Angiostatin K(1-3)基因的原核表达和活性鉴定

将入ＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）基因在原核细胞表达并鉴定其活性。构建和鉴定ＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）原核表达载体并在大脾性杆菌ＤＨ５α内表达,诱导表达蛋白用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定,采用人脐带静脉内皮细胞抑制实验和鸡胚绒毛膜尿囊膜试验验证其活性。ＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）功能区基因在原核细胞获得成功表达,目的蛋白牛菌全总蛋白１５．７％。该表达蛋白捅抑     

在大肠杆菌中以非融合蛋白形式高效表达丙型肝炎核心蛋白

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出完整的丙型肝炎病毒核心蛋白基因，将其克隆于表达载体ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子的下游，构建了重组质粒ｐＢＶ－ＨＣＶ；转化大肠杆菌后，以非融合蛋白方式表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示，此蛋白的分子量约为２０ｋＤａ，表达量约占菌体蛋白的１１％；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验证明，此蛋白能与慢性丙型肝炎患者血清发生特异反应。序列分析结果表明，克隆于ｐＢＶ     

人睫状神经营养因子的原核表达及其初步纯化

目的：优化条件实现人睫状神经营养因子（ｈｕｍａｎｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ｈＣＮＴＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌中的高效表达。方法：ＣＮＴＦ克隆进ｐＢＶ２２０后,表达,凝胶过滤纯化,１０日龄鸡背根神经节（Ｅ１０ＤＲＧｓ）测定其生物活性。结果：ＣＮＴＦ在ＨＢ１０１中高效表达,并具有生物活性。结论：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ观察到相对分子质量约为２４×１０３的预期表达产物,优化表达条件后发现其在ＨＢ１０１中的表达状况最好,用凝胶过滤纯化的重组蛋白能促进Ｅ１０ＤＲＧｓ的生长     

DNA错配修复基因MutS的克隆和表达

目的：克隆ＭｕｔＳ基因并构建高效表达菌株，为建立ＤＮＡ错配突变检测系统和应用于临床肿瘤的检测等打下重要的基础。方法与结果：通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组中扩增得到ＭｕｔＳ基因（２．６ｋｂ），克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，构建了重组质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ／ＭｕｔＳ，核酸序列分析表明所克隆的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ的ＭｕｔＳ一致。然后亚克隆到原核表达载体ｐＢＶ２２０上，构建了重组菌株ＤＨ５α／ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ，４２℃热诱导表达ＭｕｔＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在相对分子质量９７×１０３左右处出现一条表达量高达３０％以上的表达蛋白带，而对照菌株表达量很低。将重组质粒ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ转化到ＭｕｔＳ缺陷菌株ＥＳ１３０１互补了该菌株ＭｕｔＳ的缺陷，使其链霉素、利福平抗性（Ｓｔｒｒ，Ｒｉｆｒ）的突变频率分别降低９９％、９６％。结论：克隆得到ＭｕｔＳ基因并在大肠杆菌中得到高效表达，表达的ＭｕｔＳ蛋白在菌体内具有生物学功能     

丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的原核表达载体,并在大肠杆菌ＪＭ１０９中表达可溶性的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ。以重组的ＨＣＶ核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经ＮｃｏⅠ／Ｎｏｔ Ⅰ酶切鉴定,该ＳｃＦｖ基因由７５０ｂｐ组成。将其亚克隆到ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ表达载体中,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,提取质粒进行ＤＮＡ序列测定,符合ＳｃＦｖ的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。ＩＰＴＧ诱导转化的大肠杆菌ＪＭ１０９,在其培养上清中获得了可溶性ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ的表达。酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）证实表达的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡ     

人白细胞介素15基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：分离编码人ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ并大肠杆菌中克隆与表达，方法：采用ＰＨＡ刺激人外周血白细胞提取ｍＲＮＡ，并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法获得ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ将其定向插入ＰＵＣ１９载体中，ＤＮＡ序列分析表明分离的ｈＩＬ－１５的序列与文献报道一致，以ｐＢＶ２２０为表达载体构建并筛选出重组于ｐＢＶｈＩＬ－１５；重组子转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株，经４２℃诱导表达。结果：相对分子质量为１４０００的ｈＩＬ     

我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达

目的：通过对登革病毒ＮＳ１基因的表达,研究表达的ＮＳ１蛋白的抗原性,为研制新型登革疫苗提供依据。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术将扩增的ＮＳ１基因插入到ｐＢＶ２２０载体中,通过温控诱导进行外源蛋白的表达,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果：获得正向插入的ＮＳ１－ｐＢＶ２２０重组质普,表达产物的相对分子质量约为５１０００,与预期大小一致,并且可与登革２型     

白细胞介素12真核表达载体对DNA疫苗诱导免疫应答的影响

目的 观察白细胞介素１２真核表达载体（ｐＷＲＧ３１６９）对ＨＢＶ－ＳＤＮＡ疫苗（ｐＣＲ３．１－Ｓ）诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠（Ｈ－２ｄ）的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞（Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ）成瘤性的影响。方法 肌肉注射ＤＮＡ疫苗主白细胞介素１２真核表达载体,背部皮下接种Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ细胞,观察成瘤情况,４ｈ＾５１Ｃｒ释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ活性。结果：对     

HLA—DR基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

获得表达ＨＬＡ－ＤＲ基因的小鼠墨色素瘤细胞，方法应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人Ｂ淋巴瘤细胞Ｒａｊｉ中克隆了ＨＬＡ－ＤＲ３α和β链ｃＤＮＡ，并经测序证实。将其分别插入至真核表达载体ｐＬＸＳＮ和ｐＣＥＰ４中，用脂质体转上鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，然后用Ｇ４１８和Ｈｙｇ双重筛选。     

抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体融合蛋白分子的构建

为构建带有碱性磷酸酶活性的双功能基因工程抗体,我们将已克隆的大肠杆菌碱性磷酸酶基因重组到抗ＨＢｓＡｇ Ｆａｂ段的Ｆｄ羧基端,构建了重组融合蛋白表达载体ｐＨＢＦＡＰ,转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,采用ＥＬＩＳＡ法检测到培养上清中存在与ＨＢｓＡｇ的结合活性和碱性磷酸酶的催化活性,显示抗ＨＢｓＡｇ－碱性磷酸酶双功能抗体分子在大肠杆菌中获得了表达。     

大鼠白蛋白基因片段的克隆及其mRNA半定量检测方法的建立

白蛋白mRNA已被证实是反映白蛋白合成变化的重要指标。实验探讨大鼠白蛋白基因片段的克隆及白蛋白mRNA半定量检测方法的建立。使用一步法逆转录聚合酶链反应扩增的白蛋白cDNA片断 ,连接入pGEM T载体中 ,经ABIPRISM 3 77型全自动核苷酸分析仪检测。同时用不同浓度的内毒素处理肝细胞后检测其白蛋白mRNA的表达。扩增的基因片段经DNA序列分析 ,证实其由40 1个碱基组成。同时发现 ,内毒素可以抑制白蛋白mRNA的表达 ,且抑制作用与内毒素的剂量相关。提示 ,大鼠白蛋白基因片段的成功克隆及稳定的白蛋白mRNA半定量检测方法的建立     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

MGr1-Ag表达上调及下调的胃癌细胞株的建立及鉴定

为研究胃癌细胞耐药相关新基因MGr1 Ag对胃癌耐药细胞多药耐药性的调节作用及其机制。克隆MGr1 Ag的全长cDNA并构建其正反义真核表达载体 ,以脂质体介导法将正、反义真核表达载体分别转染入人胃癌细胞系MGC80 3与人胃癌多药耐药细胞系SGC790 1/VCR中。结果显示 ,经RT PCR扩增出大小约为 1.0kb的基因片段 ,成功克隆入pUCm T载体 ,经DNA测序证实为MGr1 Ag基因。将其克隆入pCDNA3 .1/V5 His后 ,经限制性核酸内切酶酶切鉴定 ,获得携有MGr1 Ag基因真核表达载体pCD NA3 1/V5 His MGr1 Ag及其反义表达载体pCDNA3 .1/V5 His anMGr1 Ag。以脂质体介导法将MGr1 Ag的正、反义真核表达载体分别转染入MGC80 3与SGC790 1/VCR中 ,经Westernblot证实 ,成功建立了MGr1 Ag表达上调及下调的胃癌细胞株 ,为研究MGr1 Ag参与耐药的分子机制奠定了基础     

辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN的构建及其体外抗肿瘤作用的研究

目的 克隆人野生型抑癌基因PTEN／MMAC1 cDNA序列、构建辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN并研究其体外稳定转染联合X-射线照射对恶性胶质瘤细胞SHG-44增殖的抑制作用。方法 利用RT—nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约1200bp的PTEN片段，并将其重组人pcDNA3．1-Egr载体中，构建为表达质粒pEgr-hPTEN，体外转染肿瘤细胞并经G418筛选稳定转染细胞株SHG-44-sPTEN，接受不同剂量X射线照射，观察基因-放射联合作用对肿瘤细胞生长的影响。结果 经全自动测序证明克隆得到了野生型PTEN基因；辐射诱导表达载体pEgr—hPTEN构建正确；稳定转染联合X-射线照射可明显抑制肿瘤细胞的恶性增殖，5Gy以内随吸收剂量的增加，肿瘤抑制作用更明显。结论 本研究成功克隆了人野生型抑癌基因PTEN／MMAC1 cDNA序列并构建了辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN，体外基因-放射联合治疗具有明显的肿瘤抑制作用。本研究为提高临床恶性肿瘤放疗疗效奠定了理论和实验基础。     

人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定

为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70（HSP70）的基因，以质粒为模板，采用PCR方法进行扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1.96kb的片段；回收片段经T－A克隆法克隆到pUCm-T载体上，并进行DNA测序；将目的基因片段从pUCm-T载体上酶切后，亚克隆到表达载体pET-21a( )上，将重组质粒pET-21a( )/HSP转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，收集细菌，菌体裂解后进行SDS－PAGE及Western blot检测。结果表明，应用PCR方法扩增出约1.96kb的目的片段，序列测定结果证实，扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70 cDNA序列一致；经EcoR I Xho I酶切及PCR鉴定证实，HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-21a( )上，转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，进行SDS－PAGE，发现在分子量为72000处有表达量明显增多的蛋白条带，Western blot证实其为目的的条带。表明在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70基因。     

东部马脑炎病毒E2基因的克隆与表达

目的 :克隆表达东部马脑炎病毒 (easternequineencephalomyelitisvirus ,EEEV)E2基因 ,研究重组蛋白的抗原性 ,为研制东部马脑炎病毒基因工程诊断试剂奠定基础。方法 :由病毒感染的鼠脑制备总RNA ,利用RT_PCR技术扩增EEEVE2基因全长序列 ,并将其克隆至pGEM_Teasy载体测序 ,再将E2基因克隆至谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体pGEX_5x_2中表达。采用免疫印迹试验 (Westernblotting)和ELISA法分析表达的重组蛋白的抗原性。结果 :经过RT_PCR扩增和测序 ,证明得到的E2基因片段的序列是正确的 ,并且在原核载体中得到表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白的 2 4 .5 % ,主要以包涵体形式存在。Western印迹分析表明GST_E2蛋白有良好的抗原性 ;包涵体经Tri tonX_10 0 ,1mol L和 2mol L尿素洗涤 ,初步纯化后 ,用表达的E2融合蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA法 ,结果表明与兔抗EEEV血清起特异反应 ,但与兔抗WEEV血清无交叉反应。结论 :东方马脑炎病毒的E2基因在大肠杆菌中得到稳定表达 ,表达的GST_E2蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,为从分子水平上对EEEVE2蛋白的功能性研究和发展EEEV基因工程诊断试剂奠定了基础     

人端粒酶反转录功能区基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

 目的表达并纯化出包含所有功能基序的端粒酶催化亚基(hTERT)融合蛋白,为深入研究端粒酶作用机制、制备抗hTERT抗体和肽库筛选以端粒酶为靶的小分子抑制剂奠定基础.方法自行设计引物,以pLPC-hTERT为模板扩增出包括端粒酶发挥反转录功能所需的全部8个基序长为1 310 bp的基因片段,将PCR扩增的此片段克隆至带有6个连续组氨酸标签的原核表达载体pET-32a中,IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE和Western-Blot(WB)检测确定表达出端粒酶反转录酶功能区融合蛋白,以8 M尿素溶解以包涵体形式存在的目的蛋白,用金属鳌合层析柱纯化融合蛋白并对之进行复性.结果经PCR、酶切、测序、SDS-PAGE和WB鉴定证实成功构建了表达质粒pET32a-hTERT,鉴定和测序结果亦证实包含全部8个基序的基因片段,凝胶电泳和WB确认表达出特异性的目的蛋白条带.结论成功构建pET32a-hTERT表达质粒,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得特异性的hTERT重组蛋白.     

HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体的构建及表达研究

目的 在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A基因.方法 以pcDNATM3.1/myc-HisA-HBeBP4A重组质粒作为模板,经RT-PCR扩增HBeBP4A基因,克隆到pGEM-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析.结果 成功扩增出HBeBP4A基因,测序结果符合GenBank报告序列.酶切回收的HBeBP4A基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7并转化入酵母细胞AH109中,Western blotting分析显示该基因在酵母细胞中表达,表达产物相对分子量为61.37kD.结论 成功构建了HBeBP4A酵母表达载体,并在酵母细胞中表达.     

外源性PTEN基因体外转染C6胶质母细胞瘤株及稳定表达蛋白产物的鉴定

目的 探讨外源性PTEN抑癌基因转染胶质母细胞瘤株并表达活性蛋白产物的可行性.方法 对获赠的包含有人PTENcDNA全长序列的PRK-PTEN质粒进行扩增和酶切鉴定后,用脂质体介导PRK-PTEN质粒转染大鼠C6胶质母细胞瘤株,荧光染色检测转染细胞中PRK-PTEN质粒携带的绿色蛋白荧光报告基因,免疫组化染色鉴定稳定转染后C6细胞中PTEN功能蛋白.结果 转染后的C6胶质母细胞瘤株稳定表达绿色荧光蛋白和PTEN功能蛋白.结论 PRK-PTEN质粒载体在脂质体的介导下可以将PTEN基因整合到C6胶质母细胞瘤的基因序列中去,并且通过宿主基因序列的表达稳定地产生PTEN功能蛋白,为以PTEN基因为靶点的胶质瘤基因治疗提供了实验理论依据.     

NK细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL1胞外区的表达及纯化

目的 表达并纯化NK细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL1胞外区.方法 以pUC57-KIR3DL1为模板,PCR扩增KIR3DL1胞外区序列,与pGEM-T载体进行A-T克隆;测序正确后,采用定向克隆的方法将KIR3DL11胞外区基因连接到pET28a-DsbA载体上,成功构建了pET28a-DsbA/KIR3DL1重组质粒.将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导DsbA-KIR3DL1融合蛋白表达,溶解于8mol/L尿素中的包涵体经Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,成功进行复性,再经Superdex 75凝胶层析柱进一步纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的 蛋白的表达及纯化.结果 表达产物呈部分可溶性表达,包涵体纯化后证实获得纯度95%以上的DsbA-KIR3DS1融合蛋白.结论 KIR3DL1胞外区的成功表达及纯化为进一步研究KIR3DL1与相应配体之间的相互作用奠定了基础.