HIV NL4-3病毒株非感染性细胞-细胞融合模型的构建

目的 构建一种基于HIV实验室株NL4-3包膜蛋白env的非感染性、可视化细胞-细胞融合模型,用于检测HIV-1进入抑制剂的抑制活性。方法构建可同时表达HIV NL4-3 env及GFP的真核表达质粒pAAV-IRES-GFP-NL4-3,瞬时转染293T细胞,使293T细胞同时表达2种蛋白(293T/NL4-3/GFP)后,与靶细胞TZM-b1细胞共同培养,观察细胞融合情况及合胞体的形成。同时,在该模型上测试HIV进入抑制剂C34和T1144的抑制活性。结果 293T/NL4-3/GFP和TZM-b1细胞混合2 h后,可在荧光显微镜下发生明显融合;24 h后可形成大面积融合。HIV-1进入抑制剂C34、T1144能够抑制细胞融合,其半抑制浓度(IC50)分别为(72±6.24)nmol/L和(15±6.94)nmol/L。结论 成功构建了一种可在普通实验室完成的,可视化且无感染性的HIV-1进入抑制剂药物检测筛选模型。     

HIV-1临床株SC42无感染性细胞-细胞融合模型的构建

目的 构建一种无感染性、可视化,用于检测HIV-1进入抑制剂在临床株SC42上的抑制活性的HIV细胞-细胞融合模型。方法 将HIV-1 SC42 env基因插入质粒pAAV-IRES-EGFP,获得可同时且分别表达HIV-1 SC42 env及GFP的真核表达质粒,经过转染293T细胞,使之同时表达这两种蛋白(293T/SC42/EGFP),作为模拟HIV病毒的效应细胞与靶细胞TZM-b1共同培养,观察细胞融合情况及合胞体的形成。使用经典HIV-1进入抑制剂C34和T1144检测该细胞融合模型的效果。结果 效应细胞293T/SC42/EGFP和靶细胞TZM-b1细胞混合2 h后,在荧光显微镜下可见明显的细胞融合现象;24 h后可形成合胞体。HIV-1进入抑制剂C34、T1144能够抑制细胞融合,其IC₅₀分别为(600±6.22) nmol/L和(44±5.88) nmol/L。结论 成功构建了HIV-1进入抑制剂药物检测筛选模型。该模型的构建无需在P3生物安全实验室完成,操作简单、方便且无感染性。     

HIV-1临床株SC42无感染性细胞-细胞融合模型的构建北大核心CSCD

目的构建一种无感染性、可视化,用于检测HIV-1进入抑制剂在临床株SC42上的抑制活性的HIV细胞-细胞融合模型。方法将HIV-1 SC42 env基因插入质粒pAAV-IRES-EGFP,获得可同时且分别表达HIV-1 SC42 env及GFP的真核表达质粒,经过转染293T细胞,使之同时表达这两种蛋白(293T/SC42/EGFP),作为模拟HIV病毒的效应细胞与靶细胞TZM-b1共同培养,观察细胞融合情况及合胞体的形成。使用经典HIV-1进入抑制剂C34和T1144检测该细胞融合模型的效果。结果效应细胞293T/SC42/EGFP和靶细胞TZM-b1细胞混合2 h后,在荧光显微镜下可见明显的细胞融合现象;24 h后可形成合胞体。HIV-1进入抑制剂C34、T1144能够抑制细胞融合,其IC分别为(600±6.22)nmol/L和(44±5.88)nmol/L。结论成功构建了HIV-1进入抑制剂药物检测筛选模型。该模型的构建无需在P3生物安全实验室完成,操作简单、方便且无感染性。     

戊型肝炎病毒与ING5相互作用的研究

目的 构建ING5基因真核表达载体和ING5荧光素酶载体,将pMIR-Report-ING5荧光素酶质粒与PUC-HEV质粒共转染293T细胞后,验证HEV与ING5之间相互关系。方法 通过提取293T细胞总RNA,RT-PCR法扩增ING5基因序列,并克隆到真核表达载体PGC3.1 (+)上。利用脂质体转染法将PGC-ING5真核表达质粒转染HepG2细胞后,通过 Western Blot法检测ING5表达情况;将pMIR-Report-ING5荧光素酶质粒和PUC-HEV质粒共转染293T细胞进一步探究ING5与HEV之间相互作用关系。结果 经双酶切和测序鉴定真核表达质粒PGC-ING5构建成功,ING5基因在HepG2细胞中成功表达;将pMIR-Report-ING5荧光素酶质粒与PUC-HEV质粒共转染293T细胞后,发现HEV明显抑制239T细胞中pMIR-Report-ING5荧光素酶的活性。结论 成功构建了PGC-ING5真核表达载体和pMIR-Report-ING5荧光素酶载体,并且证明HEV与ING5之间具有相互作用。     

载体法筛选人巨细胞病毒截短UL54基因小干扰RNA靶位体系的建立

目的 建立载体法筛选人巨细胞病毒(HCMV)截短UL54基因(UL54S)小干扰RNA(siRNA)靶位的体系.方法 利用质粒pAVU6+27设计并构建2个小发夹RNA(shRNA)表达载体(psiUL54-1和psiUL54-2),与融合蛋白表达载体pUL54S-绿色荧光蛋白(EGFP)共转染AD293细胞.荧光显微镜观察融合蛋白荧光表达,RT-PCR法分析UL54S mRNA水平变化,流式细胞仪评价siRNA对融合蛋白的抑制作用,采用方差分析对流式细胞检测结果进行统计分析,筛选出有效的siRNA作用靶位.结果 shRNA表达载体psiUL54-2与融合蛋白表达载体pUL54S-EGFP共转染AD293细胞48 h后,pUL54S-EGFP、psiUL54-2共转染组EGFP表达量较pUL54S-EGFP、pAVU6+27共转染组下降;凝胶分析显示,psiUL54-2与pUL54S-EGFP共转染48 h后,UL54SmRNA相对表达量为19.6,明显低于pUL54S-EGFP、psiUL54-1共转染组的96.6与对照组的100.0;psiUL54-1、pUL54S-EGFP共转染48 h后对融合蛋白UL54S-EGFP表达无影响(P>0.05),但psiUL54-2、pUL54S-EGFP共转染抑制融合蛋白UL54S-EGFP的表达(19.43×104±2.29×104比27.89×104±5.50×104,P<0.01).结论 成功建立载体法筛选HCMV截短UL54S siRNA靶位体系,UL54S序列中1532～1550位点是有效的siRNA靶位点.     

共表达HIV-1的gag-gp120与IL-2的pGPIL-2诱导小鼠产生细胞毒性T细胞的研究

目的 研究HIV-1CN融合基因与IL-2基因共表达基因质粒pGPIL-2诱导产生细胞毒性T细胞（CTL）。方法 脂质体介导共表达中国流行株HIV-1gag-gp120基因与IL-2基因的基因疫苗质粒pGPIL-2转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光法鉴定其表达。取pGPIL-2免疫鼠脾细胞,检测pGPIL-2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性。结果 杀伤实验结果证明,经基因免疫获得的 CTL效应细胞,可杀伤 HIV-1CN 融合基因转染的靶细胞。结论 pGPIL-2可有效地诱导 CTL的产生,该研究结果为进一步设计中国流行株HIV-1基因疫苗提供了重要实验依据。     

共表达HIV—1的gag—gp120与IL—2的pGPIL—2诱导小鼠产生细胞毒性T细胞的研究

目的：研究HIV－1CN融合基因与IL－2基因共表达基因质粒pGPIL-2诱导产生细胞毒性T细胞（CTL）。方法：脂质体介导共表达中国流行株HIV－1gag-gp120基因与IL－2基因的基因疫苗质粒pGPIL-2转染BHK－21细胞，以间接免疫荧光法鉴定其表达。取pGPIL-2免疫鼠脾细胞，检测pGPIL-2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性。结果：杀伤实验结果证明，经基因免疫获得的CTL效应细胞，可杀伤HIV－1CN融合基因转染的靶细胞。结果：pGPIL-2可有效地诱导CTL的产生，该研究结果为进一步设计中国流行株HIV-1基因疫苗提供了重要实验依据。     

羊传染性脓疱病毒ORF047基因表达及其蛋白在细胞中的定位分析

目的 克隆羊传染性脓疱病毒(Orf virus, ORFV) ORF047基因,并进行真核表达及亚细胞定位,为筛选与其相互作用的蛋白提供依据。方法 提取羊传染性脓疱病毒分离株的DNA,以其为模板,参照OV-SA00毒株(NC-005336.1)基因ORF047序列,采用PCR 技术扩增ORFV ORF047基因片段,凝胶回收后将其插入pEGFP-N1载体,构建重组质粒pEGFP-ORF047,测序后重组质粒共转染293T细胞,Western blotting 鉴定融合蛋白的表达。后将重组质粒pEGFP-ORF047与pHcRed1-Nuc、pHCRed1-mito、pHcRed1-ER分别共转染Vero-E6细胞,通过激光共聚焦显微镜对融合蛋白进行亚细胞定位分析。结果 ORFV ORF047 基因片段大小为 735 bp;重组质粒pEGFP-ORF047能够在293 T细胞中明显表达融合有目的分子的绿色荧光蛋白,Western blotting检测表达的融合蛋白大小约54 kD;亚细胞定位分析表明,ORF047蛋白主要定位于胞浆中,少量在线粒体中。结论 成功分析了ORF047基因的表达与其蛋白在亚细胞定位。     

BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的 构建BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体及获得稳定表达BHRF1的慢病毒的方法.方法 通过实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法从鼻咽癌组织中扩增获得BHRF1的基因全长CDS序列,并克隆于带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体中,酶切验证测序正确后,将质粒pWPXL-hBHRF1-IR ES-GFP与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,将浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察下293T细胞的绿色荧光表达及转染效率.结果 电泳鉴定与目的基因表达条带完全吻合,测序结果显示扩增得到的BHRF1序列与GenBank公布的参考序列完全一致,双酶切和测序结果证明BHRF1已正确地克隆到慢病毒表达载体中,包装后慢病毒颗粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光表达,转染效率＞90％.结论 成功构建了BHRF1与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究BHRF1基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

SARS-CoV-2结构蛋白S和N的生物信息学比较分析及应用研究

目的 采用生物信息学方法分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重要结构蛋白S和N。将S基因和N基因融合并构建重组质粒,重组质粒与骨架质粒在293T细胞中包装后获得重组腺病毒,为利用其融合基因进行疫苗研发提供理论和实验依据。方法 从NCBI数据库中获取S、N蛋白的基因组序列和氨基酸序列,采用生物信息学分析工具SOPMA、IEDB、BLAST、Immunomedicine Group、UniProt预测并分析S和N蛋白的理化性质、二级结构和三级结构、B细胞表位和T细胞表位、抗原决定簇以及相互作用蛋白。分别以S-pcDNA和N-pcDNA质粒为模板,以S-F1、S-F2和N-F3、和N-F4为引物PCR扩增目的基因;通过T4 DNA连接酶连接获得S基因和N基因的融合基因,以连接后的融合基因为模板,以S-F1和N-F4为引物采用重叠PCR扩增融合基因S-N。将融合基因S-N与穿梭表达载体pDC316-mCMV-EGFP连接,获得重组质粒,然后与骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293T细胞,获得重组腺病毒。结果 S蛋白由1 269个氨基酸组成,分子式为C_...