DcR3-RNAi-SW480结肠癌稳转细胞模型的建立及方法优化

目的 建立靶向沉默诱骗受体3(decoy rcceptor 3,DcR3)基因表达的DcR3 RNAi-SW480稳转细胞系,并对其条件及方法进行优化.方法 构建靶向沉默DcR3基因的siRNA质粒表达载体,转染SW480细胞,并以G418及流式细胞仪筛选稳转细胞.实验分为3组:DcR3-RNAi稳转组、阴性对照组、空白对照组.蛋白质印记法(Western-blot)检测DcR3蛋白沉默情况.分别应用琼脂糖凝胶电泳、甲基噻唑基四唑(MTT)比色法、流式细胞术等方法对脂质体与质粒的比例、G418的筛选浓度、筛选的最佳方式等进行优化.结果 DcR3-RNAi稳转细胞组DcR3表达水平较对照组明显降低;在本实验室条件下,脂质体(μl)与DcR3-siRNA质粒(μg)最佳比例为3.5∶1;G418筛选浓度为800 mg/L;G418联合流式细胞仪双筛的稳转细胞比例明显高于仅用G418单筛.结论 成功建立特异性沉默DcR3基因表达的稳转DcR3-RNAi-SW480细胞系;G418联合流式是筛选稳转细胞较高效的方法;对转染及筛选的条件及方法进行优化,可提高转染与筛选效率.     

抑制凋亡相关基因PNAS-2表达后U937细胞凋亡率的改变

目的:构建并鉴定凋亡相关基因——PNAS-2的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体,将其转染U937细胞,筛选后检测细胞凋亡的变化。方法:shRNA质粒载体pRNAT U6.1/NEO经限制性内切酶BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,连接带有BamHⅠ及HindⅢ黏性末端的shRNA插入片段,转化感受态细菌,并行测序鉴定。将阳性shRNA质粒载体进行细胞转染,合并使用G418及流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,应用半定量PCR鉴定shRNA封闭效果;用Annexin V-APC/7-AAD标记后,使用FCM及激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡。结果:测序鉴定证实,PNAS-2特异的shRNA质粒表达载体构建正确;合并使用G418及FCM分选出GFP阳性细胞后,半定量PCR鉴定示shRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组对PNAS-2的抑制率分别为78.1%、75.4%及51.4%。FCM显示shRNA对照组的细胞凋亡率为(3.52±1.25)%;而shRNAⅠ组为(9.23±1.88)%(P<0.01);shRNAⅡ(8.85±1.80)%(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察显示,shRNA对照组细胞凋亡率为7.3%;shRNAⅠ组为14.7%;shRNAⅡ为13.8%;shRNAⅢ为10.3%。结论:测序结果表明,本研究成功构建了PNAS-2的shRNA质粒表达载体。半定量PCR显示shRNA抑制PNAS-2表达效果佳;抑制PNAS-2后可促使细胞凋亡,提示该基因是抗细胞凋亡基因。     

骨髓间质干细胞绿色荧光蛋白基因的转染和克隆化研究

目的 建立能稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)并连续传代培养的骨髓间质干细胞(MSCs)株。方法 采用电穿孔法将带有GFP的质粒(pGFP-N1)在不同条件下转染MSCs,经过G418筛选,有限稀释法筛选阳性克隆,荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达情况。结果 电穿孔以电容量1050μF、电压260V时效果最好,转染GFP的MSCs能在含有G418的培养基中生长,未转染的骨髓间质干细胞不断死亡。转染24h后即能观察到少量荧光细胞,一个月后大部分荧光细胞呈集落样生长,荧光表达较强,转染率为50％-60％。体外克隆后,能稳定表达至10代,10代后荧光强度明显减弱。结论 GFP基因能在MSCs中进行有效的复制、转录和翻译,并可持续、稳定、高效表达;转染GFP的MSCs能作为研究MSCs的诱导分化及生物细胞工程治疗的载体细胞。     

利用增强型绿色荧光蛋白体外表达探讨逆转录病毒转染软骨细胞的最佳条件

背景:增强型绿色荧光蛋白是目前最佳标记分子,具有荧光特异性高、易于检测等独特的优势,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染同种异体软骨细胞值得研究。目的:构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,探讨转染同种异体软骨细胞的最佳条件。设计:随机对照观察。单位:上海交通大学。材料:选用30只出生1周的新西兰白兔,雌雄不限,均购自中国科学院实验动物研究中心。双嗜性逆转录病毒包装细胞系PT67购自Clontech公司;小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞购自ATCC公司;DH5a大肠杆菌由本实验室保存;逆转录病毒载体pLNCX2购自Clontech公司;带有增强型绿色荧光蛋白的pEGFP-C1质粒由中科院细胞所丛笑倩教授惠赠。方法:实验于2005-08在上海交通大学完成。分离提取并培养新西兰白兔软骨细胞,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染培养后的新西兰白兔软骨细胞,荧光显微镜观察转染的效果。于直径10cm的平皿接种6×105个软骨细胞,分别立即转染及接种12,24,48h后转染逆转录病毒-EGFP,1周后作流式细胞仪测定EGFP表达效率,观察逆转录病毒转染原代软骨细胞最佳时机。软骨酶消化后的软骨细胞接种24h后转染逆转录病毒,分别于第2,3,4,5,6天加250mg/LG418进行筛选。PBS洗涤后作流式细胞仪检测其效率,观察G418筛选的最佳时机。主要观察指标:①EGFP-pLNCX2转染效果。②逆转录病毒转染原代软骨细胞及G418筛选最佳时机。结果:①重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2转染原代兔软骨细胞,经G418初步筛选而获得的高表达格局,可见软骨细胞经过筛选和表达绿色荧光蛋白后,保持正常的形态学,细胞伸出伪足贴壁,基质分泌旺盛。②逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,第7天用流式细胞仪测定转染效率为19.14%,G418筛选的最佳时机为培养后第5天,第7天测定表达效率提升为55.75%。结论:重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2能有效地转染软骨细胞,逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,G418筛选的最佳时机为培养后第5天。     

利用基因芯片分析RNA干扰PNAS-2后凋亡相关基因表达的变化

目的:采用基因芯片技术,比较RNA干扰法封闭U937细胞中PNAS-2基因前后,与凋亡有关基因的变化情况,从而了解PNAS-2在凋亡通路中的可能定位。方法:将急性单核细胞白血病细胞株U937分别转染已构建的靶向封闭PNAS-2的干扰质粒组和对照质粒组,合并使用流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,并运用半定量PCR及实时PCR方法验证RNAi效果。采用affymetrix u133A 2.0基因芯片技术比较2组细胞间基因表达的差异。进一步通过半定量RT-PCR对其中的2条上调基因(IER3、CCL2)和6条下调基因(CASP8、CD74、VEGF、DNASE2、PRTN3、TERT)的表达情况进行验证。结果:半定量及实时PCR检测结果表明,合并使用G418及FCM筛选后得到的转染细胞在90%以上,干扰质粒组对PNAS-2的抑制率达到70%以上;基因芯片筛选结果提示共有1651条出现上调,1404条出现下调。其中比值≥2倍的基因共有336条,上调114条,下调222条。根据功能分类初步筛选出与凋亡相关基因共22条,上调基因11条,下调基因11条。RT-PCR检测证实基因芯片结果可靠。结论:抑制PNAS-2表达后促进U937细胞凋亡的机制可能与c-Jun过表达、JNK通路的激活及VEGF基因下调有关。     

增强型绿色荧光蛋白转染猪骨髓间充质干细胞特性观察

目的：借助质粒将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染猪骨髓干细胞（MSC）,观察转染后EGPP在（MSC）内表达情况及MSC生长特性。方法：1月龄小型香猪为MSC供体,EGFP基因转染MSC,计算转染效率,流式细胞仪鉴定G418筛选后EGFP基因稳定表达率和转染后细胞增殖周期改变。结果：转染率为（36．9±3．4）％;G418筛选后EGFP表达率75．6％,EGFP转染MSCG0／G1期MSC比例较对照组明显增加（P〈0．01）,S＋G2／M期MSC比例减少（P〈0．01）。结论：猪MSC经基因转染和G418筛选,获得EGFP稳定表达;转染和G418筛选后MSC增殖能力降低,G0／G1期MSC比例增加,S＋G2／M期MSC比例下降。     

稳定表达hermap及hermap-siRNA的K562细胞系的建立

本研究分别建立可稳定表达hermap和hermap-siRNA的K562细胞系。双酶切hermap的PCR扩增产物并与pEGFP-c1载体连接形成重组质粒;双酶切hermap-siRNA序列并与pRNAT载体连接形成重组质粒;使用电穿孔转染法将上述两质粒分别转染K562细胞,通过G418筛选建立可分别稳定表达hermap和hermap-siRNA的K562细胞系。结果显示,hermap-pEGFP-c1质粒及hermap-siRNA-pRNAT质粒转染K562细胞的效率分别为10.0%和9.3%;两种K562细胞系通过G418筛选均能稳定生长并表达目的基因。结论:成功构建了含hermap和hermap-siRNA的真核表达质粒,建立了稳定表达hermap和hermap-siRNA的K562细胞系,这为进一步研究HERMAP在红细胞分化发育过程中的作用奠定了基础。     

p21WAF1/GIP1基因转染人宫颈癌Hela细胞对顺铂敏感性的影响

目的 探讨转染p21^WAF1／GIP1基因（p21基因），对宫颈癌Hela细胞生长抑制作用及p21基因转染Hela细胞对顺铂敏感性的影响。方法 应用脂质体转染技术，将质粒peDNA3转入人宫颈癌Hela细胞中，经G418筛选，转染阳性克隆细胞连续传代培养，并采用中性红摄入法测定顺铂对p21基因转染人宫颈癌Hela细胞增殖抑制作用，流式细胞仪（FCM）检测细胞周期变化。结果 经G418筛选，Hela细胞全部死亡，转染质粒peDNA3的Hela细胞存活，并可连续传代。p21基因转染后，细胞生长明显受到抑制，细胞周期停滞于G1期，与对照组相比，细胞周期G1期比例明显增加。同时p2l表达阳性的Hela细胞对顺铂敏感性增强。结论 p2l基因转染能使Hela细胞出现生长抑制并对顺铂化疗作用敏感性明显增强。     

超声联合声诺维辐照增强GFP基因在鼠胶质瘤C6细胞中的转染

目的 探讨超声联合声诺维微泡辐照对增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)在鼠胶质瘤C6细胞中的转染增效作用及安全性.方法 实验分为4组:单纯质粒组、质粒+微泡组、质粒+超声组和质粒+超声+微泡组.辐照条件为超声频率1 MHz,声强1 W/cm2,辐照时间30 s,占空比20%.按不同实验条件辐照后,应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪评估基因转染效率,台盼蓝染色法评估细胞活力.结果 经超声联合微泡辐照C6细胞后,GFP基因转染效率较其他组显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),且各组均未发现显著的细胞损伤.结论 超声联合声诺维微泡辐照可显著增强GFP基因在鼠胶质瘤C6细胞的转染,为临床胶质瘤基因治疗提供了一种安全,有效的非病毒基因转染方法.     

电穿孔法基因转染K562细胞条件的优化

目的以绿色荧光蛋白(GFP)为观察指标优化K562细胞的电穿孔基因转染条件。方法通过改变悬液体积、温度及缓冲液、质粒浓度等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将质粒DNA转入K562细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察转染效率。结果①在电压250V、电容950μF的条件下.K562细胞得到58.6%的最大转染率。②应用0.4mL细胞悬液体积,当质粒浓度≥20μg/mL时可得到较高的转染效率。③温度和缓冲液中的血清成分对电穿孔效率影响不大。结论电穿孔是一种高效的基因转染法,通过优化条件,可提高转染率。     

AML1-ETO 真核表达载体的构建及对 U937细胞增殖和分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-AML1-ETO真核表达载体,并观察AML1-ETO融合蛋白在U937细胞内的表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.方法 以原核表达载体pCMV5-AML1-ETO为模板扩增AML1-ETO目的 片段,将该基因重组于pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表达载体上,用脂质体转染技术将其导入 U937细胞,经G418筛选获得稳定转染的克隆,PCR检测AML1-ETO基因的整合,RT-PCR及 Western blot检测AML1-ETO mRNA和蛋白的表达,用锥虫蓝拒染人工计数法观察细胞增殖活性,流式细胞术检测髓系分化抗原表达的变化,瑞特染色法观察细胞形态改变.结果 pcDNA3.1-AML1-ETO经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,筛选出AML1-ETO基因高表达的亚克隆,证实AML1-ETO基因稳定转染到U937细胞中并得到表达;转染细胞增殖受抑(P<0.05),髓系分化抗原CD11b表达阳性率[(4.17±0.31)%]低于转染空载体和未转染对照组[(11.40±0.17)%、(11.03±0.15)%](P<0.001),形态呈低分化表现.转染细胞经TPA处理后,CD11b表达无明显变化(P>0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-AML1-ETO表达载体,并在真核细胞中得到了正确表达,AML1-ETO 基因能抑制U937细胞的增殖与分化,为进一步研究该基因致白血病的机制奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a pcDNA3. 1 -AML1-ETO expression vector and investigate its effects on proliferation and differentiation of U937 leukemic cells. Methods AML1 -ETO gene was amplified by PCR from pCMV5-AML1-ETO and inserted into eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1/V5-His-TOPO. The recombinant plasmid was transfected into U937 cells by Lipofectamin 2000. Individual clones selected with G418 were isolated. The integration and the expression levels of AML1-ETO in transfectants were determined by PCR, RT-PCR and Western blot analysis respectively. Trypan blue refusal staining method was used to detect the proliferation of U937 cells. Light microscope was applied to observe the morphologic changes of the cell. The expression of myeloid cell differentiation antigen was detected using flow cytometry. Results The recombinant pcDNA3. 1-AML1-ETO was confirmed by enzyme digestion and sequencing. The highly expressing AML1-ETO subclone was established. AML1-ETO was expressed in U937 cells transfected with pcDNA3.1 -AML1-ETO. The growth of the monoclonal cells was inhibited evidently (P < 0. 05). The expression of CD11b in transfected group [(4. 17±0. 31)%] was lower than that in empty plasmid transfected group and non-transfected group [(11.40 ± 0. 17)% and (11.03 ± 0. 15) %] respectively (P < 0.001). Transfected cells displayed morphology of less differentiation. The expression level of CD11b was unchanged in transfected cells treated with TPA (P > 0. 05). Conclusion The eukaryotic expression vector for AML1ETO gene was successfully constructed and expressed in U937. AML1-ETO inhibits the proliferation and differentiation of transfected cells. It provides the basis for further study of mechanisms of AML1 -ETO in leukemogenesis.     

稳定表达外源RbAp46基因的U937白血病细胞株的建立和初步特性分析

为建立RbAp46基因稳定转染的白血病细胞株，对悬浮培养的白血病细胞的电穿孔条件进行优化之后，运用电穿孔介导的转基因技术，在低电压、高电容的条件下将含RbAp46基因cDNA的表达质粒转染白血病细胞系U937，经G418筛选获得稳定转染的克隆，用PCR检测RbAp46基因的整合，用Western blot分析蛋白质的表达水平，然后筛选出表达外源RbAp46蛋白水平最高的亚克隆。用台盼蓝拒染法判定细胞活力，用细胞计数判定细胞生长速率。结果发现，转染RbAp46基因的U937细胞的生长速率比对照组低50％左右。结论：在白血病细胞系U937中建立了稳定表达外源RbAp46基因的细胞株，并发现过表达的外源RbAp46基因能抑制U937细胞的增殖。     

尿激酶受体基因反义RNA转移体系的建立及其在白血病研究中的应用

尿激酶受体 (uPAR)表达与肿瘤 /白血病细胞的侵袭与转移能力明显相关。为探讨逆转录病毒载体介导的uPAR基因反义RNA转移体系在抑制白血病细胞表达uPAR中的价值 ,构建了表达反义uPAR基因的逆转录病毒载体LaCD87SN ,用脂质体转染 交互感染策略建立uPAR基因反义RNA转移体系 ,并以双嗜型aCD87病毒转导U937白血病细胞 ;用PCR分析反义uPAR基因的整合和表达 ;用流式细胞术和明胶酶谱分别检测白血病细胞CD87表达和基质金属蛋白酶 (MMP)活性。结果显示 :通过转染 交互感染获得上清中病毒滴度为 6 .3× 10 5cfu/ml的双嗜型病毒产生细胞Am12 /aCD87;aCD87病毒感染的U937/aCD87细胞内存在aCD87原病毒的整合 ,并高水平表达uPAR基因反义RNA。此外 ,与载体对照的U937/NeoR细胞相比 ,U937/aCD87细胞表面CD87分子表达并无明显降低 ,但其分泌MMP 9的能力显著下降。结论 :逆转录病毒载体介导的反义RNA转移不能有效地下调白血病细胞表面uPAR表达 ,但可能干扰CD87分子与MMP的相互作用。     

具G418抗性NIH3T3细胞饲养层的制备

背景:建立具有抗药(新霉素或潮霉素)性的饲养层细胞是转染外源目的基因胚胎干细胞阳性克隆的筛选必备条件。建成的具有抗药性的NIH3T3细胞系可用于胚胎干细胞其他目的基因的筛选。目的:建立具有G418抗性的NIH3T3细胞系,用于转染pTet-on基因的胚胎干细胞阳性细胞克隆筛选的饲养层。设计:细胞培养观察及DNA检测。单位:中国医科大学实验动物部。材料:NIH3T3细胞由中国医科大学细胞生物教研室惠赠,pWL/neo质粒为美国哈佛大学医学院金壮教授惠赠。G418、白血病抑制因子(胚胎干细胞GRO106U/mL)、DMEM为GIBCOBRL产品,丝裂霉素-C、DIG标记及检测试剂盒为Roche产品,脂质体为Invitrogen产品,均购自沈阳联星生物技术有限公司。方法:①通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入NIH3T3细胞中。②将细胞传至25mL培养瓶中,加入梯度浓度的G418继续培养,通过观察细胞生长及死亡情况测定G418对NIH3T3细胞最小致死量。③将转染的细胞进行传代,挑取单个细胞的克隆至24孔培养板继续进行筛选扩增,选用正常的NIH3T3细胞加入相同剂量的G418的选择性培养基作为筛选的阴性对照。④采用较低的细胞密度铺板,加入含最小致死量G418的DMEM培养基进行再次筛选;同时选用正常的NIH3T3细胞为对照,使用含有最小致死量G418及未加G418的DMEM培养基进行培养,采用光学显微镜对G418抗性NIH3T3细胞进行观察。⑤选用具有G418抗性的NIH3T3细胞和小鼠胚胎成纤维细胞分别作为饲养层细胞进行传代,采用光学显微镜对培养后胚胎干细胞-D3细胞进行观察,并制备细胞DNA,对其进行PCR和southernblot鉴定。主要观察指标:①G418对NIH3T3细胞最小致死量的测定结果。②G418抗性NIH3T3细胞的筛选结果。③G418抗性NIH3T3细胞的生长观察结果。④胚胎干细胞-D3细胞生长观察结果及G418抗性NIH3T3细胞的鉴定。结果:①G418对NIH3T3细胞最小致死量为500mg/L。②经过500mg/LG418压力筛选后,获得了抗G418细胞克隆。③抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异。④饲养层培养的胚胎干细胞呈集落形状生长,边缘光滑,保持未分化的状态。用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗性NIH3T3细胞中。结论:成功地培育了G418抗性NIH3T3细胞,生长在G418抗性NIH3T3细胞饲养层上胚胎干细胞细胞基本保持正常胚胎干细胞细胞特征。     

靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系,G418（500 mg/L）有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降（P〈0.05）。结论：成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。     

Toll样受体在U937细胞的表达及其作用研究

本研究探讨急性髓系白血病的免疫治疗中以Toll样受体（TLRs）为靶点的可能性,研究人急性髓系白血病U937细胞TLR的表达及TLR8受体激动剂ssRNA40/LyoVec对其增殖、凋亡和细胞周期的影响。运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测U937细胞TLR1-9mRNA的表达,用流式细胞术检测TLR8的表达。用不同浓度的TLR8激动剂ssRNA40/LyoVec作用于体外培养的U937细胞后,采用CCK-8法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果表明：U937细胞表达TLR1-9,TLR8激动剂ssRNA40/LyoVec作用于U937细胞明显地抑制了U937细胞生长,抑制率可达70%,且呈明显的量效关系;作用后处于G0/G1期细胞比例由（44.67±1.05）%增高到（54.08±1.19）%,但凋亡细胞的比例无明显变化。结论：TLR1-9可在U937细胞中表达,TLR8激动剂ssRNA40/LyoVec具有抗肿瘤细胞增殖的作用,使细胞阻滞在G0/G1期,但无明显的促凋亡作用。     

表达红色荧光蛋白的小鼠淋巴瘤EIA细胞株的建立及鉴定

本研究通过慢病毒载体将红色荧光蛋白（DsRed）导入小鼠淋巴瘤EL4细胞,建立稳定高表达DsRed的EL4／DsRed细胞株,为建立携带红色荧光标记的小鼠肿瘤模型奠定基础。构建含新霉素耐药基因（neo）、内部核糖体进入位点序列（IRES）及DsRed的双顺反子自身失活型慢病毒载体。采用脂质体转染法将慢病毒三质粒包装系统共转染人胚肾细胞系293FT包装细胞,收集病毒上清,感染EL4细胞;利用G418的药物选择特性筛选感染细胞获得稳定表达DsRed的EL4细胞株,并扩大培养。结果表明：成功构建慢病毒表达质粒pXZ208-neo-IRES-DsRed,包装的重组慢病毒滴度可迭10^6U／ml。病毒感染EL4细胞,经终浓度为600μg／ml的G418成功筛选出稳定携带DsRed的EL4／DsRed细胞株;荧光显微镜观察及流式细胞仪检测证实该细胞株长期稳定高表达DsRed。结论：通过表达DsRed的慢病毒载体感染ELA细胞,获得了稳定高表达DsRed的EL4／DsRed细胞株。     

WISp39基因对U937细胞增殖、凋亡和周期的影响

为了探讨一种新发现的p21调控蛋白WISp39对白血病细胞的增殖、凋亡和周期的影响,构建了WISp39的真核表达质粒pLenti6/V5-WISp39,并导入了人髓系白血病细胞系U937细胞,转染后用定量PCR检测了WISp39表达的变化,用CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术（FACS）检测细胞凋亡和周期的变化。结果显示：pLen-ti6/V5-WISp39转染48小时后,实验组中WISp39mRNA表达上升了（5.5±1.2）倍,同时U937细胞的增殖明显受到抑制,抑制率为37.6%;进一步的分析表明,在实验时间内,WISp39表达的升高不能明显诱导U937细胞的凋亡,但G0/G1期细胞比例由（40.59±0.7）%上升到（49.79±1.1）%。结论：WISp39对于U937无明显的诱导凋亡作用,但通过对细胞周期的影响,使停滞在G/G期的细胞增多,从而抑制了U937增殖。