穿孔素和颗粒酶B蛋白表达对胰腺移植急性排斥反应早期诊断的研究

目的 研究移植胰腺局部穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达对急性排斥反应的早期诊断和鉴别诊断的意义.方法 将40只四川当地杂种长白猪随机分为3组,即对照组(n=8)、移植组(n=16)、移植 免疫抑制剂治疗组(n=16).移植手术为同种异体经门静脉回流、肠内引流全胰十二指肠移植.免疫抑制剂治疗组在进行同种异体胰十二指肠移植术同时应用环孢A 骁悉 甲强龙三联免疫抑制治疗.分别于术前1 d和术后1、3、5、7 d检测受者的锁骨下静脉血胰岛素、胰高血糖素、血糖水平.术后1、3、5、7 d,开腹取胰腺组织进行常规病理学检查和免疫组化染色检测穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达.结果 ①对照组、移植组以及移植 免疫抑制剂组之间受者的血糖、胰岛素、胰高血糖素水平变化有统计学意义(P＜0.05).②胰腺移植 免疫抑制剂组与单纯胰腺移植组相比胰腺组织中穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达及穿孔素和颗粒酶B的阳性淋巴细胞计数的差异有统计学意义(P＜0.05).③免疫组化染色检测移植后胰腺组织中穿孔素和颗粒酶B蛋白表达,比常规病理学检查诊断排斥反应早2～4 d.结论 移植胰腺组织穿孔素和颗粒酶B局部蛋白表达变化早于常规病理学改变,结合常规病理学检查可以对胰腺急性排斥反应做出早期诊断和鉴别诊断.     

外周血穿孔素和颗粒酶B mRNA检测对胰腺移植急性排斥反应早期诊断的价值

目的 研究胰腺移植术后外周血穿孔素和颗粒酶B的基因表达对急性排斥反应早期诊断的价值.方法 实验动物为杂种长白猪,分为3组(n=8):对照组,移植组.免疫抑制剂治疗组.移植手术为同种异体门静脉回流、肠内引流全胰十二指肠移植.免疫抑制剂治疗组在行同种异体胰十二指肠移植的同时应用环孢A 骁悉 甲强龙三联免疫抑制治疗.分别于术前1 d和术后1、3、5、7 d采集受者锁骨下静脉血,抽提总RNA,RT.PCR方法检测静脉血淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶B的mRNA表达,检测受者血糖、胰岛素、胰高血糖素水平.在术后1、3、5、7d,开腹取胰腺组织进行常规病理学检查,与血液中穿孔素和颗粒酶B的mRNA表达水平进行比较分析.结果 ①对照组、移植组、免疫抑制剂组之间受体的血糖、胰岛素、胰高血糖素水平变化差异无统计学意义.②与移植组比较,免疫抑制剂组静脉血淋巴细胞中穿孔索和颗粒酶B的mRNA表达水平下降(P<0.05).③胰腺移植术后静脉血穿孔素、颗粒酶B mRNA表达变化比急性排斥反应病理学改变早2～d.结论 监测外周血淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶B mRNA表达的变化,可以对胰腺急性排斥反应做出早期诊断.     

穿孔素和颗粒酶B在移植排斥中的研究进展

穿孔素和颗粒酶B是由细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞胞质颗粒储存并分泌的一种糖蛋白,能介导效应细胞对靶细胞进行杀伤作用。穿孔素通过在靶细胞膜上形成活性孔道使靶细胞渗透压改变而溶解,或者与颗粒酶协同作用而诱导靶细胞凋亡。穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒性在调控免疫应答中起着重要作用,与病毒感染、肿瘤和移植排斥反应等疾病密切相关。本文就穿孔素和颗粒酶B在移植方面的研究进展进行综述。     

可溶性组织相容白细胞抗原诱导自然杀伤细胞和T细胞耐受作用的研究

目的探讨可溶性组织相容性白细胞抗原(HLA—G1)对自然杀伤细胞(NK)、T细胞的致耐作用。方法借助基因工程技术构建表达可溶性HLA-G1的真核表达质粒;把重组质粒转染入宿主细胞LcL721．221,表达可溶性HLA—G1并借助免疫亲和层析技术纯化可溶性HLA-G1蛋白;探讨可溶性HLA-G1分子对NK细胞杀伤活性的影响,对混合淋巴细胞培养中T细胞增殖的影响,对活化T细胞凋亡的影响。结果可溶性HLA—G1能够有效抑制NK细胞的杀伤活性;能够抑制混合淋巴细胞培养中T细胞的增殖;能够促进活化T细胞发生凋亡。可溶性HLA—G1对NK、T细胞的上述作用无HLA限制性。结论可溶性HLA—G1为一种免疫致耐分子。     

外周血淋巴细胞穿孔素、颗粒酶B在大鼠肾移植急性排斥的表达及意义

目的:探讨大鼠同种异体肾移植外周血淋巴细胞(peripheralbloodlymphocyte,PBL)穿孔素、颗粒酶B的表达与急性排斥反应(acuterejection,AR)的关系。方法:实验组:异基因移植组(SD→Wister),对照组:同基因移植组(Wister→Wister)。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测移植肾和PBL穿孔素、颗粒酶B的表达,并以同基因肾移植为对照。结果:病理学检查结果显示实验组大鼠在术后第5、7、9、11天分别发生轻、中、重度排斥,对照组无明显排斥现象。RT-PCR结果显示急性排斥反应发生在肾移植术后3天,即急性排斥早期均表达穿孔素、颗粒酶B基因mRNA,4天后表达明显增强,并贯穿整个排斥反应全过程,而同基因对照组术后11天内均不表达两基因。外周血和肾组织中穿孔素、颗粒酶BmRNA的表达水平平均在急性排斥反应发生前3￣5天开始明显上升,其变化趋势早于血清肌酐。结论:穿孔素、颗粒酶B是一种有价值的AR标志物。定量RT-PCR测定外周血淋巴细胞中穿孔素、颗粒酶BmRNA表达可以较敏感预测肾移植急性排斥反应的发生,这一非侵入性检查方法可以为急性排斥反应的监测和诊断提供客观依据。     

单抗原免疫微珠法在人组织相容性抗原反应抗体检测中的局限性及影响因素分析

人组织相容性抗原反应抗体（human leukocyte antigen-antibody,HLA-Ab）的检测已成为诊断及检测肾移植术后排斥反应的重要指标。单抗原免疫微珠法（single antigen beads,SAB）是一种灵敏度高、特异性强的HLA-Ab检测方法。然而,SAB检测结果的分析和解释较为复杂,需要综合考虑多方面的影响因素。本文将讨论使用此方法对HLA-Ab进行检测时的局限性、影响因素及解决办法。希望可以通过对上述问题的探讨来进一步完善SAB检测结果的解读与应用。     

可溶性HLA-G1抑制人自然杀伤细胞NK92 对猪内皮细胞PED的黏附

目的 研究可溶性HLA-G1(HLA-G5)对人自然杀伤细胞(NK细胞)黏附到猪血管内皮细胞(PED)的抑制作用,从而降低人NK细胞对猪血管内皮细胞杀伤杀伤活性.方法 利用核转染技术将pcDNA3-HLA-G5转入LCL721.221细胞株.以RT-PCR、Dot-ELISA技术分别在基因水平和蛋白水平检测HLA-G5的表达;以人类NK细胞系(NK92)效应细胞,猪内皮细胞系(PED)为靶细胞,检测NK92在静止和流动状态下对PED的黏附作用;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HLA-G5抑制NK细胞的杀伤活性.结果 与未加入HLA-G5的对照组相比,NK92在静止和流动状态下对PED的黏附功能明显降低(P＜0.01),且对HLA-G5组PED的杀伤效率均有明显下降(P＜0.01).结论 HLA-G5可以通过抑制NK92对PED的黏附功能,来减轻NK92对PED的杀伤作用.     

移植物抗宿主病中次要组织相容性抗原作用的研究

移植物抗宿主病(GVHD)是异基因造血干细胞移植(HSCT)的主要并发症之一。近年的临床研究表明,GVHD与次要组织相容性抗原(mHAgs)有重要关系。本文综述mHAgs及其相关的研究进展。     

猪-人异种移植超急性排斥反应中IL-1质量浓度的变化

为了探讨在猪 人异种移植超急性排斥反应中的细胞毒作用及细胞因子白细胞介素 1 (IL 1 )的变化 ,用体外培养的猪血管内皮细胞和人血清共同反应 ,建立猪 人异种移植超急性排斥反应的体外实验模型 ,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法观察补体依赖的细胞毒作用 ,换算出内皮细胞溶解率 ,将其作为评定血管内皮细胞激活和损伤的标志 ;采用ELISA法检测上清液中IL 1 β。结果 :1 )在相同时间点上 ,正常人血清组 (HS组 )的细胞溶解率明显高于对照组 ,与其他各组比较无明显差异 ;随着时间的延长 ,HS组内皮细胞溶解率逐渐增高 ,于 3～ 4h接近高峰。 2 )反应 0 .5h后 ,正常人血清组IL 1 β的质量浓度明显高于对照组 (P <0 .0 1 ) ;灭活人血清组、C1q缺乏组与对照组组间比较无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;随着时间的延长 ,HS组IL 1 β质量浓度继续升高 (P <0 .0 1 ) ,3～ 4h保持稳定。IL 1的变化过程与内皮细胞溶解率的变化趋势基本一致。结果提示 :在猪 人异种移植中 ,血管内皮细胞激活及IL 1的变化与超急性排斥反应的发生有一定的关系     

可溶性sHLA-G在子痫前期患者与正常晚孕妇女血中的表达

目的探讨可溶性白细胞抗原G（sHLA-G）在子痫前期发病中的意义。方法采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定45例子痫前期患者,49例正常足月妊娠者外周静脉血及靠近胎盘部位处脐静脉血中可溶性（sHLA-G）水平。结果子痫前期组外周血sHLA-G浓度为（6.61±2.51）μg/L,正常组外周血sHLA-G浓度（22.03±3.12）μg/L,两组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;子痫前期组脐静脉血sHLA-G浓度为（7.23±2.12）μg/L,正常组脐静脉血sHLA-G浓度（25.21±3.70）μg/L,差异有统计学意义（P〈0.05）;子痫前期组外周血sHLA-G浓度为（6.61±2.51）μg/L,脐静脉血sHLA-G浓度为（7.23±2.12）μg/L,差异无统计学意义（P〉0.05）;正常组外周血sHLA-G浓度（22.03±3.12）μg/L,脐静脉血sHLA-G浓度（25.21±3.70）μg/L,两组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论妊娠妇女血中sHLA-G水平的下降可能导致子痫前期的发病,血中sHLA-G主要来源于胎盘组织。     

NK细胞、HLA-G、和HLA-DRB1等位基因在子痫前期发病机制中的作用研究

目的:研究子痫前期患者发病机制中相关的免疫学变化及基因背景。方法:SAP法检测血液中NK细胞数量。MTT珐检测NK细胞增殖能力。51Cr释放法测定NK细胞杀伤活性。免疫组化法检测胎盘蜕膜浸润的NK细胞数量及HLA-G蛋白表达水平。RT-PCR和real time PCR法检测胎盘蜕膜组织HLA-G mRNA。PCR-SSP法检测两组HLA-DRB1等位基因频率,并分析母/儿间所携带某些HLA-DRB1等位基因配伍的频率。结果:①子痫前期患者外周血及其新生儿脐血NK细胞数均显著高于正常晚孕者及其新生儿。②子痫前期患者外周血及其新生儿脐血NK细胞增殖活性及杀伤活性均明显高于正常晚孕组(P<0.05)。③轻度与重度子痫前期组胎盘蜕膜NK细胞均多于正常晚孕组,但仅重度子痫前期组蜕膜NK细胞数量增加有统计学意义(P<0.05)。④轻度子痫前期组、重度子痫前期组和正常晚孕组之间HLA-G mRNA水平两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。⑤轻度子痫前期组HLA-G蛋白表达水平与正常晚孕组无显著性差异,重度子痫前期组胎盘HLA-G蛋白表达水平较正常晚孕组显著降低(P<0.05)。⑥两组孕妇和新生儿均检出13个HLA-DRB1等位基因,各等位基因频率在两组间均无明显差异。子痫前期组母不携带HLA-DRB1*04基因/儿携带DRB1*04基因、均不携带HLA-DRB1*14基因的频率显著高于正常晚孕组(P<0.05);母/儿均不携带HLA-DRB1*10基因、均携带HLA-DRB1*14的频率显著低于正常晚孕组(P<0.05)。结论:①先兆子痫患者外周血、脐血及蜕膜的NK细胞数量增多,活性增强,在妊娠过程中影响母胎免疫耐受。②母婴所携带的某些HLA-DRB1基因配伍与子痫前期易感性或抗性相关;父源性HLA-DRB1*04基因与子痫前期易感性相关。     

Microwave-induced Apoptosis and Cytotoxicity of NK Cells through ERK1/2 Signaling

Objective To investigate microwave-induced morphological and functional injury of natural killer (NK)cells and uncover their mechanisms.Methods NK-92 cells were exposed to 10, 30, and 50 mW/cm2 microwaves for 5 min. Ultrastructural changes, cellular apoptosis and cell cycle regulation were detected at 1 h and 24 h after exposure.Cytotoxic activity was assayed at 1 h after exposure, while perforin and NKG2D expression were detected at 1 h, 6 h, and 12 h after exposure. To clarify the mechanisms, phosphorylated ERK (p-ERK) was detected at 1 h after exposure. Moreover, microwave-induced cellular apoptosis and cell cycle regulation were analyzed after blockade of ERK signaling by using U0126.Results Microwave-induced morphological and ultrastructural injury, dose-dependent apoptosis (P < 0.001) and cell cycle arrest (P < 0.001) were detected at 1 h after microwave exposure. Moreover,significant apoptosis was still detected at 24 h after 50 mW/cm2 microwave exposure (P < 0.01). In the 30 mW/cm2 microwave exposure model, microwaves impaired the cytotoxic activity of NK-92 cells at 1 h and down regulated perforin protein both at 1 h and 6 h after exposure (P < 0.05). Furthermore, p-ERK was down regulated at 1 h after exposure (P < 0.05), while ERK blockade significantly promoted microwave-induced apoptosis (P < 0.05) and downregulation of perforin (P < 0.01). Conclusion Microwave dose-dependently induced morphological and functional injury in NK-92 cells,possibly through ERK-mediated regulation of apoptosis and perforin expression.     

沙棘油抗肿瘤作用及对小鼠NK和单核-巨噬细胞活性的影响

目的研究沙棘油的抗肿瘤作用及对小鼠NK细胞活性、单核-巨噬细胞吞噬功能的影响。方法第一组昆明种雌性健康小鼠136只,进行动物移植性肿瘤抑制实验。第二组选用108只BalB/c雌性健康小鼠进行免疫指标测定,其中48只进行NK细胞活性测定;另外60只小鼠作腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。两组均经口给予小鼠(1g/kg体重/d;0.33g/kg体重/d;0.033g/kg体重/日;0g/kg)沙棘油。结果给予小鼠1g/kg体重/日的沙棘油30d(接种肿瘤细胞前后均给予受试物),可对荷瘤小鼠S-180肿瘤的生长有抑制作用(P0.05),在0.33g/kg体重/日、1g/kg体重/日剂量组可明显增强小鼠NK细胞活性(P0.01),1g/kg体重/日剂量组能显著提高小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能(P0.01)。结论沙棘油具有抑制小鼠S-180肿瘤的作用、明显增强小鼠NK细胞活性、能显著提高小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能。     

小鼠肝脏内自然杀伤细胞功能和数量与鼠龄变化的关系

目的研究不同鼠龄小鼠肝脏内自然杀伤细胞的功能和数量变化的规律。方法应用4小时51Cr释放法测定2周龄、8周龄小鼠(CL57BL/6)肝脏和脾脏内NK细胞的杀伤活性;应用流式细胞仪测定2周龄、8周龄小鼠肝脏和脾脏内NK细胞的百分率和数量,测定NK细胞表面CD69,M ac-1和Ly49C/I的表达水平;应用RT-PCR法测定肝脏单核细胞内穿孔素的表达强度。结果2周龄和8周龄小鼠肝脏内NK细胞占全部淋巴细胞的百分比大致相同(11.9%±1.7%vs 9.9%±1.6%,P>0.05),但是单位质量肝脏内所含的NK细胞数在2周龄鼠明显多于8周龄鼠[(11.6±2.5)×105/g vs(3.4±0.8)×105/g,P<0.05]。2周龄小鼠肝内NK细胞具有极强的细胞杀伤活性(71.0%±5.5%vs 23.8%±4.4%,P<0.05)。2周龄小鼠肝内NK细胞表型主要是CD69增高M ac-1、Ly49C/I减低,而8周龄鼠肝内NK细胞主要是CD69减低,M ac-1、Ly49C/I增高。2周龄小鼠肝脏单核细胞内高度表达穿孔素。结论2周龄小鼠肝内NK细胞具有极强的杀伤能力和特殊的表型。这提示幼龄期鼠肝脏具有特殊的微环境以及肝脏内NK细胞特殊的发育方式。     

细胞接触对NK细胞及DC间免疫调节的影响

目的探讨自然杀伤细胞(NK)促进树突状细胞(DC)成熟及诱导细胞因子产生的作用,及是否依赖于细胞接触。方法体外培养NK及未成熟DC,并按1∶5、1∶1、5∶1的比例进行接触与非接触式共培养,抗CD86-FITC标记抗体流式细胞术分析DC的CD86表达水平,酶联免疫吸附法检测培养液中TNF-α、IL-12p40含量。结果随着NK/DC比例的升高,表达CD86+DC增多,而DC分泌的TNF-α、IL-12p40呈指数量降低,非接触共培养使DC表达CD86及分泌TNF-α、IL-12p40明显降低。结论NK具有促进DC成熟的作用,并能调节DC细胞因子的分泌,这种免疫调节作用依赖于细胞间接触。     

阻断Kupffer细胞IRE1-XBP1通路对大鼠肝移植排斥反应的影响

目的 探讨阻断Kupffer细胞IRE-XBP1通路对大鼠原位肝移植排斥反应的作用.方法 术前用GdCl3处理或未处理建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,未处理大鼠随机数字法分为XBP1-shRNA组(A组),Scrambled-shRNA组(B组),PBS组(C组);处理大鼠随机分为GdCl3+XBP1-shRNA组(D组),GdCl3+Scrambled-shRNA组(E组),GdCl3+PBS组(F组).未处理组术后检测血清ALT、AST、IFN-γ、IL-10、IL-17的表达水平;RT-PCR检测T-bet、RORγt、IFN-γ、IL-17及IL-10mRNA水平;Western blot检测CD86、CD206、IFN-γ、IL-17及IL-10蛋白表达水平,HE染色观察肝组织结构,根据Banff方案进行RAI评分,各组剩余大鼠观察术后生存率.处理组术后检测IFN-γ、IL-17及IL-10 mRNA以及蛋白表达水平,HE染色观察肝组织结构.结果 在未处理组中,与B、C组比较,A组各时间点肝功能指标ALT、AST明显下降(P＜0.05),A组血清表达IFN-γ、IL-10明显受到抑制(P＜0.05),IL-10的表达水平则呈明显上升趋势(P＜0.05),与RT-PCR和Western blot结果趋势相符合,另外A组CD86蛋白表明显下降(P＜0.05),而表达CD206上升(P＜0.05),T-bet/RORγt mRNA相对表达量也明显下降(P＜0.05),B、C组上述指标与A组对比则呈相反趋势,而且B、C组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05);A组RAI评分(3.83 ±0.14),明显低于B、C组RAI评分(9.13±0.20)、(8.95±0.26) (P ＜0.05),并且A组大鼠的生存时间明显高于B、C组大鼠(P＜0.05).在处理组中,D、E和F组肝脏局部IFN-γ、IL-17、IL-10 mRNA和蛋白表达情况以及病理组织AcR程度比较无统计学上的差异(P＞0.05).结论 阻断IRE1-XBP1通路促进了KCs的M1型极化,引起Th1/Th17向Th2/Treg的免疫偏移,在一定程度上减轻了移植肝脏急性排斥反应的程度.     

外周血及肝组织T细胞亚群、NK细胞在慢性乙型肝炎不同转归中的变化及其意义

目的探讨外周血及肝组织T淋巴细胞亚群、自然杀伤细胞（natural killer cells,NK细胞）在慢性乙型肝炎不同临床转归中的变化及其意义。方法慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者34例;HBV相关肝衰竭患者54例,其中,慢性肝功能衰竭（chronicliverfailure,CLF）31例,慢加急性肝功能衰竭（acute-on-chronic liver failure,ACLF）23例。10例CHB患者经肝脏活检、5例ACLF患者行肝脏移植获得肝组织标本。流式细胞仪检测外周血CD4＋CD25＋FOXP3＋调节性T细胞（regulatory T cells,Treg细胞）、CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴细胞亚群,免疫组织化学观察肝组织中CD8＋T细胞、NK细胞频率。结果 ACLF患者外周血Treg细胞频率（4.79%±2.58%）明显高于CLF患者（3.24%±2.22%）及CHB患者（3.46±1.78%,P〈0.05）;CLF患者Treg细胞频率低于CHB患者,但无显著性差异。动态观察发现,CLF患者Treg细胞频率持续低水平;而ACLF患者Treg细胞频率先升高,随着肝功能恢复,Treg细胞频率下降。CLF患者外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴细胞计数分别为939.2±466.2、544.1±300.9、391.8±240.6,明显低于CHB患者（1567.4±556.6、864.2±289.4、563.3±315.1）及ACLF患者（1596.1±1151.6、923.1±701.5、576.8±392.2,P〈0.01）。ACLF患者外周血T淋巴细胞亚群计数与CHB患者比较无显著性差异。免疫组化显示,ACLF患者肝组织CD8＋T细胞、NK细胞浸润较CHB患者明显增加。结论 CLF患者存在严重的T淋巴细胞＂耗竭＂。外周血Treg细胞在ACLF发生机制中可能具有重要的免疫调节作用。肝组织CD8＋、NK细胞浸润增加与慢性乙型肝炎肝脏病理恶化有关。     

自身免疫性肝炎患者血NK细胞频率及表型特征分析

目的探讨自身免疫性肝炎（AIH）中NK细胞在外周血中频率及表型特点。方法选择15例自身免疫性肝炎患者,采集入选对象外周抗凝血5ml,分离外周血单核细胞（PBMC）,进行CD56-PE、CD3-APC、CD16-FITC、HLA-DR-PERCP单克隆抗体4色染色,采用流式细胞技术进行检测。结果 AIH组与正常对照组NK细胞中CD56bright比例分别为19.42%±7.36%,6.06%±2.63%,AIH组显著高于正常对照组（P〈0.001）。AIH组与正常对照组,CD56bright细胞群中活化指标HLA-DR＋比例分别为6.13%±5.67%和2.10%±1.24%,AIH组显著高于对照组（P=0.017）。对CD56bright表达频率与自身免疫性肝炎患者肝功生化指标之间进行相关性分析,尚未发现两者之间的相关关系。结论 AIH患者外周血中CD56bright及其中活化细胞的比例均有增高,提示NK细胞可能通过活化的CD56bright分泌细胞因子途径在发病过程中发挥作用。     

Evaluation of peripheral blood NK cell subsets and cytokines in unexplained recurrent miscarriage

Background

Recurrent miscarriage is considered as one of the main problems in women's reproductive health. The aim of the present study was to evaluate the natural killer cells (NK cells) and cytokines in unexplained recurrent miscarriage and fertile women.