情监测中的意义。[方法]采用实时荧光定量RT-PCR方法对2010年3～8月连云港市采集的307份手足口病患者标本进行肠道病毒核酸检测,并对肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行分型。[结果]307份手足口病患者标本中有221份肠道病毒核酸阳性,阳性率71.99%,其中EV71型病毒核酸阳性标本123份,阳性率40.07%,CVA16型病毒核酸阳性标本66份,阳性率21.50%。[结论]实时荧光定量RT-PCR方法耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为手足口病疫情监测的诊断方法。     

深圳市龙岗区2017年手足口病病原柯萨奇病毒A16型及肠道病毒71型VP1区基因特征分析

目的 了解2017年深圳市龙岗区柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)及肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)的分子特征,为制定本区手足口病的防控策略提供科学依据。方法 对2017年辖区哨点医院收集的CVA16及EV71核酸阳性样本的病毒VP1区基因进行扩增,产物回收并测序,用DNASTAR软件分析不同序列的核苷酸及氨基酸同源性,应用MEGA 6.0软件,以最大似然法(maximum likelihood method)构建系统进化树,进行分子特征分析。结果 2017年深圳市龙岗区共报告手足口病13 443例,发病率为304.83/10万。测序获得26份EV71及27份CVA16的VP1基因序列,基因特征分析显示龙岗区EV71序列均属C4a亚型,可分为3个进化分支。龙岗区CVA16可分为本地流行主分支B1b基因亚型和东南亚流行次分支B1a基因亚型。结论 2017年间,龙岗区CVA16与EV71病原存在多个进化分支,需及时对病原的基因型数据进行更新。     

柯萨奇病毒A组16型手足口病疫苗研究现况

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)严重影响着婴幼儿健康。肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV71)及柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)是引起手足口病的主要病原体,曾在全球多个国家或地区暴发,接种疫苗是预防手足口病的有效途径,EV71疫苗已上市,但是CA16疫苗相关研发进展较缓慢,目前仍无相关疫苗上市。本文对CA16型灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗、DNA疫苗、重组嵌合病毒疫苗及亚单位疫苗的相关研究进展做一综述。     

一步法三重荧光PCR检测手足口病病毒方法的建立及其运用

目的 建立一种三重荧光PCR检测手足口相关病毒的方法,并对收集的样本进行检测.方法 分别用普通PCR和单荧光PCR进行引物探针的测试,然后将确定的引物和探针混合进行三重荧光PCR测试和标本的检测.结果 建立了一种三重荧光PCR方法,利用该方法对94份标本进行检测,其中肠道病毒71型(EV71) 37.23％,科萨奇病毒A16(COX A16) 35.11％,其他肠道病毒4.26％.结论 本研究建立的三重荧光PCR可以特异地检测出引起手足口病的EV71和COX A16以及其他肠道病毒.     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型细胞受体的研究进展

近几年手足口病在亚太地区的流行大幅上升并伴随严重的中枢神经系统并发症,而针对其主要致病原肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型现在还缺乏有效的预防疫苗和抗病毒制剂.确定它们的特异性细胞受体对于进一步阐明病毒与宿主细胞早期互相作用的分子机制及其致病机制至关重要.过去一年中,P-选择素糖蛋白配体-1、B类清道夫受体Ⅱ和唾液酸化...     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型细胞受体的研究进展

近几年手足口病在亚太地区的流行大幅上升并伴随严重的中枢神经系统并发症,而针对其主要致病原肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型现在还缺乏有效的预防疫苗和抗病毒制剂.确定它们的特异性细胞受体对于进一步阐明病毒与宿主细胞早期互相作用的分子机制及其致病机制至关重要.过去一年中,P-选择素糖蛋白配体-1、B类清道夫受体Ⅱ和唾液酸化多聚糖类被分别发现和确定为肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的功能性细胞受体.此文讨论了相关的实验结果并展望了未来值得探索和应用的方向.     

实时荧光定量PCR检测EV71肠道病毒在不同类型样本中检测率的分析

目的 探讨肠道病毒71型(EV 71)检测方法和样本收集对检测结果的影响.方法 采集疑拟患者鼻咽拭子和大便样本,应用实时荧光定量PCR方法检测.结果 结果EV71型肠道病毒大便检出率为46.2％,鼻咽拭子为5.61％,大便的检出率明显高于鼻咽拭子；差异有统计学意义(x2=61.51＞x20.01.1,P＜0.01).结论 对HFMD的诊断建议首选采集粪便标本,应用实时荧光定量PCR方法进行检测,可减少漏诊率,提高灵敏度.     

手足口病患儿EV71的检测与其临床分析

目的了解仙居县2008年6月-2009年6月儿童手足口病病例不同标本中肠道病毒EV71和CoxA16的感染情况,为手足口病的治疗和预防控制提供依据。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及实时荧光RT-PCR方法,对145例疑似手足口病的咽拭子、疱疹液及脑脊液标本进行手足口致病病毒进行检测,全部取咽拭子145份,49份同时取疱疹液,47份同时取脑脊液,进行EV、EV7I和CoxA16的检测,最后对重症病例的病毒核酸测序,并进行基因分型。结果 145份疑似样品中,39份为肠道通用病毒阳性,其中21份样品EV71阳性,6份样品CoxA16阳性;咽拭子、疱疹液、脑脊液的检出率分别为28.6%、28.6%、12.8%;3例重症病例均只检出肠道病毒EV71,阳性率为100.0%。结论采用咽拭子及其疱疹液标本检出率比较,差异无统计学意义,且阳性检出率高于脑脊液标本,仙居县肠道病毒夏季高发,感染以EV71和CoxA16为主,手足口病重症感染病毒为EV71的C4亚型。     

六个县母婴肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型中和抗体水平调查

目的了解新生儿和新生儿母亲的肠道病毒71型(Enterovirus Type71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus Group AType16,CVAl6)中和抗体(Neutralizing Antibody,NA)水平。方法选取广西壮族自治区和江苏省的3个手足口病(Hand,Footand Mouth Disease;HFMD)高发县和3个低发县作为研究现场,在每个县选取一个HFMD高发乡和一个低发乡,每个乡选择10对新生儿及新生儿母亲,对所有调查对象采集静脉血,并对新生儿母亲进行问卷调查。结果母亲EV71和CVA16的NA阳性率和几何平均滴度(Geometric Mean Titer,GMT)分别为83.5%、33.1%和1∶26.61、1∶6.1l,新生儿EV7l和CVA16的NA阳性率和GMT分别为75.2%、35.5%和1∶22.05、1∶6.97,母婴EV71、CVA16的NA阳性率及GMT差异均无统计学意义(2EV71=2.52,P=0.1124;2CVA16=0.1650,P=0.6846;tEV7l=1.05,P=0.2953;tCVA16=1.30,P=0.1946)。EV71、CVA16的NA阳性率和GMT在HFMD高、低发县差异亦无统计学意义(2EV71=1.45,P=0.2288;2CVA16=1.28,P=0.2583;tEV7l=1.86,P=0.0643;tCVA16=0.2,P=0.8399)。母婴EV71和CVA16的NAGMT均存在相关性(rEV71=0.69,P<0.0001;rCVA16=0.4769,P<0.0001)。结论母亲EV71和CVA16的NA阳性率和GMT高,新生儿EV71和CVA16的NA相应也高,可为新生儿提供有效保护。     

逆转录-荧光实时定量PCR法快速测定肠道病毒71型病毒滴度

目的 建立一种肠道病毒71型(EV71)病毒滴度快速测定法.方法 以TCID50法测定的EV71病毒样品作为滴度检测参考品,建立EV71病毒滴度的逆转录-荧光实时定量PCR测定方法.通过滴度参考品和待测病毒样品的Ct值计算待测样品中的病毒滴度,并对该检测法进行特异性、重复性验证.结果 所得检测方法可以用于EV71病毒滴度的快速检测.本测定法具有较好的线性,线性范围为lgTCID50 2.61～8.61,相关系数R2为0.9881;特异性和重复性较好,与TCID50法检测之间具有较好的一致性,变异系数(CV)＜5％.结论 所建立的逆转录-荧光实时定量PCR法线性范围广,具有较好的重复性和特异性,可用于EV71样品病毒滴度的快速测定.